抗體製備方法及所得抗體和抗體庫的製作方法

2023-10-20 22:04:12 1

專利名稱：抗體製備方法及所得抗體和抗體庫的製作方法
技術領域：
本發明涉及篩選和/或製備感興趣蛋白質的特異性抗體的方法。本發明具體涉及一種高通量、低成本和高成功率的方法，其可用於在蛋白質組規模預測感興趣蛋白質的表位，製備其特異性抗體，以及篩選和檢測所產生的抗體。
背景技術：
基因組技術的發展，在基因的層面上為生物功能的研究、疾病的診斷和治療、以及藥物的開發等領域提供了大量的基礎信息。但是對於大多數的生物體系來說，單純的基因信息並不足以闡明其作用機制。此外，如果要利用這些信息以及作用機制來實現應用的目的，如對病理狀況進行鑑定和分析、對藥物的作用機制及效果進行驗證和判斷，則需要更進一步地在蛋白質的層面上獲取更多的信息，例如分析和研究各種蛋白質的結構、功能、表達、定位、修飾、以及相互作用等性質。對蛋白質各種性質的鑑定需要藉助很多的技術手段，如質譜、層析、電泳、晶片以及各種標記技術等，這其中的很多技術手段都需要通過抗原抗體的相互作用來實現。此外，抗原抗體相互作用本身也是非常重要的技術手段，其可以廣泛地應用於科研、醫療以及藥物開發等各個領域，例如治療性抗體藥物的開發等。隨著蛋白質研究的深入進展，對各種抗體乃至抗體庫的需求也日益增加，例如需要針對某物種蛋白組中所有蛋白製備其特異性抗體庫，或者針對某一特定類別的蛋白如激酶、G蛋白受體等製備其特異性抗體等等。但是目前已知的僅僅是針對幾千種蛋白的有限抗體，而且其特異性也滿足不了很多技術手段的需要。因此，能夠針對任何感興趣蛋白快速、高效且大量地製備高度特異的抗體將具有十分重要的意義。目前常用的獲取抗體方法包括雜交瘤技術、重組抗體技術、各種分子展示技術，以及將上述這些技術與高通量的方法結合的技術等。抗體的製備，通常主要是通過天然或重組蛋白或其片段來免疫動物，使動物體內產生能夠特異地識別和結合所述蛋白的抗體。然後根據需要再使用各種技術手段從動物的細胞中獲取抗體，如單克隆抗體或者多克隆抗體等。單克隆抗體的獲取通常需要藉助雜交瘤技術，該方法在免疫動物後，需要取動物細胞進行融合以獲得產生抗體的雜交瘤，再進行克隆建株以產生抗體，隨後再對抗體進行純化和鑑定。根據需要可以再進一步確定其抗原表位。這種產生單克隆抗體的雜交瘤技術最早應用於鼠模型(K6hler和Milstein，Nature vol. 256，1975)，如今已廣泛的應用於各種動物模型，其詳細過程可參見各種教科書和操作手冊的介紹(如 Bazin,「Rat hybridomas andrat monoclonal antibodies」,CRCPress, 1990 ;Goding,「Monoclonal antibodies !principles and practice，，, 3rd edition,Academic Press,1996 ;Shepherd 和 Dean 「Monoclonal antibodies，，Oxford UniversityPreSS，2000等)。此方法雖然目前仍廣泛應用於抗體製備，但其也具有很多缺點，如製備周期很長、製備技術非常複雜、不能夠完全識別表位、以及成本高昂等缺點，而且這種方法也並不能應用於所有的蛋白質，例如對於很多免疫原性低或者具有毒性的抗原來說，這種方法就不適用(SinclairNR (et al，2004)B cel 1/antibody to lerance to our own antigens.Front Biosci 9 :3019-3028)。此外，為獲得具有特異性的單克隆抗體，目前常用的是將化學合成的肽片段偶聯至載體蛋白，然後免疫小鼠。此方法一次得到針對同一蛋白質單一表位的抗體，而由於肽片段本身免疫原性的差異，這種策略的整體成功率不高。特別是對於同源性很高的蛋白，篩選出來的肽的免疫原性很差，很難刺激小鼠機體產生強免疫反應。另一常用策略是採用全長蛋白質或者蛋白 質片段製備免疫原，部分解決了上述問題，但卻又存在蛋白表達整體成功率不高的缺陷(一般表達純化體系為30-70% ) (Thorsten Kohl, ChristianSchmidt,Stefan ffiemann, Annemarie Poustka and Ulrike Korf. Drew, 2003)。對於在所用動物中具有高同源性的蛋白質片段，動物免疫應答一般較弱，製備單克隆抗體的成功率較低(Sinclair NR et al, 2004, Automated productionof recombinant human proteins asresource for proteome research ProteomeScience 2008,6 :4 ;Sinclair NR(2004)Bcell/antibody tolerance to our ownantigens. Front Biosci 9:3019-3028)。重組抗體技術可以與各種分子展示技術相結合，從而針對多種抗原來產生對靶具有高度親和力的抗體，並且可以同步確定抗原表位，因而常用於藥物開發中(ChristineRothe,Stefanie Urlinger,Makiko Yamashita et al. TheHuman Combinatorial AntibodyLibrary HuCAL GOLD Combines Diversification of All Six CDRs According to theN atural Immune System witha Novel Display Method for Efficient Selection ofHigh-Affinity Antibodies. J. Mol. Biol. (2008) 376，1182—1200，2007)。但重組抗體技術的操作複雜，成本高昂，產量較低，而且還經常存在非特異性結合，從而限制了其大規模的應用 ° (Levitan, B. Stochastic modeling and optimization of phage display. J. Mol.Biol. 277,893-916 (1998). Bradbury et al，2004)為提高免疫和篩選效率，可以將上述技術與高通量的方法相結合，例如採用多種免疫原同時免疫並使用晶片技術進行篩選的高通量策略，如CN200510026873. 0所述。但這種免疫策略需要大量高免疫原性的免疫原，這對於難以進行表達和提純的蛋白質或者對於免疫原性很低的蛋白質來說，也是很難實現的。另外傳統的多免疫原同時免疫的方法只能在產生抗體後根據需要再通過特定技術如表位定位(epitope mapping)來被動地確定該抗體所針對的表位(參見GlennE. Morris,「Methods in Molecular Biology Epitope MappingProtocoIs^,Humana Press,1996)。所述表位有時也並非感興趣蛋白質所特有的，通常也可在同物種的很多其它蛋白質中出現，因而所產生的抗體的特異性較低。為解決上面提到的各種問題，需要新的抗體製備和篩選方法，從而能夠針對所有蛋白質高效、快速、低成本的製備和篩選出高度特異的抗體。發明概述本發明提供了一種製備感興趣的蛋白質的抗體的方法，該方法包括(a)預測和/或選擇位於感興趣的蛋白質表面的肽片段；(b)合成或表達一或多個所述肽片段；(c)利用步驟(b)的產物免疫動物，任選組合佐劑進行免疫；(d)用來自步驟(C)的經免疫的動物的淋巴細胞來獲得抗體；(e)用步驟(a)的肽片段和/或天然構象的所述感興趣的蛋白質篩選步驟(d)中所獲得的抗體，得到所述感興趣的蛋白質的抗體庫。在一個實施方案中，本發明的方法可通過如下方法預測或選擇所述步驟(a)中的肽片段(i)根據感興趣的蛋白質的序列，通過計算如下參數來確定表面肽，所述參數選自溶劑可接近性、無序指數、蛋白-蛋白相互作用的結構域預測、或以上任意組合；(ii)將步驟(i)所確定的表面肽與感興趣的蛋白質所來源物種的蛋白質組進行序列比對，篩選出所述感興趣的蛋白質的特異性肽片段；和(iii)將步驟(i)所確定的表面肽與其他物種的同源蛋白質進行序列比對，篩選出所述感興趣的蛋白質的保守序列。 在一個實施方案中，本發明方法步驟(a)中所述肽片段是感興趣的蛋白質的線性表面身份肽和/或構象型表面身份結構域。在一個實施方案中，所述身份肽具有如下特點長度是6-12個胺基酸、高親水性、高抗原性、非信號肽、不位於跨膜區、而位於無序區域。在另一個實施方案中，所述身份結構域是長度為100-500個胺基酸的、預期具有3維結構的序列特異性蛋白質片段。在一個實施方案中，本發明方法步驟(b)通過與增強免疫原性和/或增加拷貝數的蛋白質的融合蛋白的形式重組表達所述一或多個肽片段。在一個實施方案中，所述增強免疫原性和/或增加拷貝數的蛋白質是病毒樣顆粒蛋白質載體。在一個實施方案中，所述病毒樣顆粒蛋白質載體為B肝病毒核衣殼(roc)蛋白。在一個實施方案中，所述一或多個肽片段插入到HBC蛋白的環、N端或C端，例如插入位點位於HBC蛋白的第77和第82位胺基酸殘基之間。在一個實施方案中，通過接頭連接的2-10個肽片段插入到HBC蛋白中。所述接頭可以是(GGGGS)n，其中n為任意整數，例如1、2、3或4。在一個實施方案中，本發明所述方法步驟(b)中一或多個肽片段進一步與免疫增強載體蛋白偶聯。在一個實施方案中，所述免疫增強載體蛋白為匙孔血藍蛋白(KLH)。在一個實施方案中，本發明所述方法步驟(b)中的一或多個肽片段是化學合成的。在一個實施方案中，本發明方法步驟(C)所述的免疫任選組合佐劑進行，例如佐劑選自弗氏完全佐劑、鋁、CpG、或其任意組合。在一個實施方案中，本發明方法步驟(C)的免疫在多位點進行，例如在選自以下位點的至少2個位點進行頸背部、尾根、後足掌、後側腹股溝、前腿腋窩、後腿肌肉。在一個實施方案中，進行多次免疫，時間間隔為2-14，例如3-4天。在一個實施方案中，本發明方法步驟(C)的免疫包含如下步驟(A).首次免疫，在頸背部、尾根、後足掌、後側腹股溝以及前腿腋窩使用步驟(b)表達產物以及弗氏完全佐劑進行免疫；並在後腿肌肉使用步驟(b)表達產物以及鋁+CpG的佐劑進行免疫；(B).第二次免疫，在頸背部、後側腹股溝以及前腿腋窩使用步驟(b)表達產物以及弗氏完全佐劑進行免疫；並在後腿肌肉使用步驟(b)表達產物以及鋁+CpG的佐劑進行免疫；(C).第三次免疫，在後腿肌肉、尾根以及前腿腋窩使用步驟(b)表達產物以及鋁+CpG的佐劑進行免疫；和(D).第四次免疫，在後腿肌肉、尾根以及前腿腋窩使用步驟(b)表達產物以及鋁+CpG的佐劑進行免疫。在一個實施方案中，在第一天進行首次免疫，在第5天進行第二次免疫，在第8天進行第三次免疫，在第11天進行第四次免疫。
本發明方法步驟(d)可以通過至少一種選自如下方法來獲得抗體(1)將來自步驟(C)經免疫的動物的淋巴細胞和骨髓瘤細胞融合，產生雜交瘤細胞並表達從而獲得抗體；(2)從來自步驟(C)經免疫的動物的淋巴細胞中分離出抗原特異性B細胞，再利用PCR來克隆和表達抗體基因從而獲得抗體；或者(3)從來自步驟(C)經免疫的動物的淋巴細胞中分離出mRNA ，然後通過噬菌體展示、或核糖體展示、或酵母展示、或細菌展示、或杆狀病毒展示、或哺乳細胞展示、或mRNA展示來獲得抗體。在一個實施方案中，本發明的方法獲得主要包含單一 IgG亞型的抗體。在一個實施方案中，本發明方法步驟(e)的抗體庫是針對一個物種所有感興趣蛋白質的抗體庫。在另一個實施方案中，本發明方法步驟(e)的抗體庫是包含了針對一種感興趣的蛋白質的所有表位的抗體的抗體庫。在一個實施方案中，本發明方法步驟(e)通過親和力排序篩選步驟(d)中所獲得的抗體。本發明的方法還可以進一步包括篩選功能性抗體或檢測性抗體的步驟(f)。例如，所述檢測性抗體通過Western印跡、IP、IF、IHC、流式細胞計數、ELISA或其任意組合進行篩選；所述功能性抗體通過可阻斷或中和測定來進行篩選。在另一方面，本發明提供了確定感興趣的蛋白質的表位的方法，所述方法包括用上述步驟(a)中所預測和/或篩選的肽片段構建檢測抗原來對所產生的抗體進行篩選以確定表位的步驟。


圖I :多克隆位點設計圖示與核苷酸序列。圖2 :人造HBc圖示。圖3 :H載體結構圖。圖4 4A1抗體Western結果驗證。C2C12細胞以含蛋白酶抑制劑(Roche)的RIPA緩衝液(50mM Tris pH7. 4,150mM NaCl, 1% Triton-X-100，I %脫氧膽酸鈉 0. 1% SDS 裂解液)裂解，SDS-PAGE電泳，然後轉移至PVDF膜，加入I 5稀釋的單克隆抗體細胞株的培養上清，以 ECL Plus (Amersham)檢測。WB western 印跡。圖5 :4A1抗體IF驗證數據。5X IO3個BHK細胞接種到細胞載玻片上於37 °C培養過夜，冰甲醇(_20°C )固定15min，lXPBS洗滌2X3min，l% BSA室溫封閉Ih後，加入單克隆抗體細胞株培養上清I : I室溫孵育I小時，洗滌，加入二抗抗小鼠Dylight549 (Abcam) I 400和DAPI I 4000室溫孵育lh，洗滌，螢光顯微鏡(Olympus)鏡檢拍照。圖6 :針對GPRl 16蛋白獲得的抗體1A6的Western結果驗證。WB western印跡。圖7 :針對Aofl蛋白獲得的抗體2F1的Western結果驗證。WB western印跡。發明詳述除非另有說明，所有技術和科學術語都具有本領域技術人員常見的含義。所有專利，專利申請，公開出版物，GenBank序列，網站以及其他公開材料均全文援引加入本文，除非另有說明。本發明提供了一種製備感興趣的蛋白質的抗體的方法，其能夠高效、快速、低成本地製備所述蛋白質的高度特異性抗體，進而建立覆蓋感興趣的蛋白質表面表位的表位庫以及針對所有表位的抗體庫。本發明還提供了明確抗體所針對的特定表位的方法。本發明提供了一種製備感興趣的蛋白質的抗體的方法，所述方法包括(a)預測和/或選擇位於感興趣的蛋白質表面的肽片段；(b)合成或表達一或多個所述肽片段；(C)利用步驟(b)的產物免疫動物，任選組合佐劑進行免疫；(d)用來自步驟(C)的經免疫的動物的淋巴細胞來獲得抗體；(e)用步驟(a)的肽片段和/或天然構象的所述感興趣的蛋白質篩選步驟(d)中所獲得的抗體，得到針對所述感興趣的蛋白質的抗體庫。如本文所用，術語「感興趣的蛋白質」是指任意的天然蛋白質，或者是經可變剪接(alternative splicing)而得到的天然蛋白質的同種型,或者是天然蛋白質的突變型,或者上述各種蛋白質的任意組合。本文所述「可變剪接」是指在同一個mRNA前體中，通過不同剪接方式(即通過不同剪接位點組合外顯子)而產生不同的mRNA剪接異構體的過程。通過可變剪接所獲得的蛋白質產物互為同種型，其可能會表現出不同功能和結構特性，或者在相同細胞中由於表達水平不同而導致不同表型。本文所述「突變型」是指天然蛋白質通過一或多個胺基酸殘基的取代、缺失或添加所獲得的突變蛋白質。本文所用術語「肽片段」是指所述感興趣的蛋白質中連續或者非連續的胺基酸序列，其可以是連續的線性多肽，也可以是構成結構域構象的非連續多肽的組合。在本發明的一個實施方案中，通過如下方法預測或選擇所述步驟(a)中的肽片段(i)根據感興趣的蛋白質的序列，通過計算如下參數來確定表面肽，所述參數選自 溶劑可接近性、無序指數、蛋白-蛋白相互作用的結構域預測、或以上任意組合；(ii)將步驟
(i)所確定的表面肽與感興趣的蛋白質所來源物種的蛋白質組進行序列比對，篩選出所述感興趣的蛋白質的特異性肽片段；和(iii)將步驟(i)所確定的表面肽與其他物種的同源蛋白質進行序列比對，篩選出所述感興趣的蛋白質的保守序列。在一個實施方案中，步驟(a)中所述肽片段是感興趣的蛋白質的線性表面身份肽和/或構象型表面身份結構域。本文所用術語「表面肽」是指位於天然蛋白質表面的線性肽片段和/或位於蛋白質表面構成結構域構象的非連續多肽的組合。本文所用術語「身份肽(signaturepeptide) 」是指與同物種蛋白質組中的其它蛋白質的序列相比較,感興趣的蛋白質所獨有的線性連續肽序列。本文所用術語「身份結構域(signature domain) 」是指與同物種蛋白質組中的其它蛋白質的結構域相比較，感興趣的蛋白質所獨有的結構域。本文所用術語「表面身份肽」和「表面身份結構域」分別是指位於蛋白質天然構象表面的「身份肽」和「身份結構域」。本文所用術語「溶劑可接近性」是代表蛋白內胺基酸暴露於構像蛋白表面程度的一個指標(參見 Bent Petersen, Thomas Nordahl Petersen, PernilleAndersen MortenNielsen and Claus Lundegaard. A generic method for assignment of reliabilityscores applied to solvent accessibility predictions. BMCStructuralBiology 2009，
9:51)0本文所用術語「無序指數」是代表胺基酸複雜程度的一個參數(參見PredragRadivoj ac，Lilia M. Iakoucheva, Christopher J. Oldfield, ZoranObradovic，VladimirN. Uversky, and A. Keith Dunker. Intrinsic Disorder andFunctional Proteomics.Biophysical Journal Volume 92，1439-1456(2007))。
本文所用術語「蛋白-蛋白相互作用的結構域預測」是指在蛋白與蛋白相互作用時，一些結構域在相互作用中扮演關鍵作用，通過分析蛋白胺基酸組成，可以預測兩個蛋白以何種方式結合，較經典的軟體如Autodock。(參見Bin Liu, Xiaolong Wang,Lei Lin, Buzhou Tang, Qiwen Dong and Xuanffang. Prediction of protein bindingsites in protein structures using hiddenMarkov support vector machine. BMCBioinformatics2009,10 :381)。
本文所用術語「蛋白質組」是指由某物種的基因組、或者某種細胞或組織所表達的所有蛋白質的集合。本發明所述的序列比對可通過本領域已知的各種方法進行，例如使用各種常用軟體或者在線服務來進行，例如由NCBI所提供的BLASP等。本發明所述的預測和/或選擇是指首先基於生物信息學的方法，針對特定的蛋白質，通過二級結構預測、同基因組比較、同源蛋白質結構預測來定義出具有蛋白質特異性且對該蛋白質具有較高覆蓋範圍的身份肽和/或身份結構域以作為潛在的表位。此類生物信息學的方法已廣泛的應用於蛋白結構、功能以及相互作用的預測，如 Berglund L 等人(參見 Protein Science, 17 :606-613, 2008)介紹了針對整個人蛋白質組進行蛋白組層面的特異性表位篩選的方法，其中基於8、10、12胺基酸殘基的滑動窗(sliding window)序列比對,用啟發式(heuristic)方法來針對整個人蛋白質組預測每個人類蛋白質的序列一致性，基於此方法可對90%的人蛋白質找出至少一個特異性表位。Anderson HP 等人(參見 Protein Science, 15 :2558-2567, 2006)介紹了利用蛋白 3D結構數據來預測非連續表位的方法DiscoTope，這種方法基於抗原-抗體蛋白質複合物的X-ray晶體結構所確定的非連續性表位集合來評估胺基酸統計學、空間信息和表面可接近性。Yan CH等人(參見BMC Bioinformatics, 7 :262,2006)介紹了由胺基酸序列來預測潛在的DNA-結合位點的方法，其使用樸素貝葉斯分類器來預測特定的胺基酸序列是否為DNA結合位點。在一個實施方案中，本發明所述的身份肽是長度為6-12個胺基酸、高親水性、高抗原性、非信號肽、非跨膜區以及位於無序區域的肽。在一個實施方案中，本發明所述的身份結構域是長度為100-500個胺基酸、預期具有3維結構的序列特異性蛋白質片段。在一個實施方案中，本發明所述方法步驟(a)預測和/或選擇位於感興趣的蛋白質表面的多個肽片段，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、直至位於感興趣的蛋白質表面的所有可作為潛在表位的肽片段。在一個實施方案中，所述多個肽片段被設計為一個免疫抗原串聯多肽。例如，所述免疫抗原串聯多肽可以如下設計。對感興趣的蛋白質的免疫參數如抗原性、親水性、可接近性、等電點、信號預測、跨膜預測、特異性等參數的設定規則可參見Kolaskar AS等FEBSLett.276(1-2) :172-4,1990 ；Parker JM 等 Biochemistry. 25(19) :5425-32,1986 ；EminiEA等J Virol. 55 (3) :836_9，1985。對於任意一個感興趣的蛋白質，首先根據預測的等電點和信號肽結果排除蛋白質中的這些區域。例如設置一個滑動窗，長度為5-20個胺基酸，在蛋白質上順次移動一個胺基酸，將滑動窗的序列加入一個集合。例如，對於一個長度為n個胺基酸的蛋白質(假設它沒有信號肽和跨膜區)，總共會產生n-9條短肽序列(移動框長度為10個胺基酸)。對每一短肽，計算(可參見Kolaskar AS等FEBS Lett. 276(1-2) =172-4,1990 ；Parker JM 等 Biochemistry. 25(19) :5425-32,1986 ；Emini EA 等 J Virol. 55(3)836-9，1985)它的等電點、可接近性、免疫原性、親水性和根據BLAST方法的種屬內特異性。在等電點大於3. 5時，計算每條短肽的上述參數的加權平均值(0. 2*免疫原性+0. I*可接近性+0. 2*親水性+0. 5*種屬內特異性)。根據加權平均值對這些短肽進行排序，選出分數最大同時肽段間重疊(overlap) < 3的短肽,例如選擇7條短肽。本發明所述肽片段可以通過本領域已知的任何技術獲得，例如重組表達或者化學合成，即本發明所述肽片段可以使用原核或真核表達系統用本領域已知的重組表達方法表達或者所述肽片段可以通過常規化學方法合成。
在一個實例中，例如對於難以進行表達及純化的蛋白質或者具有很低免疫原性的蛋白質，為了製備特異性抗體，利用高免疫原性表達載體、高成功率的可溶蛋白質表達系統輔助產生這些蛋白質的潛在抗原。例如，可以提及的是病毒樣顆粒蛋白載體B肝病毒核衣殼(HBC)蛋白。HBC蛋白質是一種可攜帶各種來源的肽的非感染性類病毒顆粒載體，可用來結合靶肽以產生高效價抗體反應，因而在疫苗製備中廣泛應用。HBC蛋白質可在特定位點如環、N端或C端等攜帶外源胺基酸，可將高達238個胺基酸的外源序列展示在蛋白質表面以促進免疫反應發生。關於HBC載體的詳細描述可參見Good MF等，Science，235 =1059-1063,1987 ;PumpensP 和 Grens E, Intervirology,44 :98-114,2001 ；Clarke BE 等，Nature330 381-384,1987 ；Francis MJ 等，Nature 330 :168-170,1987 ；ffhitacre DC 等 Expert Rev.Vaccines 8:111565-1573,2009。在一個實施方案中，本發明方法步驟(b)中的一或多個肽片段插入到HBC蛋白的環、N端或C端，例如插入到HBC蛋白的第77和第82位胺基酸殘基之間的位置。本發明的多個肽片段例如2-10個肽片段還可以通過接頭連接，然後插入到HBC蛋白中。所述接頭可以是本領域常規使用的任何街頭，例如(GGGGS)n，其中n為任意整數，例如n = 1、2、3或4。例如，在一個實例中，選擇N條免疫原性、特異性較高的肽片段(5彡N彡20)，其長度可以為M(5彡MS 20)個胺基酸。為了避免不同肽片段之間產生新的抗原表位，在不同肽片段之間插入一或多個弱免疫原性接頭GGGGS將所述肽片段串聯到一起。對於不同的蛋白質長度，可以選擇不同的肽片段長度(5 < M < 20)，插入的片段數目可在5-20之間，肽片段的長度例如是6-12胺基酸，片段數目例如是小於10。在本發明的實施方案中，上述步驟(b)中表達的一或多個肽片段還可以進一步與免疫增強載體蛋白偶聯，所述免疫增強載體蛋白例如是匙孔血藍蛋白(KLH)。KLH蛋白是一種源於巨型匙孔帽貝(Megathura crenulata)的攜氧金屬蛋白，其常被用作產生抗體的載體蛋白。其所具有的多個表位以及其與哺乳動物的來源蛋白的差異性使得其成為了良好的用於產生抗體的載體蛋白。關於KLH蛋白的使用可參見Harris JR等，Micron. 30 (6):597-623,1999 以及 WO 2001/047552。本發明步驟(C)所述免疫動物可以通過本領域任何已知方法進行。本發明用來進行免疫的動物可以是本領域常用的動物，例如小鼠、大鼠、兔、棉羊、山羊、馬、牛等。在一個實施方案中，可以使用適當佐劑，從而快速高效地獲得高效價且亞型較單一的抗體。在一個的實施方案中，通過本發明的方法可以獲得主要包含單一 IgG亞型的抗體。本發明所使用的佐劑可選自弗氏完全佐劑、鋁、CpG、或其任意組合。
在一個實施方案中，本發明方法包括對動物進行多位點免疫。利用多位點免疫策略快速產生高親和性抗體的具體方案例如參見Kilpatrick KE等人(Hybridoma 16:
(4)381-389，1997)。通過佐劑來調節抗體的親和性以及亞型的方案例如參見Karagouni L等 Scand. J. Tmmuno1. 31 :745-754,1990 以及 Petty RE 等 Immunology 32 :49-55,1977。本發明所述在多位點對動物進行免疫可以在選自以下位點的至少2個位點進行頸背部、尾根、後足掌、後側腹股溝、前腿腋窩、後腿肌肉。在本發明的一個實施方案中，對動物進行多次免疫。多次免疫之間的時間間隔可以根據本領域常規技術知識確定，例如2-14天，如3或4天。在一個實施方案中，本發明方法步驟(C)所述免疫包含如下步驟(A).首次免疫，在頸背部、尾根、後足掌、後側腹股溝以及前腿腋窩使用步驟(b)表達產物以及弗氏完全佐劑進行免疫；並在後腿肌肉使用步驟(b)表達產物以及鋁+CpG的佐劑進行免疫；(B).第二次免疫，在頸背部、後側腹股溝以及前腿腋窩使用步驟(b)表達產物以及弗氏完全佐劑進行免疫；並在後腿肌肉使用步驟(b)表達產物以及鋁+CpG的佐劑進行免疫；(C).第三次免疫，在後腿肌肉、尾根以及前腿腋窩使用步驟(b)表達產物以及鋁+CpG的佐劑進行免疫；和(D).第四次免疫，在後腿肌肉、尾根以及前腿腋窩使用步驟(b)表達產物以及鋁+CpG的佐劑進行免疫。在更具體的實施方案中，本發明方法步驟(C)的免疫包含如下步驟(A).首次免疫，在頸背部、尾根、後足掌、後側腹股溝以及前腿腋窩使用在250 Ul緩衝液中的20 U g步驟(b)表達產物以及250 U I弗氏完全佐劑進行免疫；並在後腿肌肉使用在500 u I緩衝液中的20 ii g步驟(b)表達產物以及25 ill鋁+10 ii g CpG的佐劑進行免疫；(B).第二次免疫，在頸背部、後側腹股溝以及前腿腋窩使用在250 Ul緩衝液中的
10U g步驟(b)表達產物以及250 U I弗氏完全佐劑進行免疫；並在後腿肌肉使用在500 U I緩衝液中的10 y g步驟(b)表達產物以及25 ill鋁+10 ii g CpG的佐劑進行免疫；(C).第三次免疫，在後腿肌肉、尾根以及前腿腋窩使用在500 Ul緩衝液中的IOu g步驟(b)表達產物以及25 ill鋁+10 ii g CpG的佐劑進行免疫；和(D).第四次免疫，在後腿肌肉、尾根以及前腿腋窩使用在500 Ul緩衝液中的IOu g步驟(b)表達產物以及25 ill鋁+10 ii g CpG的佐劑進行免疫。在一個實施方案中，在第I天進行首次免疫，在第5天進行第二次免疫，在第8天進行第三次免疫，在第11天進行第四次免疫，第14天融合，得到的抗體絕大多數為親和力成熟的IgG亞型，IgG亞型抗體相對於IgM具有親和力高、穩定性好以及易於純化的優勢。本發明方法步驟(d)所述用來 自經免疫的動物的淋巴細胞獲得抗體可以本領域已知的任何方法進行。本文所用術語「淋巴細胞」是指淋巴器官的細胞或者由淋巴器官所產生的細胞，所述淋巴器官包括中樞淋巴器官(又稱作初級淋巴器官)和周圍淋巴器官(又稱作次級淋巴器官)。前者包括胸腺、腔上囊或其相當器官(如哺乳動物的骨髓)，後者包括脾、淋巴結等。
在一個實施方案中，所述抗體通過至少一種選自如下的方法獲得(1)將來自步驟(C)經免疫的動物的淋巴細胞和骨髓瘤細胞融合，產生雜交瘤細胞並表達從而獲得抗體；(2)從來自步驟(c)經免疫的動物的淋巴細胞中分離出抗原特異性B細胞，再利用PCR來克隆和表達抗體基因從而獲得抗體；或者(3)從來自步驟(c)經免疫的動物的淋巴細胞中分離出mRNA，然後通過噬菌體展示、或核糖體展示、或酵母展示、或細菌展示、或杆狀病毒展示、或哺乳細胞展示、或mRNA展示來獲得抗體。雜交瘤技術的詳細介紹可參見Bazin, 「Rat hybridomas and ratmonoclonalantibodies，，，CRC Press, 1990 ;Goding, 「Monoclonal antibodies !principles andpractice」，3rd edition, Academic Press,1996 ；Shepherd 和 Dean 「Monoclonalantibodies」 Oxford University Press, 2000 等文獻。本發明方法步驟(d)也可通過噬菌體展示、或核糖體展示、或酵母展示、或細菌展示、或杆狀病毒展示、或哺乳細胞展示、或mRNA展示來獲得抗體。這些方法均為本領域常用技術，其具體的操作可參考相應的教科書和操作手冊。例如可參見Mondon P等Front.Biosci. 13 :1117-1129, 2008。以噬菌體展示技術為例，其是通過將分離的抗體基因插入到噬菌體DNA中，從而抗體分子上能與抗原結合的可變區域被連接到噬菌體衣殼蛋白上。當噬菌體感染大腸桿菌後，單鏈DNA在大腸桿菌內進行複製，而噬菌體則重新組裝並分泌到培養基中，同時並不裂解大腸桿菌。曬菌體與祀抗原共同溫育，結合的曬菌體分離後，再進行擴增和純化從而能夠篩選出大量克隆。關於噬菌體展示技術可參見劉佳等細胞與分子免疫學雜誌(Chin. J. CellMol. Immunol.) 2004 :20 (6) 773-775、CN03131796. O、WO2009/109572 以及 WO 2009/085462。本發明方法所產生的抗體可以是單克隆抗體，也可以是多克隆抗體。在一個實施方案中，本發明涉及用本發明方法篩選和製備的針對一個物種所有感興趣蛋白質的抗體庫。在另一個實施方案中，本發明涉及用本發明方法篩選和製備的包含了針對一種感興趣的蛋白質的所有表位的抗體的抗體庫。本發明中所用的術語「抗體」、「單克隆抗體」、「多克隆抗體」、「表位」等是本領域所常用的術語，其含義符合本領域技術人員一般的理解，也可以參考常用的教科書和手冊對其的定義。本發明所用的術語「抗體庫」是指包含了多種不同的抗體的一種抗體集合，其可以包含針對多種不同蛋白的抗體，也可以包含針對同一蛋白不同表位的抗體。本發明方法步驟(e)中所述「篩選」是用步驟(a)的肽片段和/或天然構象的感興趣的蛋白質來篩選步驟(d)獲得的抗體。在一個實施方案中，本發明方法步驟(e)通過親和力排序篩選步驟(d)中所獲得的抗體。對抗體進行親和性鑑定的方法可參見Griswold WR等 Immunology letters,1984 :229-232 ；Van Heyningen V 等 Journal of ImmunologicalMethods, 62 :147-153,1983 ；以及 Rath S 等 Journal of Immunological Methods,106 245-249，1988。在一個實施方案中，本發明方法還進一步包括篩選功能性抗體或檢測性抗體的步驟(f)。例如，所述檢測性抗體可以通過Western印跡、IP、IF、IHC、流式細胞計數、ELISA或其任意組合進行篩選，或所述功能性抗體通過可阻斷或中和測定來進行篩選。本文所述檢測性抗體是指可以與抗原反應並且可以通過本領域技術手段例如Western印跡、IP、IF、IHC、流式細胞計數或ELISA等檢測的抗體。本文所述功能性抗體是指可以與抗原反應並且對抗原的生物學功能產生作用例如阻斷或中和等的抗體。例如，通 過如下方法篩選針對所述感興趣的蛋白質的抗體將所述感興趣的蛋白質或其片段生物素化，在真核細胞例如293細胞中過表達，將所述過表達的生物素化蛋白質或其片段加入鏈黴抗生物素包被的平板中，之後加入本發明方法步驟(e)所獲得的抗體進行ELISA測定，獲得反應陽性的抗體。本發明獲得的一種單克隆抗體4A1是由雜交瘤細胞株4A1產生的，所述雜交瘤細胞株4A1於2011年I月28日保藏於中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，保藏號為CCTCCC201107。本發明獲得的另一種單克隆抗體1A6是由雜交瘤細胞株1A6產生的，所述雜交瘤細胞株1A6於2011年I月28日保藏於中國典型培養物保藏中心，保藏號為CCTCC C201108。本發明獲得的一種單克隆抗體2F1是由雜交瘤細胞株2F1產生的，所述雜交瘤細胞株2F1於2011年I月28日保藏於中國典型培養物保藏中心，保藏號為CCTCC C201109。在另一個方面，本發明提供了根據本發明方法獲得的抗體庫。在一個實施方案中，所述抗體庫包含針對所有感興趣蛋白質的抗體。在一個實施方案中，所述抗體庫包含針對位於一種感興趣蛋白質的表面上的所有表位的抗體。在一個實施方案中，所述抗體庫中的抗體是單克隆抗體。在另一個方面，本發明還提供了確定產生的抗體所針對的表位的方法，包括用上述步驟(a)中所預測和/或篩選的肽片段構建檢測抗原來對本發明所產生的抗體進行篩選以確定表位的步驟。本文所用術語「檢測抗原」是指利用上述步驟中所預測和/或篩選的肽片段所構建的融合蛋白，該檢測抗原可用於針對多個蛋白進行篩選，其中針對每個所要篩選的蛋白均含有一個表位。在一個實施方案中，本發明所採用的篩選策略是可以針對N個蛋白質的篩選策略，每個蛋白質設計的表位數和蛋白質數均可以是N個(5 < NS 20)，前提條件是對每種蛋白質所選擇的表位數目一致。例如針對5種蛋白質，每個蛋白質在免疫抗原設計的時候確定了 5個抗原表位，分別以A、B、C、D，E表示(見表I)，例如免疫抗原I的表位分別是Al、BI、Cl、Dl和El。此處表位數和蛋白數均可以是N個(5 < NS 20)。5個蛋白質的檢測抗原採用I列內的五個多肽表位做為一個新的蛋白序列(見表I，例如檢測抗原A包含Al、A2、A3、A4和A5)。在篩選的過程中，每個融合後的陽性克隆孔(採用免疫抗原篩選得到)，分別採用5個檢測抗原篩選，通過典型的ELISA篩選，從而明確每個陽性克隆針對哪個多肽表位。在此結果的基礎上，優先挑取針對每個表位的陽性細胞進行建株和後續鑑定，從而避免在未知表位的情況下，陽性克隆只是針對某個最優勢表位的細胞株最多，造成得到的細胞株的同質性。表I免疫抗原設計方法
I檢測抗原A I檢測抗原B I檢測抗原C I檢測抗原D I檢測抗原E免疫抗原 I|aiIbiIciIdiIei
免疫抗原 2A2B2一 C2一 D2E2—
免疫抗原 3A3B3一 C3一 D3E3—
免疫抗原 4A4B4一 C4一 D4E4—
免疫抗原 5|A5|B5|C5|D5|e5 綜上所述，本發明的方法通過生物信息學技術預測和/或選擇位於感興趣的蛋白質表面的肽片段作為潛在表位。本發明方法可以高效、快速、低成本地獲得針對感興趣的蛋白質的抗體，而且本發明方法可以獲得針對位於感興趣的蛋白質天然構象表面的表位的所有抗體。另外，本發明方法還可以通過組合篩選來確定位於感興趣的蛋白質天然構象表面的表位，鑑定抗體所識別的特定表位，以及進一步對所產生的抗體進行檢測和篩選。對於抗體應用成功的幾個關鍵因素，包括抗體的識別位點(表位)，親和力以及特異性。對於單克隆抗體，在不知道表位的情況下，得到的抗體往往集中於某個免疫原性優勢表位，表位的單一性，會導致抗體應用不成功，主要與該表位的位置有關。明確知道抗體識別的表位，優先得到多個表位的抗體，會降低表位位置不正確的影響，大大提供細胞株應用的成功率。本發明的優勢在於對於大樣本抗體製備，本方法具有成功率高(> 90%以上蛋白能夠得到Western應用成功抗體)，成本低的特點。對於高同源性蛋白質，受體蛋白結構域以及小鼠本身蛋白質均具有很高的成功率。對於小鼠自身蛋白抗體製備的意義在於，從中篩選得到的功能性抗體，可以用於小鼠動物模型的抗體治療試驗，對於臨床前研究具有重要意義。對於膜受體蛋白，採用功能性結構域製備抗體，更有利獲得具有阻斷功能抗體，有利於抗體藥物開發，採用本發明方法構建的抗體文庫，可以用進一步開發功能性抗體。同時高通量的表位篩選策略，保證得到的每個細胞株明確知道對應的識別表位信息，對於研究抗體與蛋白的相互作用，以及採用多個表位抗體共同確定某種蛋白表達信息，均具有很重要意義。以下結合具體實施例對本發明做進一步的闡述。下述實施例僅用於說明本發明，無意對本發明做出任何限制。在不脫離本發明的精神和實質的情況下，本領域人員可以對本發明做出多種改動和變化，這些改動和變化同樣在本申請權利要求要求保護的範圍內。
實施例實施例I :載體改造A、HBC載體改造的設計首先用一段設計好的多克隆位點(MCSGGATCCTATCAGATCTATCGGGTACCGTATCGCGGCCGCTTCCATATGGAATTC(SEQ ID NO :1))來替換B肝病毒核衣殼蛋白(HBc) cDNA 的 c/el 環，即編碼HBc蛋白第76-82位胺基酸的核苷酸。所述MCS的示意圖與序列詳見圖I。然後，將所述MCS的兩端連接編碼L-N和L-C兩個接頭的核苷酸序列並替換編碼HBc蛋白第76-82位胺基酸的核苷酸，其中L-N和L-C兩個接頭兩端的E代表穀氨酸，G代表甘氨酸，S代表絲氨酸。隨後，將編碼6XHis標籤(HHHHHH)、P-gal (MTMITDSL)、接頭(EFH)等序列元件的核苷酸序列添加到此cDNA之前，改造後的HBc核苷酸序列如圖2所示。B、全基因合成用 DNA Works 軟體(得自 http: //helixweb. nih. gov/dnaworks/)通過密碼子優化設計HBc核苷酸序列，如下所示CCATGGGCAGCAGCCACCATCATCACCACCACATGACCATGATCACCGATAGCCTGGAGTTCCATATCGATCCGTACAAGGAATTTGGCGCGACCGTGGAACTGCTGAGCTTCCTGCCGAGCGACTTTTTTCCAAGCGTGCGTGACCTGCTGGATACGGCGAGCGCACTGTATCGTGAAGCGCTGGAAAGCCCGGAACATTGCAGCCCGCATCATACCGCGCTGCGTCAGGCGATTCTGTGCTGGGGCGAACTGATGACCCTGGCGACCTGGGTGGGCGGCAATGAAGAAGGTGGTGGCGGTAGCGGCGGTGGCGGATCCTATCAGATCTATCGGGTACCGTATCGCGGCCGCTTCCATATGGAATTCGGTGGCGGCGGCAGCGGCGGTGGTGGCAGCGAAGAAGACCTGGTTGTGAGCTATGTGAACACCAATATGGGCCTGAAGTTTCGTCAGCTGCTGTGGTTTCATATTAGCTGCCTGACCTTTGGCCGCGAAACCGTGATTGAATACCTGGTGAGCTTTGGCGTGTGGATTCGTACCCCACCGGCGTATCGTCCGCCGAATGCGCCAATTCTGAGCACCCTGCCGGAAACGACCGTTTAAGAGCTCCG TCGACAAGCTTGCGGCCGCACTCGAG(SEQ ID NO 2)優化的HBC核苷酸序列利用下表2所示的引物序列合成，所示引物序列由賽百盛(中國上海)公司合成。表2全基因合成引物序列
權利要求
1.一種製備針對感興趣的蛋白質的抗體的方法，包括 (a)預測和/或選擇位於感興趣的蛋白質表面的肽片段； (b)合成或表達一或多個所述肽片段； (C)利用步驟(b)的產物免疫動物，任選組合佐劑進行免疫； (d)用來自步驟(C)的經免疫的動物的淋巴細胞來獲得抗體； (e)用步驟(a)的肽片段和/或天然構象的所述感興趣的蛋白質來篩選步驟(d)中所獲得的抗體，得到針對所述感興趣的蛋白質的抗體庫。
2.權利要求I的方法，其中所述感興趣的蛋白質是天然蛋白質、和/或其選擇性剪接的同種型、和/或其突變型。
3.權利要求2的方法，其中步驟(a)中所述肽片段是感興趣的蛋白質的線性表面身份肽和/或構象型表面身份結構域。
4.權利要求3的方法，其中所述步驟(a)的肽片段是通過如下方法預測或選擇的 (i)根據感興趣的蛋白質的序列，通過計算如下參數來確定表面肽，所述參數選自 溶劑可接近性、無序指數、蛋白-蛋白相互作用的結構域預測、或以上任意組合； ( )將步驟(a)所確定的表面肽與感興趣的蛋白質來源物種的蛋白質組進行序列比對，篩選出所述感興趣的蛋白質的特異性肽片段； (iii)將步驟(a)所確定的表面肽與其他物種的同源蛋白質進行序列比對，篩選出所述感興趣的蛋白質的保守序列。
5.權利要求4所述的方法，其中所述身份肽是長度為5-20個胺基酸、高親水性、高抗原性、非信號肽、非跨膜區以及位於無序區域的肽。
6.權利要求4的方法，其中所述身份結構域是長度為100-500個胺基酸、預期具有3維結構的序列特異性蛋白質片段。
7.權利要求1-6任一項的方法，其針對一個物種所有的蛋白質來產生抗體庫。
8.權利要求1-7任一項的方法，其中步驟(e)所產生的抗體庫包含針對感興趣的蛋白質的所有表位的抗體。
9.權利要求1-8任一項的方法，其中步驟(d)通過至少一種選自如下的方法而獲得抗體 (1)將來自步驟(c)經免疫的動物的淋巴細胞和骨髓瘤細胞融合，產生雜交瘤細胞並表達從而獲得抗體； (2)從來自步驟(c)經免疫的動物的淋巴細胞中分離出抗原特異性B細胞，再利用PCR來克隆和表達抗體基因從而獲得抗體； (3)從來自步驟(c)經免疫的動物的淋巴細胞中分離出mRNA，然後通過噬菌體展示、或者核糖體展示、或者酵母展示、或者細菌展示、或者杆狀病毒展示、或者不如細胞展示、或者mRNA展示來獲得抗體。
10.權利要求I至9任一項的方法，其中所述步驟(b)的一或多個肽片段以與增強免疫原性和/或增加拷貝數的蛋白質的融合蛋白的形式重組表達。
11.權利要求10的方法，其中所述增強免疫原性和/或增加拷貝數的蛋白質為病毒樣顆粒蛋白載體。
12.權利要求11的方法，其中所述增強免疫原性和/或增加拷貝數的蛋白質為B肝病毒核衣殼(HBC)蛋白。
13.權利要求12的方法，其中所述ー或多個肽片段插入到HBC蛋白的環、N端或C端。
14.權利要求13的方法，其中所述ー或多個肽片段插入到HBC蛋白的位置位於HBC蛋白的第77和第82位胺基酸殘基之間。
15.權利要求12-14任ー項的方法，其中通過接頭連接的2-10個肽片段插入在HBC蛋白中。
16.權利要求15的方法，其中所述接頭是(GGGGS)n，其中η= 1、2、3或4。
17.權利要求16的方法，其中η= I或2。
18.權利要求I至9任ー項的方法，其中所述步驟(b)表達的ー或多個肽片段進ー步與免疫增強載體蛋白偶聯。
19.權利要求18的方法，其中所述免疫增強載體蛋白為匙孔血藍蛋白(KLH)。
20.權利要求I至9任ー項的方法，其中所述步驟(b)的一或多個肽片段是化學合成的。
21.權利要求I至20任ー項的方法，其中所使用的佐劑選自弗氏完全佐劑、鋁、CpG,或其任意組合。
22.權利要求I至21任ー項的方法，其中所述步驟(c)在多個位點免疫動物。
23.權利要求22的方法，其中所述多位點免疫在選自以下位點的至少2個位點進行頸背部、尾根、後足掌、後側腹股溝、前腿腋窩、後腿肌肉。
24.權利要求22或23的方法，其中進行多次免疫，時間間隔為2-14天，例如3_4天。
25.權利要求24的方法，其中步驟(c)中的免疫方案包含如下步驟 (A).首次免疫，在頸背部、尾根、後足掌、後側腹股溝以及前腿腋窩使用步驟(b)表達產物以及弗氏完全佐劑進行免疫；並在後腿肌肉使用步驟(b)表達產物以及鋁+CpG的佐劑進行免疫； (B).第二次免疫，在頸背部、後側腹股溝以及前腿腋窩使用步驟(b)表達產物以及弗氏完全佐劑進行免疫；並在後腿肌肉使用步驟(b)表達產物以及鋁+CpG的佐劑進行免疫； (C).第三次免疫，在後腿肌肉、尾根以及前腿腋窩使用步驟(b)表達產物以及鋁+CpG的佐劑進行免疫； (D).第四次免疫，在後腿肌肉、尾根以及前腿腋窩使用步驟(b)表達產物以及鋁+CpG的佐劑進行免疫。
26.權利要求25的方法，其中在第一天進行首次免疫，在第5天進行第二次免疫，在第8天進行第三次免疫，在第11天進行第四次免疫。
27.權利要求1-27任ー項的方法，其中所產生的抗體為單ー的IgG亞型。
28.權利要求27的方法，其中所產生的抗體為單克隆抗體。
29.權利要求27的方法，其中所產生的抗體為多克隆抗體。
30.權利要求1-29任ー項的方法，其中所述步驟(e)通過親和力排序篩選步驟(d)中所獲得的抗體。
31.權利要求1-30任ー項的方法，進ー步包括篩選功能性抗體或檢測性抗體的步驟(f)。
32.權利要求31的方法，其中所述檢測性抗體通過Western印跡、IP、IF、IHC、流式細胞計數、ELISA或其任意組合進行篩選。
33.權利要求31的方法，其中所述功能性抗體通過阻斷或中和測定來篩選。
34.權利要求1-33任一項的方法，其中所述方法可以針對90%以上的感興趣的蛋白質產生檢測性抗體和/或功能性抗體。
35.一種根據權利要求1-34任一項的方法獲得的抗體庫。
36.權利要求35的抗體庫，其包含針對一個物種所有感興趣蛋白質的抗體。
37.權利要求35的抗體庫，其包含針對位於一種感興趣蛋白質的表面上的所有表位的抗體。
38.權利要求35-37任一項的抗體庫，其中所述抗體是單克隆抗體。
39.權利要求35的抗體庫，其中所述庫包括用於在Western印跡、IP、ELISA、IHC、IF或流式細胞術中檢測感興趣的蛋白質的抗體，和/或用於中和和/或阻斷感興趣的蛋白質的功能的抗體。
全文摘要
本發明提供了一種針對感興趣的蛋白質製備其抗體的方法，其能夠針對所有蛋白質高效、快速、低成本地製備具有高度特異性的抗體，並且能夠明確抗體所針對的表位，進而建立起覆蓋感興趣的蛋白質表面的表位庫以及針對所有表位的抗體庫。這些抗體證明能夠用於檢測，蛋白功能研究和抗體製藥。
文檔編號C07K16/00GK102618940SQ201110034648
公開日2012年8月1日 申請日期2011年1月31日 優先權日2011年1月31日
發明者孟遜, 汪國興, 王小清, 陳澤庸 申請人:艾比瑪特生物醫藥(上海)有限公司