廈黴素a和氧廈黴素的生物合成基因簇及其應用的製作方法
2023-10-31 04:31:47 3
專利名稱：廈黴素a和氧廈黴素的生物合成基因簇及其應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於微生物基因工程領域，具體涉及吲哚倍半萜類抗生素廈黴素A(xiamycin A)和氧廈黴素(oxiamycin)的生物合成基因簇及其應用。
背景技術：
吲哚倍半萜是一類含有吲哚的生物鹼。已報導發現的吲哚倍半萜生物鹼類化合物主要來源於植物，例如來自暗羅屬植物Polyalthia oliveri的polyalthenol ;來自舌甘楊(P. suaveolens)的 polyveoline 以及來自 Greenwayodendron suaveolens 的suaveolindole等,最近的一個例子是polysin和pentacyclindole。直到最近十年，真菌來源的11引哚倍半職才陸續被報導,包括sespendole和lacanindoles。Cane的基因組數據挖掘工作表明放線菌是萜類化合物的豐富來源。與此相對應，最近，一些來源於放線菌的吲 哚倍半職類化合物相繼被發現，包括從一株土壤鏈黴菌中分離到的oridamycin A和B,從兩個紅樹林植物內生鏈黴菌中分離到的廈黴素A (xiamycin A，I)，其結構式如圖I所示和B，以及 indosespene (3)和 sespenine。研究發現，來自 Streptomyces sp. strain KS84 的Oridamycins A和B具有抗真菌活性，來自紅樹林內生菌Streptomyces sp. GT2002/1503的廈黴素A具有選擇性的抗HIV活性和中等抗菌活性。近十多年來發展起來的組合生物合成技術為改造複雜天然產物提供了新的思路和方法。在闡明了自然界的生物合成途徑、克隆和鑑定微生物天然產物生物合成基因簇的基礎上，採用組合生物合成技術對發現的生物合成基因、調控基因進行體內敲除、突變、置換和重組等操作，不但能夠生產「非天然」的天然產物結構類似物，而且還可以提高天然產物的產量，或定向積累所需要的天然產物，為天然產物的發現和藥物開發提供分子和活性多樣性。
發明內容
本發明的第一個目的是提供一種廈黴素A和氧廈黴素的生物合成基因簇。本發明的廈黴素A和氧廈黴素的生物合成基因簇，其特徵在於，該生物合成基因簇的核苷酸序列如SEQ ID NO. I的第2693 26792位的鹼基序列所示，包含18個基因，具體為(I)負責職類骨架合成的基因，即xiaD、xiaE、xiaF、xiaN、xiaP共5個基因xiaD位於基因簇核苷酸序列第5512-6504個鹼基處，長度為993個鹼基對，編碼4-羥基-3-甲基-2- 丁烯基-焦磷酸還原酶，330個胺基酸；xiaE位於基因簇核苷酸序列第6517-8334個鹼基處，長度為1818個鹼基對，編碼I-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶,605個胺基酸；xiaF位於基因簇核苷酸序列第8331-9482個鹼基處，長度為1152個鹼基對，編碼4-羥基-3-甲基-2- 丁烯基-焦磷酸合酶，383個胺基酸；XiaN位於基因簇核苷酸序列第16457-17482個鹼基處，長度為1026個鹼基對，編碼聚異戊二烯二磷酸合酶，341個胺基酸；xiaP位於基因簇核苷酸序列第19795-20802個鹼基處，長度為1008個鹼基對，編碼聚異戊二烯合成酶，335個胺基酸；(2)氧化還原酶基因，即 xiaA、xiaB、xiaI、xiaJ、xiaK、xiaL、xiaM、xiaO 共 8 個基因XiaA位於基因簇核苷酸序列第2693-3784個鹼基處，長度為1092個鹼基對，編碼含有Rieske 2Fe-2S (鐵硫蛋白)結構域加氧酶，363個胺基酸；xiaB位於基因簇核苷酸序列第3843-4337個鹼基處，長度為495個鹼基對，編碼黃素還原酶，164個胺基酸；
xial位於基因簇核苷酸序列第11512-12705個鹼基處，長度為1194個鹼基對，編碼吲哚氧化酶/乙醯CoA脫氫酶，397個胺基酸；XiaJ位於基因簇核苷酸序列第12708-13097個鹼基處，長度為390個鹼基對，編碼檸檬烯-1，2-環氧化物水解酶，129個胺基酸；XiaK位於基因簇核苷酸序列第13100-14890個鹼基處，長度為1791個鹼基對，編碼芳香環羥化酶，596個胺基酸；XiaL位於基因簇核苷酸序列第14890-15123個鹼基處，長度為234個鹼基對，編碼鐵氧化還原蛋白，77個胺基酸；XiaM位於基因簇核苷酸序列第15149-16318個鹼基處，長度為1170個鹼基對，編碼細胞色素P450氧化酶,389個胺基酸；xiaO位於基因簇核苷酸序列第17610-19766個鹼基處，長度為2157個鹼基對，編碼單加氧酶，718個胺基酸；(3)編碼調控子和轉運子的基因，即xiaC、xiaG、xiaH、xiaQ、xiaR共5個基因xiaC位於基因簇核苷酸序列第4502-5278個鹼基處，長度為777個鹼基對，編碼IclR家族的轉錄調控蛋白，258個胺基酸；xiaG位於基因簇核苷酸序列第9930-10652個鹼基處，長度為723個鹼基對，編碼LuxR家族調控蛋白，240個胺基酸；xiaH位於基因簇核苷酸序列第10645_11445個鹼基處，長度為801個鹼基對，編碼假定的膜蛋白，266個胺基酸；xiaQ位於基因簇核苷酸序列第20897-23875個鹼基處，長度為2979個鹼基對，編碼LuxR家族的轉錄調控蛋白，992個胺基酸；xiaR位於基因簇核苷酸序列第24018-26792個鹼基處，長度為2775個鹼基對，編碼LuxR家族的轉錄調控蛋白，924個胺基酸。在廈黴素A生物合成基因簇的上下遊基因，即orf (-2)、orf(-l)、orfl、orf2共4個基因orf (-2)位於基因簇核苷酸序列第1_1644個鹼基處，長度為1644個鹼基對，編碼FAD (黃素腺嘌呤二核苷酸)依賴型氧化還原酶，547個胺基酸；orf (-1)位於基因簇核苷酸序列第1641-2696個鹼基處，長度為1056個鹼基對，編碼乙醇脫氫酶，351個胺基酸；orfl位於基因簇核苷酸序列第27049-27486個鹼基處，長度為438個鹼基對，編碼鋅金屬蛋白酶，編碼145個胺基酸；orf2位於基因簇核苷酸序列第27845-29371個鹼基處，長度為1527個鹼基對，編碼假定的鈉耦合通透酶，編碼508個胺基酸。SEQ ID NO. I的第2693位到26792位的鹼基序列的互補序列可根據DNA鹼基互補原則隨時得到。SEQ ID NO. I的第2693位到26792位的的核苷酸序列或部分核苷酸序列可以通過聚合酶鏈式反應(PCR)或用合適的限 制性內切酶酶切相應的DNA或DNA體外合成技術或使用其他合適的技術得到。本發明提供了得到至少包含部分SEQ ID NO. I的第2693位到26792位中DNA序列的重組DNA載體的途徑。本發明還提供了產生廈黴素A生物合成基因被中斷或其他基因改造的途徑，至少其中之一的基因包含有SEQ ID NO. I的第2693位到26792位中的核苷酸序列。本發明所提供的核苷酸序列或部分核苷酸序列，可利用聚合酶鏈式反應(PCR)的方法或包含本發明序列SEQ ID NO. I的第2693位到26792位的DNA作為探針以Southern雜交等方法從其他生物體中得到與廈黴素A生物合成基因簇相似的基因。包含本發明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的克隆DNA可用於從鏈黴菌SCSIO 02999基因組文庫中定位更多的文庫質粒。這些文庫質粒至少包含本發明中的部分序列，也包含有鏈黴菌SCSIO 02999基因組中鄰近區域未克隆的DNA。包含本發明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列可以被體內體外修飾或進行突變，包括插入、置換或缺失，聚合酶鏈式反應，錯誤介導聚合酶鏈式反應，位點特異性突變，不同序列的重新連接，序列的不同部分或與其他來源的同源序列進行定向進化，或通過紫外線或化學試劑誘變等。包含本發明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的克隆基因可以通過合適的表達體系在外源宿主中表達以得到相應的酶或其他更高的生物活性物質或產量。這些外源宿主包括大腸桿菌、鏈黴菌、小單孢菌、假單孢菌、芽孢桿菌、酵母、植物和動物等。本發明所提供的胺基酸序列可以用來分離所需要的蛋白並可用於抗體的製備。包含本發明所提供的胺基酸序列或至少部分序列的多肽可能在去除或替代某些胺基酸之後仍有生物活性甚至有新的生物學活性，或者提高了產量或優化了蛋白動力學特徵或其他致力於得到的性質。包含本發明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的基因或基因簇可以在異源宿主中表達並了解它們在宿主代謝中的功能。包含本發明所提供的核苷酸序列編碼的蛋白可以催化合成indosespene類化合物，進一步催化合成抗生素廈黴素A。包含本發明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的基因或基因簇可以通過遺傳重組來構建重組載體以獲得新型生物合成途徑，也可以通過插入、置換、缺失或失活進而獲得其他新型生物合成途徑或者產生新的化合物。包含本發明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的克隆基因DNA片段可以通過中斷廈黴素A生物合成的一個或幾個步驟而得到新的廈黴素結構類似物或前體。包含DNA片段或基因可以用來提高廈黴素A或其衍生物的產量，本發明提供了在基因工程微生物中提高產量的途徑。本發明所提供的催化合成indosespene類化合物的合成基因可用於合成廈黴素A衍生物。本發明所提供的廈黴素骨架的後修飾基因或其他酶提供了通過遺傳修飾得到類似物的途徑，所包含的催化吲哚倍半萜類化合物生成或後修飾的其他應用。本發明所提供的n引哚氧化酶XiaI是一個新型的環化酶,可用於催化indosespene類化合物形成吲哚倍半萜的成環反應。本發明還提供了廈黴素A和氧廈黴素的生物合成基因簇在製備廈黴素A及其類似物中的應用。本發明還提供了廈黴素A和氧廈黴素的生物合成基因簇在製備氧廈黴素及其類似物中的應用。本發明還提供了廈黴素A和氧廈黴素的生物合成基因簇在製備化合物indosespene及其類似物中的應用。
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本發明還提供了一種編碼吲哚氧化酶/乙醯CoA脫氫酶的基因，其特徵在於，其核苷酸序列如SEQ ID NO. I的第11512 12705位鹼基序列所示。本發明還提供了所述的編碼吲哚氧化酶/乙醯CoA脫氫酶的基因編碼的吲哚氧化酶/乙醯CoA脫氫酶。總之，本發明所提供的包含廈黴素A和氧廈黴素生物合成相關的所有基因和蛋白信息，可以幫助人們理解廈黴素家族天然產物的生物合成機制，為進一步遺傳改造提供了材料和知識。本發明所提供的基因及其蛋白質也可以用來尋找和發現可用於醫藥、工業或農業的化合物或基因、蛋白。本發明的海洋來源的鏈黴菌(Streptomyces sp. ) SCSIO 02999,該菌於2012年4月26保藏於中國典型培養物保藏中心(0^0)，地址中國武漢市武漢大學，其保藏編號為CCTCCN0 M 2012145。
圖I是廈黴素A (化合物I)和氧廈黴素(化合物2)的化學結構式。圖2是推測的廈黴素A和氧廈黴素的生物合成途徑。圖3是陽性克隆的相互重疊區示意圖，包括了陽性克隆pCSG2402，pCSG2403，PCSG2404, pCSG2405, pCSG2407, pCSG2408，粗實線表示廈黴素A生物合成基因簇，箭頭所示為引物XiaD-lF/XiaD-lR和XiaN_lF/XiaN_lR擴增片段的位置。圖4是廈黴素A和氧廈黴素生物合成基因簇的組織結構示意圖。圖5是基因遺傳改造鏈黴菌SCSIO 02999中廈黴素A和氧廈黴素生物合成基因簇得到的突變株在AM6發酵培養基中發酵的發酵產物的高壓液相分析圖(A)野生型菌株鏈黴菌SCSI002999經發酵獲得了廈黴素A (I)和氧廈黴素(2) ; (B)敲除了 orf(-l)-乙醇脫氫酶基因，獲得的突變株XM31發酵仍然能產生化合物廈黴素A和氧廈黴素；(C)敲除了xiaB-黃素還原酶基因，獲得的突變株XM33發酵仍然能產生化合物廈黴素A和氧廈黴素；(D)敲除了 XiaC-IclR家族的轉錄調控蛋白基因，獲得的突變株XM34發酵仍然能產生化合物廈黴素A和氧廈黴素；(E)敲除了 xiaD-4-羥基-3-甲基-2- 丁烯基-焦磷酸還原酶，獲得的突變株XM35發酵仍然能產生化合物廈黴素A和氧廈黴素；(F)敲除了 xiaE-1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶基因，獲得的突變株XM36發酵仍然能產生了化合物廈黴素A和氧廈黴素，但產量有所降低；(G)敲除了 xiaF-4-羥基-3-甲基-2- 丁烯-I-基磷酸合酶基因，獲得的突變株XM37發酵仍然能產生化合物廈黴素A和氧廈黴素，但產量有所降低；(H)敲除了 xiaG-LuxR家族調控蛋白基因，獲得的突變株XM38失去了產生廈黴素A和氧廈黴素的能力；(1)敲除了 xiaH-假定的膜蛋白基因，獲得的突變株XM39失去了產生廈黴素A和氧廈黴素的能力；(J)敲除了 xiaj-檸檬烯-1，2-環氧化物水解酶基因，獲得的突變株XM40發酵仍然能產生化合物廈黴素A和氧廈黴素；(K)敲除了 xial-吲哚氧化酶/乙醯輔酶A脫氫酶基因，獲得的突變株XM41失去了產生廈黴素A和氧廈黴素的能力；(L)敲除了XiaK-芳香環羥化酶基因，獲得的突變株XM42發酵不能產生化合物氧廈黴素，廈黴素A的產量大幅降低，而且產生了新化合物3 (indosespene) ; (M)敲 除了 xiaL-鐵氧化還原蛋白基因，獲得的突變株XM43失去了產生廈黴素A和氧廈黴素的能力；(N)敲除了 XiaM-細胞色素P450氧化酶基因，獲得的突變株XM44失去了產生廈黴素A和氧廈黴素的能力；(0)敲除了xiaN-聚異戊二烯二磷酸合酶基因，獲得的突變株XM45發酵仍然能產生化合物廈黴素A和氧廈黴素；(P)敲除了 xiaO-單加氧酶基因，獲得的突變株XM46失去了產生廈黴素A和氧廈黴素的能力；(Q)敲除了 xiaP-聚異戊二烯合成酶基因，獲得的突變株XM47失去了產生廈黴素A和氧廈黴素的能力；(R)敲除了 XiaQ-LuxR家族的轉錄調控蛋白基因，獲得的突變株XM48失去了產生廈黴素A和氧廈黴素的能力；(S)敲除了 xiaR-LuxR家族的轉錄調控蛋白基因，獲得的突變株XM49失去了產生廈黴素A和氧廈黴素的能力；(T)敲除了 orfl-鋅金屬蛋白酶基因，獲得的突變株XM50發酵仍然能產生化合物廈黴素A和氧廈黴素；(U)敲除了 orf2-通透酶基因，獲得的突變株XM51發酵仍然能產生化合物廈黴素A和氧廈黴素。圖6是分離到的合成途經中間產物3的化學結構式。圖7 (A)是優化培養條件後鏈黴菌SCSIO 02999及其基因遺傳改造突變株XM44發酵產物的高壓液相分析圖(i)鏈黴菌SCSIO 02999野生型菌株在AM6發酵培養基中發酵7天的產物檢測；(ii)鏈黴菌SCSIO 02999野生型菌株在AM6-4發酵培養基中發酵7天的產物檢測，廈黴素A和氧廈黴素的產量有所提高；(iii)突變株XM42在AM6發酵培養基中發酵7天的產物檢測；(iv)突變株XM42在AM6-4發酵培養基中發酵7天的產物檢測，能檢測到產生了新化合物4和5 ; (V)突變株XM44在AM6發酵培養基中發酵7天的產物檢測；(vi)突變株XM44在AM6-4發酵培養基中發酵7天的產物檢測，能檢測到產生了新化合物6和7 ； (B)是從XM42和XM44在AM6-4發酵培養基發酵的產物中分離到的化合物4_7的化學結構式。圖8是部分突變株添加二甲基亞碸(DMS0)、廈黴素A或化合物3培養後的發酵產物的高壓液相分析圖(A)是突變株XM41添加廈黴素A或化合物3培養後的發酵產物的高壓液相分析圖(i)廈黴素A標準品；(ii)氧廈黴素標準品；(iii)化合物3標準品；(iv)突變株XM41添加DMSO培養後的發酵產物；(V)突變株XM41添加化合物3培養後的發酵產物，沒有產生廈黴素A和氧廈黴素，也沒有產生其他新的化合物；(vi)突變株XM41添加廈黴素A培養後的發酵產物，產生了氧廈黴素；(B)是突變株XM43添加廈黴素A或化合物3培養後的發酵廣物的聞壓液相分析圖(i)廈黴素A標準品；(ii)氧廈黴素標準品；(iii)化合物3標準品；(iv)突變株XM43添加DMSO培養後的發酵產物；(v)突變株XM43添加化合物3培養後的發酵產物，產生了廈黴素A和氧廈黴素；(vi)突變株XM43添加廈黴素A培養後的發酵產物，產生了氧廈黴素；(C)是突變株XM44添加廈黴素A或化合物3培養後的發酵產物的高壓液相分析圖(i)廈黴素A標準品；(ii)氧廈黴素標準品；(iii)化合物3標準品；(iv)突變株XM44添加DMSO培養後的發酵產物；(v)突變株XM44添加化合物3培養後的發酵產物，產生了廈黴素A和氧廈黴素；(vi)突變株XM44添加廈黴素A培養後的發酵產物，產生了氧廈黴素；(D)是突變株XM46添加廈黴素A或化合物3培養後的發酵產物的聞壓液相分析圖(i)廈黴素A標準品；(ii)氧廈黴素標準品；(iii)化合物3標準品；(iv)突變株XM46添加DMSO培養後的發酵產物；(v)突變株XM43添加化合物3培養後的發酵產物，產生了廈黴素A，但沒有產生氧廈黴素；(Vi)突變株XM46添加廈黴素A培養後的發酵產物，沒有產生氧廈黴素；(E)是突變株XM47添加廈黴素A或化合物3培養後 的發酵產物的高壓液相分析圖(i)廈黴素A標準品；(ii)氧廈黴素標準品；(iii)化合物3標準品；(iv)突變株XM47添加DMSO培養後的發酵產物；(v)突變株XM47添加化合物3培養後的發酵產物，產生了廈黴素A和氧廈黴素；(vi)突變株XM47添加廈黴素A培養後的發酵產物，產生了氧廈黴素。圖9是吲哚氧化酶XiaI的體內生物轉化，(A)XiaI生物轉化化合物3的高壓液相分析圖(i)廈黴素A標準品；(ii)化合物3標準品；(iii)攜帶pET28a質粒的大腸桿菌BL21 (DE3)在含有50 ii M卡那黴素，0. ImM IPTG和60 y M化合物3的LB培養基中培養4小時的HPLC檢測結果；(iv)攜帶pCSG2604質粒的大腸桿菌BL21 (DE3)在含有50 y M卡那黴素，0. ImMIPTG和60 ii M化合物3的LB培養基中培養4小時的HPLC檢測結果，化合物3已經部分轉化為化合物8和廈黴素A ; (V)攜帶pCSG2604質粒的大腸桿菌BL21 (DE3)在含有50 u M卡那黴素，0. ImM IPTG和60 y M化合物3的LB培養基中培養24小時的HPLC檢測結果，化合物3已經完全轉化為廈黴素A，同時化合物8也消失了 ；「 」表示大腸桿菌宿主發酵生成的物質；(B)反應中間產物8的化學結構式；(C) XiaI催化反應的示意圖；(D) XiaI生物轉化化合物6和7的高壓液相分析圖(i)攜帶pET28a質粒的大腸桿菌BL21 (DE3)在含有50 ii M卡那黴素，0. ImM IPTG和60 y M化合物6的LB培養基中培養24小時的HPLC檢測結果；(ii)攜帶pCSG2604質粒的大腸桿菌BL21 (DE3)在含有50 y M卡那黴素，0. ImMIPTG和60 ii M化合物6的LB培養基中培養24小時的HPLC檢測結果，化合物6已經部分轉化為化合物9攜帶pET28a質粒的大腸桿菌BL21(DE3)在含有50 y M卡那黴素，0. ImMIPTG和60 ii M化合物7的LB培養基中培養24小時的HPLC檢測結果；(iv)攜帶pCSG2604質粒的大腸桿菌BL21 (DE3)在含有50 ii M卡那黴素，0. ImM IPTG和60 y M化合物7的LB培養基中培養24小時的HPLC檢測結果，化合物7已經部分轉化為化合物10。圖10是吲哚氧化酶XiaI的體外生化鑑定，(A)純化蛋白XiaI的蛋白電泳分析；(B)XiaI反應的高壓液相分析圖(i)廈黴素A標準品；(ii)化合物3標準品；(iii)XiaI的標準反應體系包括400 u M化合物3，ImM黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)，2mM NADH, 5 u MXiaI，50mM Tris-HCl (pH 8. 0)，28°C反應4小時，化合物3部分反應生成化合物8和廈黴素A ;(iv)標準反應體系中的NADH換成NADPH，化合物3部分能反應生成廈黴素A，但是催化效率明顯低於標準體系；(V)標準反應體系中的XiaI換成經過10分鐘沸水浴處理的XiaI,化合物3不能反應生成廈黴素A，說明加熱會導致XiaI失活；(vi)標準反應體系缺少FAD，化合物3部分不能反應生成廈黴素A ； (vii)標準反應體系缺少NADH，化合物3部分不能反應生成廈黴素A ; (viii)反應體系包括400 ii M化合物3，ImM黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)，5uM XiaI,50mM Tris-HCl (pH 8.0) ; (ix)標準反應體系中的FAD換成FMN，化合物3部分反應生成化合物8和廈黴素A ; (X)標準反應體系中的FAD換成FMN，XiaI換成經過10分鐘沸水浴處理的Xial，化合物3不能反應生成廈黴素A 表示酶反應中的雜質。
具體實施例方式以下實施例是對本發明的進一步說明，而不是對本發明的限制。I.鏈黴菌SCSIO 02999基因組序列掃描及廈黴素A和氧廈黴素的生物合成基因簇序列分析和功能分析 通過對鏈黴菌(Streptomyces sp. ) SCSIO 02999進行全基因組掃描和注釋,在其中找到了 29kb的廈黴素A和氧廈黴素的生物合成基因簇，包含了 22個開放閱讀框(openreading frames, ORFs)(表I )。根據生物信息學分析，其中xiaD、E、F、N和P五個基因可能參與xiamycineA的職類骨架的合成,xiaA、B、I、J、K、L、M和0八個基因編碼氧化還原酶,xiaC、G、H、Q和R則是五個編碼調控子和轉運子的基因。廈黴素A的生物合成途徑初步確定如下(圖2) XiaD, XiaE和XiaF與非甲羥戊酸途徑中的羥甲基丁烯焦磷酸還原酶(IspH)、1_脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶(DXS)和4-羥基-3-甲基丁 -2-烯基磷酸合酶(IspG)具有很高的一致性，而編碼非甲羥戊酸途徑中的另外幾個酶則可以在xia基因簇外的基因組序列中找到，據此推測XiaD、E和F以及一些在xia基因簇外的酶通過非甲羥戊酸途徑提供IPP和 DMAPP, XiaN 催化 IPP 和 DMAPP 縮合形成法尼基焦憐酸(farnesyl-diphosphate, FPP),而XiaP則負責將FPP裝載到吲哚環上，形成3-法尼基吲哚。隨後，3-法尼基吲哚可能通過一個分子內的環化和隨後水解觸發的環化機制形成preindosespene。其中xiaA、B、L編碼的XiaA、B、L蛋白可能組成Rieske [2Fe_2S]型非血紅素鐵氧化酶家族，與具有環氧酶功能的細胞色素P450氧化酶XiaM共同參與分子內環化過程，而檸檬烯-1，2-環氧化物水解酶XiaJ催化水解並觸發環化形成preindosespene。細胞色素P450氧化酶XiaM還能選擇性催化氧化preindosespene的24位碳上的甲基變成羧基,生成中間產物indosespene (3)。口引哚氧化酶XiaI催化indosespene反應生成xiamycine A。氧廈黴素則可能是由XiaI和另外兩個酶XiaK和XiaO共同催化indosespene產生。表I :廈黴素A和氧廈黴素生物合成基因簇的基因及其功能分析基因~~同源蛋白6推測功能
orf(-2)5470x3 (ACP19698, 74/88)FAD (黃素腺嘌呤二核If酸)依賴型氧化還原酶
orf(-l)351SACTE_6109 (AEN13888,72/81)乙醇脫氫酶
XiaA363S CLAY_0024 (EFG05100, 58/72)含有 Rieske2Fe-2S (鐵硫蛋白)結構域加娬_
xiaB164Strvi_6224 (AEM85702,76/84)黃素還原酶
xiaC258Trd_0252 (ACM04610,35/49)IclR 家族的轉錄調控蛋 A
xiaD330Kfla—4244 (ADB33280，72/79)4-羥基-3-甲基-2-T烯S-傷磷酸還原酶
XiaE605Caci_6415 (ACU75269, 63/73)I-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸介_
xiaF383IspG(ZP_08876217, 90/95)4-P^S-3-丨f 基-2-j—烯基-焦磷酸合酶
xiaG240Micau_3829 (ADL47353,55/70)LuxR 家族調控蛋白
xiaH266OrflS (BAD07391,39/59)假定的膜蛋白
xial397Qrf5 (AAY54299,39/55)吲哚氧化_/乙醯 CoA 脫氫酶
XiaJ129Swit_5231 (ABQ71340, 37/53)檸檬烯-I，2-環氧化物水解酶
XiaK596RHAl_ro00538 (ABG92374,52/65)芳香環羥化酶
XiaL77SACE 2838 (CAM02117, 59/68)鐵氧化還原蚩 A
XiaM389Mjls_0508 (ABN96320,47/61)細胞色素 P450 氧化藝
xiaN341HopB (BAC69362,52/63)聚異戊二烯二磷酸
xiaO718SSFG_00177 (EFE64923,52/64)單加氣酶
xiaP335SSNG—07282 (EFL20030, 44/59)聚異戊二烯合成
xiaQ992PlmR5 (AEW92815,41/50)LuxR 家族的轉錄調控蛋白
xiaR924PlmR4 (AAQ84140,33/44)LuxR 家族的轉錄調控蛋內
orfl145bcere00I9_23140 (EEL34460,35/47)鋅金屬蛋白酶
orp508SGM_0166 (EGG49826, 86/91)_假定的鈉耦合通透酶_a胺基酸數目；b括號中包含了同源蛋白的GeneBank登錄號，及與之對應的一致性/ 相似性(identity/similarity)。2.廈黴素A和氧廈黴素的生物合成基因簇的克隆、分析及邊界的確定根據基因組序列注釋和生物信息學分析，以參與廈黴素A骨架合成的羥甲基丁烯基焦磷酸還原酶基因xiaD和異戊二烯二磷酸合酶基因xiaN的序列設計PCR篩選引物，從鏈黴菌SCSIO 02999的基因組文庫2400個克隆中篩選，獲得了 8個陽性克隆，其中的4個用兩對引物能夠同時篩選獲得。這些陽性克隆經酶切分析表明其中兩個cosmid包含了整個廈黴素A和氧廈黴素生物合成基因簇，其他4個cosmid包含部分基因簇(圖3)。生物信息學分析表明，orf (-2)基因編碼FAD依賴的氧化還原酶，orf(-l)基因編碼乙醇脫氫酶，據報導這兩個酶均參與macrolactam的合成，與廈黴素A的生物合成無關。通過建立鏈黴菌SCSIO 02999的遺傳操作體系，構建了 orf (-1)基因滅活的突變株XM31，該突變株經發酵仍舊能夠生產廈黴素A和氧廈黴素，產量與野生型相當，從而確證了 orf(-l)不參與廈黴素的生物合成。由於未能獲得與orf (-1)相鄰的含有Rieske 2Fe_2S (鐵硫蛋白)結構域的加氧酶基因XiaA的滅活突變株XM32，難以確定該基因是否參與廈黴素的生物合成，因此廈黴素生物合成基因簇的左邊界還不是十分確定。滅活編碼短鏈脫氫酶的基因orfl和編碼鈉耦合通透酶的基因orf2，獲得突變株XM50和XM51，兩突變株仍能生產廈黴素A，產量與野生型相當，排除了 orfl基因參與廈黴素A生物合成的可能性。同時，滅活在orfl基因上遊的編碼Lux家族轉錄調節因子的xiaQ和xiaR基因，獲得的突變株XM48和XM49不能生產廈黴素A和氧廈黴素，說明xiaQ和xiaR可能是廈黴素A和氧廈黴素生物合成的負調控因子，與廈黴素A和氧廈黴素合成相關。這些結果表明orfl是廈黴素A和氧廈黴素生物合成基因簇的右邊界(圖4)。因此，廈黴素A和氧廈黴素的生物合成基因簇的邊界的上遊初步確定為xiaA,下遊為xiaR (圖4),該廈黴素A和氧廈黴素的生物合成基因簇的核苷酸序列如SEQ ID NO. I的第2693 26792位的鹼基序列所示。。3.廈黴素A和氧廈黴素的生物合成基因簇中各基因的功能分析在克隆、分析了完整的廈黴素和氧廈黴素的生物合成基因簇，研究了各基因編碼蛋白可能的功能的基礎上，本發明對廈黴素A和氧廈黴素的生物合成機制進行了探討，採用PCR-targeting技術針對20個生物合成基因，進行了滅活突變(檢測引物參見表2，滅活弓丨物參見表3 )，獲得了 XM31，XM33-XM51等20個突變株。表2 :構建突變株所需的檢測引物名稱和序列
權利要求
1.一種廈黴素A和氧廈黴素的生物合成基因簇，其特徵在於，其核苷酸序列如SEQ IDNO. I的第2693 26792位的鹼基序列所示。
2.權利要求I所述的廈黴素A和氧廈黴素的生物合成基因簇在製備廈黴素A及其類似物中的應用。
3.權利要求I所述的廈黴素A和氧廈黴素的生物合成基因簇在製備氧廈黴素及其類似物中的應用。
4.權利要求I所述的廈黴素A和氧廈黴素的生物合成基因簇在製備化合物indosespene及其類似物中的應用。
5.一種編碼吲哚氧化酶/乙醯CoA脫氫酶的基因，其特徵在於，其核苷酸序列如SEQ IDNO. I的第11512 12705位鹼基序列所示。
6.權利要求5所述的編碼吲哚氧化酶/乙醯CoA脫氫酶的基因編碼的吲哚氧化酶/乙醯CoA脫氫酶。
全文摘要
本發明公開了一種廈黴素A和氧廈黴素的生物合成基因簇及其應用。該生物合成基因簇的核苷酸序列如SEQ ID NO.1的第2693~26792位的鹼基序列所示，包含18個基因，具體為負責萜類骨架合成的基因，即xiaD、xiaE、xiaF、xiaN、xiaP共5個基因；氧化還原酶基因，即xiaA、xiaB、xiaI、xiaJ、xiaK、xiaL、xiaM、xiaO共8個基因；編碼調控子和轉運子的基因，即xiaC、xiaG、xiaH、xiaQ、xiaR共5個基因。本發明所提供的包含廈黴素A和和氧廈黴素生物合成相關的所有基因和蛋白信息可以幫助人們理解廈黴素家族天然產物的生物合成機制，為進一步遺傳改造提供了材料和知識。本發明所提供的基因及其蛋白質也可以用來尋找和發現可用於醫藥、工業或農業的化合物或基因、蛋白。
文檔編號C12N15/53GK102732534SQ20121014666
公開日2012年10月17日 申請日期2012年5月11日 優先權日2012年5月11日
發明者張偲, 張光濤, 張慶波, 張海波, 張長生, 朱義廣, 李慧賢, 李蘇梅, 田新朋, 鞠建華 申請人:中國科學院南海海洋研究所