釀造方法
2023-10-31 07:28:32
專利名稱：釀造方法
技術領域：
本申請涉及釀酒方法，其中使用熱穩定性蛋白酶以供控制飲料的膠體穩定性。 所述蛋白酶可從擬諾卡氏菌屬(Nocardiopsis)、芽孢桿菌屬(Bacillus)或熱子囊菌屬 (Thermoascus)獲得。所述蛋白酶可在過濾(Iautering)過程中添加至醪液和/或在過濾之後但在煮沸麥芽汁之前添加至麥芽汁。
背景技術：
許多飲料如啤酒、葡萄酒、果汁等在製造過程中或在儲藏中產生沉澱物。該現象稱為渾濁物(haze)產生。渾濁物產生一般認為是由於飲料中存在的多酚和蛋白質的相互作用所致。該相互作用導致不可溶或部分可溶的膠體顆粒懸液的形成。由於渾濁物形成一般類似由微生物汙染產生的渾濁(cloudness)，一般而言優選飲料特別是啤酒即使長期儲藏後仍非常清澈透明。因此開發了減少此種渾濁物形成的工藝。這些工藝靶向所述蛋白質或多酚或兩者皆是。矽膠、膨潤土、聚乙烯基聚吡咯烷酮(PVPP)等已用於吸收蛋白質和多酚，減少渾濁物形成並促進膠體穩定性。然而此類物質當反覆使用時，導致減少的回報(diminishing returns)，並因此導致增加的成本。而且，它們還從所述飲料去除其他所需的化合物，而可影響其品質。酶特別是蛋白酶亦在發酵過程中用於促進飲料特別是啤酒的膠體穩定性。傳統而言，蛋白酶像木瓜蛋白酶和菠蘿蛋白酶已用於減少冷凍渾濁物形成。然而這些蛋白酶不具特異性，並已顯示由於水解負責泡沫形成的蛋白質而對飲料泡沫穩定性有影響。而且，這些還導致飲料味道的變化。另一種方法為使用僅水解親水性渾濁物形成蛋白質而非疏水性泡沫形成蛋白質的特異性蛋白酶。舉例而言，已知一種脯氨醯特異性內肽酶特異性水解渾濁物形成蛋白質從而促進膠體穩定性並保留泡沫穩定性。在發酵過程中使用蛋白酶可使其在最終啤酒中保留活性，而這一般是不合意的。此外，通過巴氏消毒法滅活可導致啤酒味道低劣(burned)。仍有對用於膠體穩定化飲料特別是啤酒的改進的工藝的需要。
發明內容
在一個方面，本發明涉及釀造啤酒的方法，包括在過濾過程中將醪液和/或在過濾之後但在煮沸麥芽汁之前將麥芽汁與熱穩定性蛋白酶相接觸。在一個方面，所述蛋白酶可從擬諾卡氏菌屬(Nocardiopsis)、芽孢桿菌屬 (Bacillus)或熱子囊菌屬(Thermoascus)獲得。在一個方面，本發明涉及釀造啤酒的方法，包括在過濾過程中將醪液和/或在過濾之後但在煮沸麥芽汁之前將麥芽汁與包含對應於SEQ ID NO :1、2或3的胺基酸序列及其與SEQ ID NO :1、2、3具有至少70%同一性的變體的蛋白酶相接觸。
在一個方面，所述方法導致啤酒產品中渾濁物的減少。在一個方面，本發明涉及釀造啤酒的方法，包括在過濾過程中將醪液和/或在過濾之後但在煮沸麥芽汁之前將麥芽汁與熱穩定性蛋白酶相接觸，由此與以常規方式釀造的啤酒相比時，其膠體穩定性增加。在一個方面，所述接觸在淋洗(sparging)時進行。在一個方面，所述接觸在過濾之後進行。在一個方面，所述接觸在至少60攝氏度(本文下文中稱作。C )的溫度進行。在另一個方面，所述溫度為至少70°C。在又一個方面，所述溫度為至少74°C。更優選至少75°C， 更優選至少76°C，更優選至少77°C且最優選至少78°C。在一個方面，所述接觸進行10分鐘(下文中稱作「min」)至5小時的時間，優選地，所述接觸為20min至3小時，更優選30min至2小時，且最優選30min至1小時。
圖1顯示在由經SEQ ID NO 1的蛋白酶處理的醪液所得的麥芽汁和啤酒相比未經處理的醪液(對照)的渾濁物形成測量。Y軸表示比濁法濁度單位(NTU)的值。
具體實施例方式啤酒釀造工藝對本領域技術人員是公知的。常規步驟可用下述方式概述起始材料為發芽的(即經弄溼、發芽然後乾燥的)大麥和/或未經發芽的輔料，稱為穀物(grist)。 在澱粉糖化(mashing)過程中(此時將穀物磨碎並與水混合，加熱並攪拌)，通過麥芽中天然存在的酶的協助，糖類降解為可發酵的糖。在澱粉糖化之後，需要將液體提取物(麥芽汁)與固形物(糟顆粒和輔料)分離以獲得清澈的麥芽汁。該工藝稱作過濾。在過濾之前， 醪液溫度可升至約75-78°C (165-173° F)(稱作出醪(mashout))。麥芽汁過濾是重要的， 因為所述固形物富含大量蛋白質、不良修飾的澱粉、脂肪物質、矽酸鹽和多酚(鞣質)和蛋白質。在收集第一麥芽汁之後留在糟中的提取物亦可通過在濾餅上部添加入熱水來洗出。 該工藝稱作淋洗。所述熱水流經所述糟，並溶解剩餘的提取物。所述經稀釋的麥芽汁稱作第二麥芽汁，且其提取物下降至第一麥芽汁起始重量的1_2%。在添加啤酒花之後，將麥芽汁煮沸。由此使多種物質包括幾種蛋白質變性，且會發生多酚類的沉澱。在冷卻並去除沉澱物之後，對製得的啤酒麥芽汁(a)進行通氣並添加酵母。在通常持續5-10日的主要發酵 (mainfermentation)之後，去除大部分酵母，並將所謂生啤酒(green beer)在較低溫度， 通常為0-5°C下儲藏一至12周。在此期間殘留的酵母會與多酚類一同沉澱。為了去除殘餘的過量多酚類，進行過濾。經發酵的啤酒(c)此時可在裝瓶之前經充氣(carbonize)。二氧化碳不僅貢獻於感受到的「醇厚(fullness) 」和「濃鬱(body) 」，且作為增味劑，其亦起增強起泡潛力的作用，並在延長產品的儲藏期限中起重要作用。術語「啤酒」用於本文旨在至少涵蓋從所有製備自未發芽的穀物的醪液以及所有製備自發芽的穀物的醪液，以及所有製備自未發芽和發芽的穀物的混合物的醪液所製備的啤酒。術語「啤酒」還涵蓋用輔料製備的啤酒，以及具有所有可能的乙醇含量的啤酒。
不拘於理論，認為在低溫或較長時間儲藏的啤酒中多酚類和蛋白質的相互作用導致稱為渾濁物的聚集物的產生。由於渾濁物形成影響啤酒的品質(亦稱作膠體穩定性)，開發了阻止此種渾濁物形成的方法。在釀造工藝中，大多數蛋白質-多酚複合物通過在啤酒陳化過程中冷卻液體而沉澱出來。任何殘餘的多酚和/或蛋白質使用PVPP、矽膠、膨潤土等去除。依照本發明，啤酒的膠體穩定性定義為以EBC單位測量的膠體不穩定性變得大於2之前的溫熱循環的量。一個溫熱循環對應於大約25日的儲藏期限(MEBAK 2. 15. 2. 1, Fociertmethode, Vorausbestimmung derchemisch-physikalischen Stabilitat, Methodensamlung der Mitteleuropaischen Brautechniche Analysekommission (MEBAK), Selbstverlag der MEBAK, Freising ffeihenstephan)。渾濁物在本領域中亦稱作「混濁(cloudiness) 」或「濁度(turbidity) 」或「膠體不穩定性」，並因此可互換使用。另一個減少渾濁物形成的方法是通過使用蛋白酶。將具有廣譜活性的蛋白酶像木瓜蛋白酶用於剪切蛋白質，可能得到較低和/或更可溶的蛋白質-多酚聚集物。然而這些酶的使用亦影響涉及泡沫穩定性的蛋白質，因此影響最終產物的品質。假設為優選對具有渾濁物活性的蛋白質起作用，而不對泡沫活性蛋白質起作用， 從而保持最終產物泡沫穩定性的特異性蛋白酶，像脯氨醯特異性蛋白酶或丙氨酸特異性蛋白酶也是已知的。優選最終產物不含外源添加的酶活性。因此，酶像上述蛋白酶，通常在澱粉糖化工藝中添加至醪液(水+穀物)。因此他們在澱粉糖化過程中具有活性，而在過濾或煮沸麥芽汁過程中失活或降解。本發明人令人驚訝地發現，將蛋白酶在過濾過程中添加至醪液，和/或在過濾步驟之後，但在煮沸麥芽汁步驟之前添加至麥芽汁，導致良好的膠體穩定性。令人驚訝的是，本發明人發現，當在澱粉糖化起始時添加並不顯示任何作用或對膠體穩定性直接起負作用的蛋白酶，當在過濾過程中和/或之後時顯示膠體穩定性非常良好的增加。當將酶在澱粉糖化中添加時作用的缺乏可能由幾種原因，其一為所述蛋白酶在醪液中受抑制。本發明人還發現，在澱粉糖化中添加的蛋白酶具負作用而當在工藝中較晚添加時具正作用涉及蛋白酶當在工藝早期添加時將基於蛋白質的物質釋放於麥芽汁的能力，這導致對膠體穩定性的負面影響，儘管該酶能夠降解膠體形成蛋白。本發明人發現，如果在過濾之後或工藝的足夠晚期(例如，在過濾過程中，更特別是在淋洗過程中)添加該蛋白酶以限制蛋白物質釋放於麥芽汁，這是可以避免的。令人驚訝的是，本發明人發現釋放的蛋白質的量必須維持在通過Kjehldl測量蛋白質水平的增加少於10%，優選少於9%，更優選少於8 %，更優選少於7 %，更優選少於6 %，且最優選少於5 %。令人驚訝的是，本發明人發現，在MW為10. OOOKD (條帶4-6)附近的釋放的蛋白質的量維持在相對較低水平。令人驚訝的是，還發現，並不視為對作用於渾濁物活性蛋白質具特異性並由此並不對泡沫活性蛋白質具有低活性的蛋白質，當在過濾過程中添加至醪液和/或在過濾之後但在煮沸麥芽汁之前添加至麥芽汁時，不僅可提供良好的膠體穩定作用，還可對啤酒的泡沫穩定性不具任何或僅具略微負面的作用。令人驚訝的是，本發明人發現，亦具熱穩定性的蛋白酶當在過濾過程中添加於醪液和/或在過濾之後但在煮沸麥芽汁之前添加至麥芽汁時提供了良好的膠體穩定作用。令人驚訝的是，在過濾之後施於麥芽汁的蛋白酶的膠體穩定作用可在2小時之內獲得，這比當施於發酵時的幾日要短得多。本發明人令人驚訝地發現，熱穩定性蛋白酶當在過濾過程中添加於醪液和/或在過濾之後但在煮沸麥芽汁之前添加至麥芽汁時具有非常良好的膠體穩定作用。本發明人還發現，使用在釀造中的過濾過程中和/或之後基本上保留其活性的蛋白酶令人驚訝地導致啤酒膠體穩定性的增加。因此，本發明在一個方面涉及釀造啤酒的方法，包括將醪液在過濾過程中和/或將麥芽汁在過濾之後但在煮沸麥芽汁之前與可從擬諾卡氏菌屬(Nocardiopsis)、芽孢桿菌屬(Bacillus)或熱子囊菌屬(Thermoascus)獲得的蛋白酶相接觸。術語「醪液」、「過濾」和「麥芽汁」具有本領域中的常規含意。蛋白酶在本領域中是已知的。其為具有蛋白酶活性的多肽，並亦稱作肽酶、蛋白酶(proteinase)、肽水解酶或蛋白水解酶。蛋白酶可為外切類型的，其從肽任一端起始水解該肽，或為內切類型的，其在多肽鏈之內起作用(內肽酶)。內肽酶對N或C端封閉的、與所述蛋白酶的特異性相關的肽底物顯示活性。術語「蛋白酶」在本文中定義為水解肽鍵的酶。其包括任何屬於EC 3. 4酶組(包括其十三個亞類中的每一個)的酶。所述 EC 數字指來自 NC-IUBMB，Academic Press, San Diego, Calif.，包括分別出版於 Eur. J.Biochem. 1994，223，15 ；Eur.J. Biochem. 1995，232，1 6 ；Eur.J. Biochem. 1996，237，1 5 ； Eur. J. Biochem. 1997，250，1 6 ；and Eur. J. Biochem. 1999，264,610 650 的增補本 1 5 的 Enzyme Nomenclature 1992。該命名法定期增補並更新；參見全球資訊網(Wffff)地址www. chem. qmw. ac. uk/iubmb/enzyme/index, html。蛋白酶根據其催化機理歸類為下述組絲氨酸蛋白酶(S)、半胱氨酸蛋白酶(C)、 天冬氨酸蛋白酶(A)、金屬蛋白酶(M)和未知或尚未歸類的蛋白酶(U)，參見Handbook of Proteolytic Enzymes, A. J. Barrett, N. D. Rawlings, J. F. Woessner(編)，Academic
(1998)，特別是一般介紹部分。蛋白酶可使用任何其中採用底物的測定法測量，所述底物包含與所述蛋白酶特異性相關的肽鍵。亦可對所述蛋白酶適用測定PH和測定溫度。測定PH值的實例為pH 2、3、 4、5、6、7、8、9、10、11 或 12。測定溫度的實例為 30、35、37、40、45、50、55、60、65、70、80、90 或 95°C。蛋白酶底物的實例包括但不限於酪蛋白，如天青精交聯的酪蛋白(AZCL-酪蛋白)和 Protazyme AK0對本發明蛋白酶的起源和/或依照本發明的用途並無限制。因此，術語蛋白酶不僅包括從任何屬獲得的天然或野生型蛋白酶，但還包括其呈現蛋白酶活性的突變體、變體、片段等，以及合成蛋白酶如改組的蛋白酶和共有蛋白酶(consensus protease)。此種經遺傳工程改造的蛋白酶可如本領域通常已知的方法，例如通過定點誘變、PCR(使用含有所需突變的PCR片段作為PCR反應中的一個引物)，或通過隨機誘變進行製備。共有蛋白(consensus protein)的製備描述於例如EP 897985。基因改組一般地描述於例如WO 95/2洸25和 W096/00343。蛋白酶基因的重組可如Ness，J. E.等 in Nature Biotechnology,Vol. 20 (12)，pp. 1251 1255，2002所述通過合成改組獨立於親本的特定序列進行。設計了其DNA序列是簡併的以提供所有親本蛋白酶組中所見的所有胺基酸可能性的合成的寡核苷酸，並依照參考文獻裝配所述基因。改組可對全長序列實施，或僅對序列的部分實施，並於之後與基因其餘部分組合以給出全長序列。在一個方面，所述蛋白酶可從擬諾卡氏菌屬(Nocardiopsis)獲得。Meyer 在 1976 年描述了擬諾卡氏菌(Meyer，1976，ht J Syst Bacteriol，26， 487-493)。達松維爾擬諾卡氏菌(Nocardiopsis dassonvillei)為該屬的一個種，並不同地稱作達松維爾擬諾卡氏菌達松維爾亞種(Nocardiopsis dassonvillei subsp. dassonvillei)、南極擬諾卡氏菌(Nocardiopsis antarctica)或甚至微黃褐鏈黴菌 (Streptomyces flavidofuscus)。優選地，所述蛋白酶可從擬諾卡氏菌屬獲得，更優選達松維爾擬諾卡氏菌、白擬諾卡氏菌(Nocardiopsis alba)或南極擬諾卡氏菌，更優選達松維爾擬諾卡氏菌達松維爾亞種。在另一個方面，所述蛋白酶可從芽孢桿菌屬或熱子囊菌屬獲得。可從芽孢桿菌屬獲得的蛋白酶在本領域是公知的。可從熱子囊菌屬獲得的蛋白酶描述於WO 03/048353。術語「可獲得自」本文中與給定來源相連意指由核酸序列編碼的多肽是由該來源或由其中存在來自所述來源的核酸序列的重組細胞(亦稱作宿主細胞)產生的。在一個優選實施方案中，所述多肽分泌至胞外。取決於在重組產生方法中採用的宿主，本發明的蛋白酶可經糖基化或可為非糖基化的。此外，本發明的蛋白酶亦可包含起始的經修飾的甲硫氨酸殘基，在一些情況下其為宿主介導的過程的結果。所述宿主細胞可為單細胞微生物，例如原核生物，或非單細胞微生物，例如真核生物。可用的宿主細胞為細菌細胞如革蘭氏陽性細菌，包括但不限於芽孢桿菌細胞或鏈黴菌細胞，或乳酸細菌細胞；或革蘭氏陰性細菌如大腸桿菌和假單胞菌屬菌種G^seudomonas sp.)。乳酸細菌包括但不限於乳球菌屬(Lactococcus)、乳桿菌屬 (Lactobacillus)、明串珠菌屬(Leuconostoc)、鏈球菌屬(Streptococcus)、片球菌屬 (Pediococcus)禾口腸球菌屬(Enterococcus)的菌禾中。其他宿主細胞可為真菌細胞(包括子囊菌門(Ascomycota)、擔子菌門 (Basidiomycota)、壺菌門(Chytridiomycota)禾口接合菌門(Zygomycota)(如由 Hawksworth 等，於 Ainsworth and Bisby' s Dictionary of The Fungi,第八版，1995,CAB International, University Press, Cambridge, UK 中所定義)以及卵菌門(Oomycota) (如Hawksworth等，1995，見上，171頁中所引用)，和所有有絲分裂孢子真菌(mitosporic fungi) (Hawksworth 等，1995，見上)。在一個方面，所述真菌宿主細胞為酵母細胞。「酵母」如用於本文中包括產子囊酵母(ascosporogenous yeast)(內孢黴目(Endomycetales))、產擔子酵母(basidiosporogenous yeast)禾口屬於半知菌類(Fungi Imperfecti)(芽抱綱 (Blastomycetes))的酵母。由於酵母的分類在未來可能改變，就本發明而言，應將酵母定義為如 Biology and Activities of Yeast (Skinner, F. A. , Passmore, S. M.,禾口 Davenport, R.R.編，Soc. App. Bacteriol. Symposium Series No. 9，1980)中所述。所述酵母宿主細胞可為假絲酵母屬(Candida)、漢遜酵母屬(Hansenula)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)、畢赤酵母屬(Pichia)、酵母屬(Saccharomyces)、裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)或西洋蓍黴屬(Yarrowia)細胞。所述真菌宿主細胞可為絲狀真菌細胞。「絲狀真菌」包括括真菌亞門(Eumycota) 和卵菌亞門(Oomycota)(如由Hawksworth等，1995，見上文，所定義)的所有絲狀形式。絲狀真菌通常的特徵在於由殼多糖(chitin)、纖維素、葡聚糖、殼聚糖(chitosan)、甘露聚糖和其它複雜多糖組成的菌絲體壁。通過菌絲延伸進行營養生長，而碳分解代謝是專性需氧的。相反，酵母例如釀酒酵母的營養生長通過單細胞菌體的出芽生殖(budding)進行，而碳分解代謝可通過發酵進行。絲狀真菌宿主細胞的實例為枝頂孢黴屬(Acremonium)、麴黴屬(Aspergillus)、 鐮孢屬(Fusarium)、腐質黴屬(Humicola)、毛黴屬(Mucor)、毀絲黴屬(Myceliophthora)、 脈孢菌屬(Neurospora)、青黴屬(Penicillium)、梭孢殼屬CThielavia)、彎頸黴屬 (Tolypocladium)或木黴屬(Trichoderma)菌種的細胞，但不限於此。在本發明的產生方法中，使用本領域已知方法在適合於產生所述多肽的營養培養基中培養細胞。例如，可以通過在合適培養基中和允許表達和/或分離所述多肽的條件下進行的搖瓶培養，和實驗室或工業發酵罐中的小規模或大規模發酵(包括連續、分批、補料分批或固態發酵)來培養細胞。使用本領域已知的方法在合適的營養培養基中進行培養， 所述營養培養基包含碳源和氮源和無機鹽。合適的培養基能夠從商業供應商獲得或可以根據公開的組成製備(例如，在美國典型培養物保藏中心的目錄中)。如果多肽分泌到營養培養基中，該多肽能夠從所述培養基中直接回收。如果多肽不分泌，其能夠從細胞裂解物 (Iysate)回收。所得多肽可以使用本領域已知的方法回收。例如，蛋白酶可以通過常規方法從營養培養基中回收，所述常規方法包括但不限於離心、過濾、提取、噴霧乾燥、蒸發或沉澱。本發明的蛋白酶可以通過多種本領域已知的方法純化，所述方法包括但不限於層析(例如，離子交換、親和、疏水、層析聚焦和大小排阻)、電泳方法(例如，製備型 (preparative)等電聚焦)、差示溶解度(例如，硫酸銨沉澱)、SDS-PAGE或提取(參見，例如，Protein Purification, J.-C. Janson 禾口 Lars Ryden 編，VCH Publishers, New York, 1989)。在一個方面，所述蛋白酶包含對應於SEQ ID NO :1的胺基酸序列，及其與SEQ ID NO 1具有至少70%同一性的變體。在另一個方面，所述蛋白酶包含對應於SEQ ID NO :2或3的胺基酸序列及其與相應的親本序列具有至少70%同一性的變體。術語「變體」旨在表示來源於SEQ ID NO :1或2或3並具有蛋白酶活性的多肽。 通常，所述變體與親本蛋白酶(在此情況下，為具有SEQ ID N0:1或2或3的蛋白酶)相差一個或多個胺基酸殘基，例如，其可為從所述蛋白酶的N端或C端之一或兩者的添加或缺失，在蛋白酶胺基酸序列之內一個或多個位點的插入或缺失，或在親本蛋白酶胺基酸序列之內，或在一端或兩端取代一個或多個胺基酸殘基。變體可為天然存在的(例如，由基因等位變體編碼的多肽變體，所述等位變體為佔據同一染色體基因座的基因的兩種或更多種可選形式)或通過許多本領域已知技術(例如PCR)人工構建的。本發明的蛋白酶包含與SEQ ID NO :1或2或3的成熟肽部分具有例如，至少約70%的同一性程度的胺基酸序列。在具體實施方案中，與SEQ ID NO :1或2或3或4的同一性程度為至少約 72%、74%、76%、78%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、 88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或至少 99%。就本發明而言，兩個胺基酸序列之間的同一性程度是通過為Needleman-Wunsch 比對(即全局比對)的程序「比對^I定的。該程序用於多肽以及核苷酸序列的比對。使用預設評分矩陣BL0SUM50，其中缺口第一個殘基的罰分為-12而缺口其他殘基的罰分為_2。「比對」是FASTA包版本v20u6的一部分(參見W.R.Pearson和 D. J. Lipman(1988), 「 Improved Tools for Biological Sequence Analysis" ,PNAS85 2444 2448, L^^ff. R. Pearson (1990) " Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTP and FASTA, 「 Methods in Enzymology 183:6398)。FASTA 蛋白質比對使用對缺口大小無限制的 Smith-Waterman 算法(參見〃 Smith-Waterman algorithm"，Τ. F. Smith 和 Μ. S. Waterman (1981) J. Mol. Biol. 147 :195 197)。兩個胺基酸序列之間的同一性程度亦可通過Clustal方法(Higgins，1989， CABIOS 5 151 153)使用 LASERGENE. TM. MEGALIGN. T M.軟體(DNASTAR, Inc.，Madison, Wis.)使用同一性表和下述多重比對參數來確定缺口罰分為10，而缺口長度罰分為10。 配對比對參數為K元組(Ktuple) =1，缺口罰分=3，窗口(windows) =5，而對角線 (diagonals) = 5。在一個方面，蛋白酶與麥芽汁的接觸是在過濾之後進行的。過濾時的溫度通常為大約78°C。因此可能在過濾之後需要降低溫度以允許酶起作用，降低溫度增加了釀造工藝的成本，因此儘可能少地降低溫度是有利的，且優選完全不降低。酶施用的溫度優選至少為60°C，更優選至少70°C，更優選至少72°C，更優選至少 740C，更優選至少75 °C，更優選至少76 °C，更優選至少77 °C，且甚至更優選至少78 °C。在一個方面，所述蛋白酶為熱穩定蛋白酶。熱穩定性為酶在更高溫度保留其活性的能力的量度。就本發明而言，蛋白酶的熱穩定性是使用對所述蛋白酶對其具有活性的蛋白酶底物如例如實施例3中所述的ftOtazyme AK 的測定法來測量的。在一個方面，所述蛋白酶在70°C pH 5. 5(使用實施例3中所述的緩衝系統)溫育 10分鐘之後保留至少70%活性、如至少75%、如至少76%、如至少77%、如至少78%、如至少79%、如至少80%、如至少81%、如至少82%、如至少83%、如至少84%、如至少85%、 如至少86%、如至少87%、如至少88%、如至少89%、如至少90%、如至少91%、如至少 92%、如至少93%、如至少94%、如至少95%、如至少96%、如至少97%、如至少98%、如至少 99%。在一個方面，所述熱穩定性亦可在70°C溫育更長時間期間之後進行測量，如例如使用實施例3中所述的方法進行60分鐘。在此類情況下，所述蛋白酶保留其在pH 5.5(使用實施例3中所述的緩衝系統)所具的活性的至少20%，如至少25%、如至少30%、如至少 35%、如至少40%、如至少45%，如至少50%、如至少55%、如至少60%、如至少65%、如至少70%、如至少75%、如至少80%、如至少85%、如至少90%、如至少95%、如至少97%、如至少99%。在一個方面，所述接觸是在IOmin至5小時，優選20min至3小時，更優選30min至2小時且最優選30min至1小時的期間進行的。在一個方面，本發明的方法導致與以常規方式釀造的啤酒相比，渾濁物減少。為了量化啤酒中渾濁物的量，常常使用濁度計亦稱透程計(hazemeter)。在濁度計中，測量在預先描述的相對於入射光線的方向的角度散射的光的量。濁度測量非常適用於測量由於蛋白質-多酚相互作用的結果而形成的渾濁物。「以常規方式釀造的啤酒」定義為通過其中在澱粉糖化階段過程中將蛋白酶添加至醪液的釀造方法製得的啤酒。在另一個方面，本發明的方法導致在釀造和儲藏過程中用於減少渾濁物形成的處理助劑(processing aids)使用的減少。「處理助劑」為在釀造和/或儲藏過程中用於減少渾濁物形成的試劑。處理助劑包括但不限於矽膠、PVPP、膨潤土等等。在一個方面，所述減少是百分之100，意指不使用任何處理助劑。在另一個方面，不用矽膠過濾而產生啤酒，且優選不用矽膠和PVPP過濾。在一個方面，本發明的方法得到與以常規方式釀造的啤酒相比泡沫穩定性相同或更高的啤酒。泡沫是由因為在調製啤酒過程中壓力釋放所致而釋放的二氧化碳產生的。泡沫由於表面活性劑像泡沫活性蛋白的存在而變得穩定，所述泡沫活性蛋白聚集於泡沫表面，並在氣泡周圍形成彈性的膜(skin)。啤酒的泡沫穩定性是通過使用NIBEM方法 (MEBAK 2. 19.2)在給定距離測量泡沫崩潰所需的時間(以秒計)來確定的。該方法在本領域是己知的(MEBAK 2. 19. 2.，Schaumbestimmung nach NIBEM, Methodensamlung der Mitteleuropaischen Brautechniche Analysekommission (MEBAK), Selbstverlag der MEBAK, Freising Weihenstephan)。實施例實施例1:SEQ ID NO :1的蛋白酶當在澱粉糖化過程中添加或添加至成品啤酒時在啤酒膠體穩定中的作用目標為調查是否上述蛋白酶在醪液或在成品啤酒中的使用顯示類似的蛋白水解活性和是否膠體穩定性有任何差異。蛋白酶如US5312748中所述獲得。蛋白水解酶活性是通過公知的Anson血紅蛋白方法確定的，參見 Journal of General Physiology，22，79-89 (1959)。一個 Anson 單位 (AU)，是在9. O的pH值和25°C的溫度在10分鐘的反應時間中，以這樣的起始速度消化血紅蛋白而使得每分鐘生成的無法用三氯乙酸沉澱的分解產物的量與一毫當量的酪氨酸與酚試劑給出相同顏色的蛋白水解酶的量。以實驗室規模用100%麥芽進行了澱粉糖化試驗。根據表1所示的澱粉糖化實驗方案，將醪液用蛋白酶以對應於5mg純酶蛋白(EP)/kg麥芽蛋白酶(SEQ ID N0:1)的量處理。將對照也依照所示的概貌(profile)但不添加蛋白酶進行澱粉糖化。表1 澱粉糖化概貌時間(min)溫度(°c)0523052406270628072110721167813120P)發酵(12 5日，酵母菌株W 35/70)，將麥芽汁(12 (Turbidimeter Hach型2100AN)測量麥芽汁和啤酒的渾濁物。此外，在最終發酵成的啤酒中渾濁物形成潛力通過依照 Siebert 1997 (J. Am. Soc. Brew. Chem. 55 (2) :73-78,1997)公開的方法添加鞣酸強制形成渾濁物來測量。結果在圖1中給出。從結果來看，令人驚訝的是，顯然蛋白酶並未顯示對麥芽汁或啤酒濁度的影響。甚至添加鞣酸亦無任何差異，這表明將鞣質添加至醪液並不能增強膠體穩定性。實施例2 蛋白酶當在過濾過程中或之後但在煮沸麥芽汁之前添加時對啤酒膠體穩定性和泡沫穩定性的作用從通常的100%良好修飾的德國清淡比爾森(pilsner)麥芽工業規模煎劑澱粉糖化工藝依照下述概貌回收麥芽汁在62°C開始澱粉糖化(mashing-in)20分鐘，將溫度上升至65°C (I0C /分鐘)，在65°C放置15分鐘，將20%的醪液煮沸20分鐘並與維持在65°C主醪液混合，得到72°C的澱粉糖化溫度，維持30分鐘，將20%的醪液煮沸並與維持在72°C的主醪液混合，得到78°C的溫度，並起始過濾。在淋洗過程中添加水，得到1 5的麥芽對水的比例。將麥芽汁稀釋至Plato 12，並分為三個批次。批次A的麥芽汁不用酶處理(對照)，批次B的麥芽汁在70°C用5mg酶蛋白/kg對應於0. 019AU/kg麥芽的SEQ ID NO 1的麥芽蛋白酶溫育2小時，而批次C的麥芽汁在60°C用5mg酶蛋白/kg麥芽的對應於2. 7g Brewers Clarex/IOOL 啤酒的從 DSM(Het Overloon 1 6411 TE Heerlen (NL))獲得的脯氨酸特異性蛋白酶Brewers Clarex溫育2小時。在酶溫育終止之後，將麥芽汁與啤酒花(8% α酸)煮沸(酶滅活)一小時。以中試規模工藝對三個麥芽汁批次進行相同的釀造工藝。 將15χ106細胞/mL通常的底部發酵酵母類型(W34 70」)投料於麥芽汁中。發酵在12°C進行140小時，並用PVPP(15g/hL)穩定化所述三個啤酒批次。手工將所述啤酒裝瓶於0. 5L 燒瓶。所得啤酒樣品的膠體穩定性是依照MEBAK 2. 15. 2. 1 (0°C /40°C /OV )的步驟確定的。在多至15個溫熱循環之後以EBC(European Brewery Convention)單位測量渾濁物形成。著重於膠體穩定性的啤酒儲藏期限可通過在渾濁物測量值超過2. OEBC單位之前啤酒可經歷的溫熱循環數來估計(一個溫熱循環對應於大約25日的儲藏期限)。
權利要求
1.一種釀造啤酒的方法，包括將醪液在過濾過程中和/或將麥芽汁在過濾之後但在煮沸麥芽汁之前與熱穩定性蛋白酶相接觸。
2.權利要求1的方法，其中所述蛋白酶可從擬諾卡氏菌屬(Nocardiopsis)、芽孢桿菌屬(Bacillus)或熱子囊菌屬(Thermoascus)獲得。
3.權利要求1的方法，其中熱穩定性意指純蛋白酶的蛋白酶活性在依照實施例3在 70°C溫育10分鐘之後，在pH5. 5測量時為參照活性的至少70%。
4.權利要求1的方法，其中所述蛋白酶包含對應於SEQID NO 1或其與SEQ ID NO 1 具有至少70%同一性的變體的胺基酸序列。
5.權利要求1的方法，其中所述蛋白酶包含對應於SEQID NO 2或其與SEQ ID NO 2 具有至少70%同一性的變體的胺基酸序列。
6.權利要求1的方法，其中所述蛋白酶包含對應於SEQID NO 3或其與SEQ ID NO 3 具有至少70%同一性的變體的胺基酸序列。
7.權利要求1的方法，其中麥芽汁中蛋白質的量，定義為依照實施例6中的raiK，增加了少於10%。
8.權利要求1的方法，其中所述GATA，依照實施例6測量，為至少25%。
9.權利要求1的方法，其中膠體穩定性相對於以常規方式釀造的啤酒增加。
10.權利要求1的方法，其中所述方法導致相對於以常規方式釀造的啤酒減少使用或不使用處理助劑。
11.權利要求1的方法，其中所述啤酒是不經矽石過濾而產生的。
12.權利要求1的方法，其中所述啤酒具有與以常規方式釀造的啤酒相等或更高的泡沫穩定性。
13.權利要求1的方法，其中所述接觸是在過濾之後進行的。
14.權利要求1的方法，其中所述接觸是在淋洗過程中進行的。
15.權利要求1的方法，其中所述接觸是在至少60°c的溫度進行的。
16.權利要求1的方法，其中所述接觸是在至少70°C的溫度進行的。
17.權利要求1的方法，其中所述接觸是在至少75°C的溫度進行的。
18.權利要求1的方法，其中所述接觸進行10分鐘至5小時的時間。
19.權利要求2的方法，其中所述蛋白酶可從達松維爾擬諾卡氏菌、桔橙熱子囊菌或地衣芽孢桿菌獲得。
全文摘要
一種釀造啤酒的方法，包括將醪液在過濾過程中和/或將麥芽汁在過濾之後但在煮沸麥芽汁之前與熱穩定性蛋白酶相接觸。
文檔編號C12N5/00GK102325876SQ201080008535
公開日2012年1月18日 申請日期2010年2月19日 優先權日2009年2月19日
發明者A.M.弗雷德裡克森, H.P.赫爾德-漢森, L.貝克加德, P.R.奧斯特加德, S.克雷茲 申請人:諾維信公司