水稻OsCUT1基因的抗旱性基因工程應用的製作方法
2023-10-20 09:56:07 3
專利名稱：水稻OsCUT1基因的抗旱性基因工程應用的製作方法
水稻OsCUTI基因的抗旱性基因工程應用技術領域
本發明屬於基因工程領域，涉及水稻Os⑶Tl基因的抗旱性基因工程應用。 技術背景
超長鏈脂肪酸(very long chain fatty acids, VLCFAs)在生物體中具有廣泛的生理功能，為角質層蠟質的生物合成提供前體物質。角質層是覆蓋在植物地上部分最表層的保護層，由角質和蠟質組成，在植物生長發育、適應外界環境方面起重要作用。乾旱脅迫下，很多植物的表皮蠟質含量都會增加，蠟質含量的高低可能與植物的抗旱性有關。 Aharoni等Q004)在模式植物擬南芥中用激活標籤法篩選出獲得功能性突變體，其抗旱性和乾旱復水後的再生能力顯著提高。進一步分析發現，轉座子激活了一個植物特有的轉錄因子，使得突變體的蠟質含量比野生型高6倍。^iang等000 將豆科植物的一個AP2轉錄因子WXPl基因在苜蓿中過量表達，結果誘導了一些蠟質相關基因的表達，提高了苜蓿的抗旱性，同時轉基因植株葉片的單位面積蠟質含量比野生型約高1/3。Seo等Q011)發現過量表達一個R2R3型MYB轉錄因子基因MYB96能夠促進蠟質合成有關基因的表達，進而促進蠟質的合成，提高轉基因擬南芥的抗旱性。因此，提高了作物葉片角質層的蠟質含量將有助於植物提高抗旱性。
3-酮醯輔酶A合酶(3-ketoacyl-CoA synthase)是超長鏈脂肪酸(VLCFAs)碳鏈延長的限速酶，參與了角質層蠟質的生物合成。擬南芥3-酮醯輔酶A合酶基因CER6/CUT1 是延長CM超長鏈脂肪酸必需的。抑制CER6/CUT1基因導致轉基因植株莖和角果的蠟質嚴重缺失和條件性雄性不育(Millar等，1999)。由此可見，提高3-酮醯輔酶A合酶的產量將有助於促進植株蠟質的積累進而提高植株的抗旱性。因此，本發明提出了利用3-酮醯輔酶 A合酶基因進行植物抗旱性基因工程改良的新方法。發明內容
本發明的目的在於水稻Os⑶Tl基因的抗旱性基因工程應用。
本發明的另一目的是提供含有Os⑶Tl基因的抗旱植物表達載體。
本發明的目的可通過如下技術方案實現
SEQ ID NO. 1所示的水稻3_酮醯輔酶A合酶基因Os⑶Tl的抗旱性基因工程應用。
所述Os⑶Tl基因的抗旱性基因工程應用優選包括如下步驟
1)水稻總RNA的提取；
2)水稻OsCUTl基因的克隆
以步驟1)獲得的總RNA為模板，經反轉錄合成cDNA第一鏈後，以序列如SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 3所示的上、下遊引物進行PCR擴增獲得具有完整編碼區的水稻Os⑶Tl 基因的cDNA序列SEQ ID NO. 1 ；
3)植物表達載體的構建
以步驟2)中獲得的PCR擴增產物為模板，以序列如SEQ ID N0. 4和SEQ ID N0. 5所示的上、下遊引物⑶TS1和⑶TS2經PCR擴增後，將Os⑶T1的cDNA克隆至中間載體 PMD18-T，進一步克隆到植物雙元表達載體pCambia1300S從而獲得插入Os⑶Tl基因的植物表達載體 pCambial300s-0sCUTl ；
4)轉基因植株的獲得
將步驟幻獲得的表達載體pCambial300s-0s⑶Tl轉入農桿菌，進一步轉入水稻， 經PCR，Southern雜交或RT-PCR驗證得到轉OsCUTl基因的水稻。
一種含有SEQ ID NO. 1所示的水稻3_酮醯輔酶A合酶基因Os⑶Tl的抗旱植物表達載體。
利用本發明OsCUTl基因作為目的基因構建植物表達載體，其中可用任何一種啟動子例如花椰菜花葉病毒(CAMV) 35S啟動子、WDiquitin啟動子、Actin啟動子或其它啟動子，該表達載體中必要時可包括增強子，不論是轉錄增強子或翻譯增強子。為了簡化轉化細胞的鑑定可使用選擇性標記包括對抗生素抗性的酶，對除草劑具有抗性的酶，也可利用顏色變化(例如葡糖醛酸糖苷酶GUQ或發光(例如螢光素酶)來識別的化合物的酶類， 也可用無標記選擇。所用的表達載體可使用Ti質粒，Ri質粒，植物病毒載體等。轉化方法可用農桿菌介導法、基因槍法、花粉管通道法或其它方法轉化植物。
本發明的Os⑶Tl基因來自水稻，具有適合於水稻等單子葉植物表達的優化密碼子，其基因工程受體植物除了雙子葉植物，如菸草、大豆、棉花等之外更加適合於水稻、玉米、小麥等單子葉植物。
所述的抗旱植物表達載體優選將SEQ ID NO. 1所示的水稻3_酮醯輔酶A合酶基因Os⑶Tl克隆至植物雙元表達載體pCambial300s的Kpn I和Xba I酶切位點間所得。
所述的抗旱植物表達載體在作物品種改良中的應用。
所述的抗旱植物表達載體在構建具有抗旱能力的轉基因作物中的應用。
有益效果
1、本發明中克隆的水稻3-酮醯輔酶A合酶基因OsCUTl，為水稻中首次克隆的 3-酮醯輔酶A合酶基因。本發明公開了該基因的抗旱性基因工程應用。該基因來自水稻 (Oryza sativa L.)，可作為目的基因導入植物，提高植物抗旱性，以進行植物品種改良，所編碼的蛋白質具有抗旱功能。
2、本發明人提供的OsCUTl基因功能是參與植物的抗旱應答反應，定量反轉錄聚合酶鏈式反應(Real-time RT-PCR)分析表明OsCUTl基因在和模擬乾旱(20%PEG6000)和脫落酸(ABA)誘導條件下表達增強。
圖1、Os⑶Tl基因提高轉基因水稻的耐旱性。
(A)4葉期陽性轉基因水稻植株(Si，S2，S3)和對照植株(WT)停止澆水8天後恢復供水，經恢復供水10天後存活率顯著優於對照組的株系即為耐旱性增強的水稻轉基因株系；(B)乾旱處理後轉基因株系和野生型株系的存活率統計。
具體實施方式
實施例1
1)水稻總RNA的提取選用水稻品種「韭菜青」(太湖流域粳稻地方品種，為強耐鹽品種)，待水稻幼苗長至3-4葉期後，用20% PEG6000或0. ImM ABA進行處理，1小時或 1 後立即取葉片置於液氮中冷凍保存。取部分葉片，用研缽研碎，加入盛有裂解液的1.5mL EP管，充分振蕩後，再移入玻璃勻漿器內。勻漿後移至1.5mL EP管中，抽提總RNA(TRIzol Reagents, Invitrogen, USA)。用甲醛變性膠電泳鑑定總RNA質量，然後在分光光度計上測定RNA含量。
2)水稻Os⑶Tl基因的克隆以獲得的總RNA為模板，按照美國Promega公司提供的反轉錄試劑盒的說明書進行反轉錄，合成cDNA第一鏈。
根據水稻Os⑶Tl基因的全長序列，設計兩端引物上遊引物 ATGCTGCTCCTCAAGGCC (SEQ ID NO. 2)；下遊引物TTAGGCGATTTCGGGGAG (SEQ ID NO. 3)，採用 RT-PCR方法進行cDNA克隆。PCR擴增使用Primestar HS DNA聚合酶連同GC buffer擴增體系(Takara, Dalian, China)。PCR程序如下98°C預變性5分鐘，98°C變性5s，M°C復性 10s，72°C延伸1. 5minJ8個循環後，72°C lOmin，將PCR產物加入普通Tag酶30min，克隆至 PMD18-T載體，測序後獲得具有完整編碼區的水稻3-酮醯輔酶A合酶基因Os⑶Tl的cDNA 序列 SEQ ID NO. 1。
OsCUTl全長1437bp，BioXM軟體分析表明OsCUTl共編碼478個胺基酸，使用BioXM 軟體(版本2. 6)估算其等電點pi = 8. 16，分子量MW = 52. 29KDa。以OsCUTl搜索GenBank 中現有水稻基因組(包括粳稻和秈稻)資料庫，發現OsCUTl為單拷貝基因。
實施例2
設計兩對引物上遊引物:GGTAGCCATCTCCTTCCTCA (SEQ ID NO. 6)，下遊引物: CCTCTCTTCATCCTCCCCTT (SEQ ID NO. 7)，進行實時定量RT-PCR分析OsCUTl基因在水稻幼苗中的表達，以水稻actin基因Racl (McElroy et al,1990)的表達為內參。結果表明，3葉期的水稻幼苗轉移至20% PEG6000溶液後Ih即顯著增強，其表達量約為對照的10倍；類似的，3葉期水稻幼苗在0. ImM脫落酸ABA處理條件下，Os⑶Tl基因的表達在Ih處理後即表達量增加，1 時表達量達到最高，其表達量約為對照的12倍。該實施例表明該基因與植物的乾旱脅迫密切相關。本發明的水稻Os⑶Tl基因為水稻中的首次報導，有望應用於植物尤其是單子葉植物的抗旱性遺傳改良。
實施例3
根據水稻OsCUTl基因的cDNA序列，設計擴增出完整編碼閱讀框的引物，並在上遊引物上引入KpnI限制性內切酶位點，下遊引物引入了 ^CbaI限制性內切酶位點上遊引物CUTSl iAGGTACCATGCTGCTCCTCAAGGCC (SEQ ID NO. 4)，下遊引物:CUTS2 ATCTAGATTAGGCGATTTCGGGGAG (SEQ ID NO. 5)，以實施例1中獲得的PCR擴增產物為模板，經 PCR擴增後，將Os⑶Tl的cDNA克隆至中間載體pMD18_T，進一步克隆至植物雙元表達載體 pCambia1300S的Kpn I和)(ba I酶切位點之間；將獲得的表達載體轉入農桿菌，進一步轉入水稻，對獲得的轉基因植株進行使用PCR引物(SEQ ID N0. 6和SEQ ID N0. 7)進行RT-PCR 驗證後進行植物的抗旱性評價，轉基因植株的T3代和對照植株進行耐旱性分析。將經檢測獲得的4葉期陽性轉基因水稻植株和對照植株停止澆水8天後恢復供水，經恢復供水10 天后存活率顯著優於對照組的株系即為耐旱性增強的水稻轉基因株系(圖1)。經檢測，恢復供水10天後，野生型水稻的存活率為對％，轉基因株系的存活率則分別為100% (Si)，85.7% (S2)以及100% 6；3)(圖1)。本實施例表明該基因與過量表達後能夠提高轉基因植株抗旱性，適合於水稻、玉米、小麥等作物的抗旱性遺傳改良。
權利要求
1.SEQ ID NO. 1所示的水稻3-酮醯輔酶A合酶基因Os⑶Tl的抗旱性基因工程應用。
2.根據權利要求1所述的應用，其特徵在於包括1)水稻總RNA的提取；2)水稻Os⑶Tl基因的克隆以步驟1)獲得的總RNA為模板，經反轉錄合成cDNA第一鏈後，以序列如SEQ ID NO. 2 和SEQ ID NO. 3所示的上、下遊引物進行PCR擴增獲得具有完整編碼區的水稻Os⑶Tl基因的 cDNA 序列 SEQ ID NO. 1 ；3)植物表達載體的構建以步驟2)中獲得的PCR擴增產物為模板，以序列如SEQ ID NO. 4和SEQ ID NO. 5所示的上、下遊引物⑶TSl和⑶TS2經PCR擴增後，將得到的Os⑶Tl基因的cDNA克隆至中間載體PMD18-T，並通過Kpn I和Xba I酶切位點進一步克隆到植物雙元表達載體pCambial300s 從而獲得插入OsCUTl基因的植物表達載體pCambial300s-0sCUTl ；4)轉基因植株的獲得將步驟幻獲得的表達載體pCambia1300S-0S⑶Tl轉入農桿菌，進一步轉入水稻，經 PCR、Southern雜交或RT-PCR驗證得到轉OsCUTl基因的水稻。
3.一種含有SEQ ID NO. 1所示的水稻3-酮醯輔酶A合酶基因Os⑶Tl的抗旱植物表達載體。
4.根據權利要求3所述的抗旱植物表達載體，其特徵在於是將SEQID NO. 1所示的水稻3-酮醯輔酶A合酶基因Os⑶Tl克隆至植物雙元表達載體pCambia1300S的Kpn I和)(ba I酶切位點間所得。
5.權利要求3或4所述的抗旱植物表達載體在作物品種改良中的應用。
6.權利要求3或4所述的抗旱植物表達載體在構建具有抗旱能力的轉基因作物中的應用。
全文摘要
本發明屬於基因工程領域，涉及水稻OsCUT1基因的抗旱性基因工程應用。OsCUT1基因序列如SEQ ID NO.1所示，該基因來自水稻(Oryza sativa L.)，編碼水稻超長鏈脂肪酸碳鏈延長的限速酶3-酮醯輔酶A合酶，參與了角質層蠟質的生物合成。mRNA表達分析表明該基因受脫落酸和乾旱脅迫的顯著誘導。通過總RNA的提取、OsCUT1基因的克隆、植物表達載體的構建以及水稻轉基因研究，獲得了耐旱性顯著增強的轉基因水稻株系。OsCUT1基因可作為目的基因導入植物，顯著提高轉基因植物的抗旱性。
文檔編號C12N15/82GK102517305SQ20111041348
公開日2012年6月27日 申請日期2011年12月13日 優先權日2011年12月13日
發明者唐海娟, 孫姝璟, 張曄, 張紅生, 王州飛, 王建飛, 鮑永美, 黃驥 申請人:南京農業大學