一種蘿蔔與大頭菜屬間遠緣雜交獲得離體胚的方法
2023-10-23 11:56:17
專利名稱：一種蘿蔔與大頭菜屬間遠緣雜交獲得離體胚的方法
技術領域：
本發明為植物組織培養快速繁殖領域，具體涉及一種蘿蔔與大頭菜屬間遠緣雜交獲得離體胚的方法。
背景技術：
蘿蔔(Raphanus sativus L.)是我國栽培的主要蔬菜作物之一，十字花科、蘿蔔屬，一、二年生草本植物。原產我國，各地均有栽培，品種極多，常見有白皮蘿蔔、紅皮蘿蔔、 青皮蘿蔔等。根供食用，鮮食生食均可，種子含油42%，可用於制肥皂或作潤滑油。種子、 鮮根、葉均可入藥，功能下氣消積，生蘿蔔含澱粉酶，能助消化。大頭菜(Brassica juncea Coss. var. napiformmis Palet. Bols)是芥菜的一個變種，為根用芥菜，是十字花科、蕓薹屬的二年生草本植物。其產品器官為肉質根，質地緊密，水份少，纖維多，形狀為錐型，肉白色， 肉質堅實，有強烈的芥辣味，具有宜肺豁痰、開胃理氣的作用。芥菜含有豐富的維生素和大量的微量元素、糖類、蛋白質等，供食部分為肥大的肉質根。蘿蔔和大頭菜均為根用蔬菜，但兩者的風味不同。由於十字花科植物之間進行屬間、種間的雜交，往往表現為胚珠的不育。在莢果長到一定程度以後就會黃化，也就是雜種胚胎已經開始敗育。造成胚胎敗育的原因可能有多種，但從目前有關的研究成果看，這些原因大致可歸納為七類胚囊發育異常、胚乳發育異常、幼胚起源、營養供應失調、內源激素、酚類物質、某些酶活及基因調控等方面，歸納起來它們大多有一個共同的特徵，這些胚較之親本產生了幅度過大的變異，這些變異導致變異胚要麼自身生長不諧調而死亡、要麼自身和親本不諧調而死亡。至於蘿蔔和大頭菜雜種胚敗育的原因還有待進一步研究。關於蕓薹屬植物與蘿蔔之間遠緣雜交不親和性的障礙的研究報導很少原因尚不清楚，需要進一步的研究。到目前為止，還沒有見兩者遠緣雜交研究方面的報導。為此，本發明對兩者進行屬間雜交，初步研究雜交親和性的表現，以及對雜種胚搶救培養方法進行探討。
發明內容
本發明提供一種蘿蔔與大頭菜屬間遠緣雜交獲得離體胚的方法，獲得蘿蔔與大頭菜屬間遠緣雜交離體胚，獲得雜種胚幼苗，以利於得到育種新資源。本發明採用的技術方案是一種蘿蔔與大頭菜屬間遠緣雜交獲得離體胚的方法，其特徵在於按以下步驟依次組成(1)材料準備以蘿蔔雄性不育為母本，以大頭菜作為父本；(2)播種大頭菜和蘿蔔種子播種在試驗大棚裡，對其進行常規田間管理；(3)套袋、掛牌蘿蔔和大頭菜抽薹後套袋，如果套袋之前已有開放的花，要將花摘掉。蘿蔔雄性不育系每個單株單獨套袋，掛牌編號標記，共10個單株，所有的數據取10 個單株的平均值，大頭菜不分單株，混合給蘿蔔授粉；
(4)授粉套袋以後，蘿蔔與大頭菜開花時，進行人工授粉。授粉一般在早上十點和下午三點進行，效果最佳；授粉的方法1)在授粉之前首先用水將手洗乾淨，然後再用酒精消毒；2)打開紗網袋，摘下已經盛開的大頭菜的花朵，摘完以後立即將紗袋封好；3)再打開蘿蔔植株的紗網袋，將大頭菜的花粉授到蘿蔔的柱頭上；(5)胚胎搶救1)在試驗田取授粉以後的莢果，取授粉後第3 9天的莢果，用小刀把果柄去掉；2)將莢果先用無菌水衝洗一遍，然後用70%的酒精消毒30秒，再用0. 1% 升汞消毒8-10分鐘，最後用無菌水清洗3遍，每遍清洗3分鐘；3)將消毒好的莢果放到已經滅菌的帶有濾紙的培養皿中，把莢果上的水分吸乾，然後小心的用小刀把胚珠從莢果裡剝出來，接種到裝有生芽培養基的培養皿上，操作時要注意無菌、以免汙染，一個培養皿上接種4-5個胚珠；4)接種完以後用封口膜把培養皿封好，放到培養箱中培養，培養條件是 25°C，光照16h. d-1，光照強度20001x，培養30-60天；觀察胚珠在培養基上的生長情況，做好記載；5)胚胎搶救期間，觀察統計如下數據測量莢長、莢的橫徑、統計結莢率和觀察並統計雜種胚珠培養的出苗率，通過胚珠培養的結果確定蘿蔔與大頭菜遠緣雜交胚搶救的最佳時期。步驟(4)中為了增加花粉與柱頭的親和性，採用的是重複授粉法連續授粉7天， 並注意觀察花粉與柱頭的親和性。步驟(5)中雜交後的初期結莢率在64%_88%之間，橫徑第7天停止生長，莢長第 8天停止增加，授粉以後第7天開始敗育，在雜種胚發育後5至8天期間進行胚搶救為最佳時期。所述的生芽培養基配方為1/2MS+1. Omg/L 6-BA+O. 2mg/L ΝΑΑ+0. 5%活性炭，所述的生根培養基配方為1/2MS+0. 2mg/L 6-BA+l. 0mg/LNAA+0. 5%活性炭進行離體培養。本發明取得了以下有益效果(1)採用的是重複授粉法提高了花粉與柱頭的親和性；(2)授粉以後莢果便開始生長，雜交後的初期結莢率在64%-88%之間，到第8天莢長停止增加，而橫徑第7天停止生長，授粉以後第7天開始敗育，而且越往後敗育得越快；(3)確定蘿蔔與大頭菜遠緣雜交胚搶救的最佳時期在雜交莢發育到5至8天；(4)採用本試驗所提到的生芽和生根培養基能培育出成功的試管苗有利於種資資源的創新。
具體實施例方式下面對本發明作一詳細說明實施例1材料與方法1. 1供試材料以蘿蔔雄性不育系DH303A為母本(2η = 18)，以大頭菜作為父本(2η = 18)，試驗材料為市售產品，購買於湖北省農業科學院蔬菜科技研究中心。1. 2試驗方法本試驗在湖北省農科院蔬菜科技中心進行。
1. 2. 1 播種大頭菜和蘿蔔種子播種在試驗大棚裡，對其進行常規田間管理。1.2.2套袋、掛牌蘿蔔和大頭菜抽薹後套袋，如果套袋之前已有開放的花，要將花摘掉。蘿蔔雄性不育系每個單株單獨套袋，掛牌編號標記，共10個單株，所有的數據取10個單株的平均值，大頭菜不分單株，混合給蘿蔔授粉。1.2. 3 授粉套袋以後，蘿蔔與大頭菜開花時，進行人工授粉。授粉一般在早上十點和下午三點進行，效果最佳。授粉的方法1)在授粉之前首先用水將手洗乾淨，然後再用酒精消毒。2) 打開紗網袋，摘下已經盛開的大頭菜的花朵，摘完以後立即將紗袋封好。3)再打開蘿蔔植株的紗網袋，將大頭菜的花粉授到蘿蔔的柱頭上。為了增加花粉與柱頭的親和性，我們採用的是重複授粉法。這一方法與肖成漢[3]的方法相一致。肖成漢採用重複授粉(在第一次授粉後的第二天上午再授粉一次)，對克服屬間雜交不親和，提高結籽率效果較好。按以上方法連續授粉7天，並注意觀察花粉與柱頭的親和性。1.2.4胚胎搶救胚胎搶救的常規方法有三種子房培養、胚珠培養、胚培養[4]。本試驗採用的是第二種方法-胚珠培養。具體步驟如下在試驗田取授粉以後的莢果，取授粉後第3 9天的莢果，用小刀把果柄去掉。將莢果先用無菌水衝洗一遍，然後用70%的酒精消毒30秒，再用0. 升汞消毒8-10分鐘， 最後用無菌水清洗3遍，每遍清洗3分鐘。將消毒好的莢果放到已經滅菌的帶有濾紙的培養皿中，把莢果上的水分吸乾，然後小心的用小刀把胚珠從莢果裡剝出來，接種到裝有生芽培養基(表1)的培養皿上，操作時要注意無菌、以免汙染，一般一個培養皿上接種4-5個胚珠。接種完以後用封口膜把培養皿封好，放到培養箱中培養，培養條件是25°C，光照16h. d-1，光照強度20001x，培養30-60天。觀察胚珠在培養基上的生長情況，做好記載。將已經長出的子葉苗轉接到生根培養基(表1)上，獲得試管苗。胚胎搶救期間，觀察統計如下數據(1)測量莢長、莢的橫徑；取莢果之前要對每天授粉以後莢果的發育情況有所記載，測量莢長、莢的橫徑。(2)統計結莢率；(3)觀察並統計雜種胚珠培養的出苗率；通過胚珠培養的結果確定蘿蔔與大頭菜遠緣雜交胚搶救的最佳時期。表1雜種胚珠培養的培養基配方
培養基成分生芽培養基生根培養基
基本培養基1/2MS1/2MS6-BA(mg/L) 1.0 0.2 NAA (mg/L) 0.2 1.0 活性炭(％)_05_0.52.結果與分析2. 1蘿蔔與大頭菜屬間雜交的結莢率
2。
權利要求
1.一種蘿蔔與大頭菜屬間遠緣雜交獲得離體胚的方法，其特徵在於按以下步驟依次組成(1)材料準備以蘿蔔雄性不育為母本，以大頭菜作為父本；(2)播種大頭菜和蘿蔔種子播種在試驗大棚裡，對其進行常規田間管理；(3)套袋、掛牌蘿蔔和大頭菜抽薹後套袋，如果套袋之前已有開放的花，要將花摘掉。 蘿蔔雄性不育系每個單株單獨套袋，掛牌編號標記，共10個單株，所有的數據取10個單株的平均值，大頭菜不分單株，混合給蘿蔔授粉；(4)授粉套袋以後，蘿蔔與大頭菜開花時，進行人工授粉。授粉一般在早上十點和下午三點進行，效果最佳；授粉的方法1)在授粉之前首先用水將手洗乾淨，然後再用酒精消毒；2)打開紗網袋，摘下已經盛開的大頭菜的花朵，摘完以後立即將紗袋封好；幻再打開蘿蔔植株的紗網袋，將大頭菜的花粉授到蘿蔔的柱頭上；(5)胚胎搶救1)在試驗田取授粉以後的莢果，取授粉後第3 9天的莢果，用小刀把果柄去掉；幻將莢果先用無菌水衝洗一遍，然後用70%的酒精消毒30秒，再用0. 升汞消毒8-10分鐘，最後用無菌水清洗3遍，每遍清洗3分鐘；幻將消毒好的莢果放到已經滅菌的帶有濾紙的培養皿中，把莢果上的水分吸乾，然後小心的用小刀把胚珠從莢果裡剝出來， 接種到裝有生芽培養基的培養皿上，操作時要注意無菌、以免汙染，一個培養皿上接種4-5 個胚珠；4)接種完以後用封口膜把培養皿封好，放到培養箱中培養，培養條件是25°C，光照 16h. d-1，光照強度20001x，培養30-60天；觀察胚珠在培養基上的生長情況，做好記載；5) 胚胎搶救期間，觀察統計如下數據測量莢長、莢的橫徑、統計結莢率和觀察並統計雜種胚珠培養的出苗率，通過胚珠培養的結果確定蘿蔔與大頭菜遠緣雜交胚搶救的最佳時期。
2.如權利要求1所述的方法，其特徵在於在步驟中為了增加花粉與柱頭的親和性，採用的是重複授粉法連續授粉7天，並注意觀察花粉與柱頭的親和性。
3.如權利要求1或2所述的方法，其特徵在於步驟(5)中雜交後的初期結莢率在 64% -88%之間，橫徑第7天停止生長，莢長第8天停止增加，授粉以後第7天開始敗育，在雜種胚發育後5至8天期間進行胚搶救為最佳時期。
4.如權利要求1-3之一所述的方法，其特徵在於所述的生芽培養基配方為 1/2MS+1. Omg/L 6-BA+O. 2mg/L ΝΑΑ+0. 5%活性炭，所述的生根培養基配方為 1/2MS+0. 2mg/ L 6-BA+l. Omg/L ΝΑΑ+0. 5%活性炭進行離體培養。
全文摘要
一種蘿蔔與大頭菜屬間遠緣雜交獲得離體胚的方法，其特徵在於按以下步驟依次組成(1)材料準備、(2)播種、(3)套袋、掛牌、(4)授粉、(5)胚胎搶救，採用本發明的方法成功獲得蘿蔔與大頭菜屬間遠緣雜交離體胚，並培養出雜種胚幼苗，以利於得到育種新資源。
文檔編號A01H4/00GK102210260SQ20111006548
公開日2011年10月12日 申請日期2011年3月18日 優先權日2011年3月18日
發明者丁自立, 何雲啟, 崔磊, 張興中, 梅時勇, 梅雪飛, 王晴芳, 甘彩霞, 高翔, 黃來春 申請人:湖北省農業科學院經濟作物研究所