作為載體的新的融合蛋白質的製作方法

2023-10-20 03:43:52 3

專利名稱：作為載體的新的融合蛋白質的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種稱為新的載體的融合蛋白質，其用於將分子輸送進入細胞。
背景技術：
輸送遺傳物質進入哺乳動物細胞在治療及商業等方面的重要性與日俱增。例如，基因療法已用於修正先天或遺傳的基因缺陷、癌症、及病毒感染。在人類中表達人工基因的能力促進了許多人類主要疾病的預防及/或治療，包括許多藉由其它療法的治療無法矯正的疾病。然而，生物膜系生物系統中區隔的重要天然屏障。因此，一般認為多肽及寡核苷酸在治療上的價值有限。為克服輸送此類多肽及寡核苷酸的問題已進行了諸多研究。
初期的工作大多著眼於使用逆轉錄病毒載體轉化此類細胞。然而，據報逆轉錄病毒有諸多缺點。例如不易感染某些細胞類型。典型地，逆轉錄病毒系經由受體進入細胞，因此若此類受體不存在於細胞上，或存在數量不大，則感染便不可行或效率不佳。
許多研究人員發展出用於輸送多肽及寡核苷酸進入細胞的脂質粒(liposome)系統。脂質粒是由膜包圍形成的小球，其內含有適當的DNA。然而，此系統亦有先天的問題。脂質粒的大小很難控制，因此輸送至個別細胞的均一性亦難以控制。此外，難以防止脂質粒內容物的滲漏，因此如同其它技術一樣，難以對細胞類型具專一性。
最近發展出數種稱為蛋白質轉導結構域(protein transductiondomain，PTD)的蛋白質小區域以運送分子進入細胞(Fisher等人，Bioconjugate Chem.，Vol.12，No.6,2001年)。此類PTD可自由地轉位(translocate)通過細胞膜而不需依靠受體、轉運蛋白(transporter)，不會飽和，且不消耗任何能量。PTD可在一小時內穿越細胞膜屏障。製造、分離及利用TAT-融合蛋白質以影響哺乳動物細胞的基本需求見Becker-Hapak等人所述(Methods 24，247-256，2001年)。Steven等人合成了一系列合成PTD，其α-螺旋成分經加強且精氨酸殘基配置經最佳化。數個PTD 相對於TAT具有顯著增進的蛋白質轉導能力(Steven等人，Cancer Research 61，474-477，2001年1月15日)。另外，USP 6,090,619描述了一種新的非病毒載體的製備，其可結合所需DNA以形成可用於轉染人類或動物細胞的病態線粒體的組合物。USP 6,339,139提供了一種結合至生長因子受體的基因輸送系統，包含一由配體寡肽/聚陽離子多肽/內體釋出寡肽/外源DNA組成的4-元複合物基因輸送系統，或由配體寡肽/聚陽離子多肽/外源DNA組成的3-元複合物。
本領域的輸送載體系統面臨了下述之一或多個障礙。第一，將病毒載體及陽離子脂質粒注射入活動物體內時會誘發免疫反應。第二，細胞的胞外液體如同血流般，會稀釋或最終消化所載基因，導致所輸送的基因喪失。第三，雙層磷脂質的細胞膜形成天然屏障，阻止核苷酸分子進入。因此，大分子如DNA基因無法以自由(主動或被動)輸送的方式穿越細胞膜，以輸送外來DNA所載基因進入細胞內。第四，膠狀的細胞質環境中富含蛋白酶及/或核酸酶，在其中藉內體陷阱(trapping)機制降解DNA所載基因。第五，細胞質中的載體-DNA載貨遭遇第二重屏障——核膜。DNA所載基因須通過核膜並於基因可作用的細胞核中釋出該DNA所載基因。第六，即使DNA所載基因能夠進入細胞膜，輸送效率仍低。
鑑於上述障礙，需開發一種可有效輸送所需分子進入細胞或細胞核的輸送系統。

發明內容
本發明涉及一種用於將所需分子輸送進入細胞或細胞核的融合蛋白質，包括i)一冷休克結構域及其同源物或功能等價衍生物，及ii)一膜轉位序列或其功能等價肽及/或其衍生物。


圖1所示為構建編碼本發明融合蛋白質的基因rTAT-CspA的簡化流程圖。通過PCR以引物1及2由大腸桿菌擴增CspA基因，並藉由插入編碼逆向形式(reversed form)TAT-PTD肽序列的經退火合成寡核苷酸1及2而獲得雙鏈DNA/RNA結合能力，將該序列導入CspA基因後將所得的本發明經修飾基因(rTAT-CspA)亞克隆進入pET28a表達載體中。
圖2所示為構建編碼本發明融合蛋白質的基因(SPKR)4-iTAT-CspA的簡化流程圖。通過PCR以引物1及2由大腸桿菌擴增CspA基因，並藉由插入編碼DNA濃縮序列(SPKR)4的經退火合成寡核苷酸3及4而獲得雙鏈DNA/RNA結合能力，進一步通過PCR擴增以引物3及4於經修飾的CspA基因中導入PTD序列，然後將所得的本發明經修飾基因亞克隆進入pET28a表達載體中。
圖3表示融合蛋白質的誘導及純化，其依據製造商指示進行，純化的蛋白質於5％至15％SDS-PAGE上分析並以考馬斯藍(coomasieblue)染色凝膠；道1為pET28a/融合蛋白質的全細胞裂解物；道2為pET28a/融合蛋白質經超聲波處理(sonicate)上清液1；道3為pET28a/融合蛋白質經超聲波處理上清液2；道4為pET28a/融合蛋白質經超聲波處理沉澱物；道5為鎳-珠親和層析法所得流通級份；道6為於1x結合緩衝液中含有20mM咪唑的洗滌級份；道7為溶析1的級份，含有；道8為溶析2的級份，於溶析緩衝液中含有60mM咪唑；道9為購自Amersham-Pharmacia公司的分子量標記物；道10為純化的iTat蛋白質(0.25μg)；及道11為純化的rTat蛋白質(1.0μg)。
圖4表示凝膠阻滯分析法(gel retardation assay)。將0.5μg報告質粒pEGFP-N1(購自Clontech公司)與不同量的蛋白質載體(rTAT-CspA或iTAT-CspA)共置於1x PBS緩衝液中。於室溫下放置30分鐘後，於1％瓊脂糖凝膠(1x TBE)上分離DNA-蛋白質複合物並以EtBr染色凝膠。
圖5表示分別以下列轉染的Hela細胞的綠色螢光蛋白質表達(1)沒有DNA質粒(左圖)，(2)rTAT-CspA-pEGFP-N1複合物(中)，及(3)(SPKR)4-iTAT-CspA-pEGFP-N1。將DNA-蛋白質複合物與細胞置放1小時後，添加0.45mL含血清的DMEM肉湯培養基並於37℃培養6小時，然後添加1mL含血清的DMEM肉湯培養基，細胞再於37℃培養24小時並於螢光顯微鏡下檢查EGFP基因表達。
圖6表示經本發明融合蛋白質載體iTAT-CspA-pEGFP-N1複合物轉染的小鼠胚胎的綠色螢光蛋白質表達。分別以0.75μg DNA質粒pcDNA3.1(左圖)或pEGFP-N1報告DNA質粒及本發明蛋白質載體iTAT-CspA(右圖)轉染整區移除的小鼠胚胎。置放一段時間後，於螢光顯微鏡下檢查綠色螢光蛋白質表達。
圖7表示肝臟的冷凍組織切片，其為得自以i.p.注射本發明蛋白質載體rTAT-或iTAT-CspA-pEGFP-N1 DNA複合物處理的小鼠。48小時後處死小鼠，然後以共聚焦雷射掃描顯微鏡(confocal laserscanning microscope，Leica公司)檢查肝臟中的綠色螢光蛋白質表達。
圖8表示電泳遷移率分析法(EMSA)，其使用本發明蛋白質、rTAT及人類5S rRNA進行。
具體實施例方式
現代生物科技完全建立於DNA基因輸送平臺的基礎上，例如體細胞基因療法(包括纖維囊腫、胰島素缺乏性糖尿病及甲型及乙型血友病等)及轉基因動物。為得到更為有效、經濟及安全的基因輸送載體，以達改進人類保健的目標，需要所有這些研究領域及具商業重要性的議題。
本發明提供一種用於作為載體的新的融合蛋白質。本發明的載體為非病毒性載體，其可與所需核酸結合併有效地將其輸送至任何生物體中，如動物、細胞株及胚胎。其可以最少成本大量生產，並廣泛地應用於各種領域，如轉基因動物及基因療法。
本發明的重組融合蛋白質此處所用的「融合蛋白質」係指編碼標的多肽的第一胺基酸序列與界定一併非且實質上不同源於標的蛋白質的任何結構域的結構域(如多肽部分)的第二或更多胺基酸序列的融合。
本發明提供一種用於輸送所需分子進入細胞或細胞核的融合蛋白質，包括i)一冷休克結構域及其同源物或功能等價衍生物，及ii)一膜轉位序列或其功能等價肽及/或其衍生物。
冷休克結構域依據本發明，任何適用的冷休克結構域及其同源物或功能等價衍生物皆可用於本發明的融合蛋白質。選擇冷休克結構域(CSD)的原因可完全由下列優點闡明(1)CSD系一普遍保守性的核酸結合結構域，普遍存在於原核及真核生物界中，因此其有助於減少免疫反應或甚至將此風險降至零。因此，CSD系構建基因輸送蛋白質載體的最佳選擇，因為CSD不會在接受基因輸送載體的宿主中引起巨大的免疫反應。(2)CSD固有的核酸結合性質可容忍細胞內外不同的Na+/K+離子分布，亦即CSD不太可能會在輸送過程中喪失所載基因，而可達到高效的基因輸送。及(3)近來Lescar等人提出α病毒、黃病毒的外鞘糖蛋白採β桶型結構以插入宿主細胞的細胞膜，因此融合發生多肽與CSD的框架內(in-frame)融合可避免落入內體或直接與細胞膜融合(Lescar，J.，Roussel，A.，Wein，M.W.，Navaza，J.，Fuller，S.D.，Wengler，G，及Rey，F. A.(200 1)The fusion glycoprotein shell of Semliki Forestvirusan icosahedral assembly primed for fusogenic activation atendosomal pH.Cell 105，137-148。及Kuhn，R.J.等人，Cell 108，717-725，2002)。
CSD的結構已經充分定性，為一反向平行的5股β桶型結構(稱為OB-摺疊)。因此，具有類似於CSD結構的OB-摺疊家族可用於本發明的融合蛋白質。許多研究結果指出CSD可與單股核酸結合。例如冷休克結構域周邊表面上的RNP-1及RNP-2 RNA結合基序(motif)及苯丙氨酸、賴氨酸殘基可與單股DNA、RNA結合(Bycroft等人，Cell Vol.88，235-242，1997年1月24日)。Izumi等人指出Y-盒結合蛋白質-1可與單股核酸結合(Nucleic Acids Research，2001，Vol.29，No.5，1200-1207)。優選地，該冷休克結構域系選自由CspA、CspB、CspC、CspD、rpl S1 RNA結合結構域、真核生物的Y-盒蛋白質、DNA結合蛋白質B(DBPB)、DBPA、EF-1、mRNP3、mRNP4、FRG Y1及核酸酶敏感組件結合蛋白質1(NSEP1)所組成的組。更優選地，該冷休克結構域系選自由CspA、rpl S1 RNA結合結構域、人類YB-1及DNA結合蛋白質B所組成的組。
應了解本發明的CSD並不限於以上所例舉的種類，而亦包括由任何其它來源所得的同源序列。依據上述揭示，本領域技術人員應可理解任何可與核酸結合的CSD同源物均可用於本發明的融合蛋白質。
依據本發明，CSD及其同源物的功能等價衍生物亦可用於本發明的融合蛋白質。CSD或其同源物可經修飾以與雙鏈核酸結合。CSD及其同源物的「功能等價衍生物」包括重組產生或化學合成的多肽分子，其以類似於參考分子的方式作用以達所需結果。因此，CSD及其同源物的功能等價衍生物包含衍生物其包括任何發生於內部或胺基或羧基端的單或多個胺基酸添加、取代及/或刪除，及包括任何修飾如插入DNA結合結構域或DNA濃縮結構域。亦以證明CSD可經修飾以與雙鏈DNA或RNA結合。例如Wang等人發現將CspA的冷休克結構域以其真核生物的對應物YB-1蛋白質的正電荷胺基酸予以結構域置換而修飾，可導致雙鏈DNA結合能力(Wang等人，Mol.Microbiology，38(3)526-534，2000)。
依據本發明，CSD經修飾以得到具有雙鏈RNA/DNA結合能力的衍生物，其可藉由將DNA濃縮結構域或DNA結合結構域插入CSD中而達成。DNA濃縮結構域可結合更多DNA，及/或使DNA分子濃縮形成核小體(nucleosome)結構，其對Dnase消化具抗性而可使用較少量融合蛋白質。依據本發明，任何可修飾冷休克結構域/核糖體蛋白質S1，使的可與雙鏈DNA結合的適合DNA濃縮或結合結構域均可用於本發明。例如，適合的DNA濃縮或結合結構域為得自組蛋白(histone)的DNA濃縮結構域(SPKR)3-4、高移動性族組(HMG)蛋白質、或富含正電荷胺基酸如精氨酸、賴氨酸的細胞核定位序列(NLS)，例如SV40大T抗原、Myc、YB1蛋白質及其它推算的NLS。
膜轉位序列依據本發明，融合蛋白質的膜轉位序列為能夠在稱為蛋白質轉導的過程中有效穿越生物膜者，如蛋白質轉導結構域(PTD)及膜融合序列及其功能等價肽或衍生物。已知蛋白質轉導並非以傳統的受體-、轉運蛋白-或內體-介導的方式發生。膜轉位序列可迅速而有效地轉導分子進入細胞。膜轉位序列的實施例示於下表序列名稱(序列來源)蛋白質轉導結構域RQIKIWFQNRRMKWKK(SEQ ID NO1) Pantp(43-58)(Penetratin)Kkwkmrrnqfwvkvqr(SEQ ID NO2) Retro-inverso pAntp(43-58)RRWRRWWRRWWRRWRR(SEQ ID NO3) W/R PenetratinRRMKWKK(SEQ ID NO4)Pantp(52-58)GRKKRRQRRRPPQ(SEQ ID NO5) HIV TATYGRKKRRQRRR(SEQ ID NO6)HIV TATrrrrrrr(SEQ ID NO7)R7Asp-Ala-AlaOThr-Arg-Ser-Ala-Ala-Ser-Arg-Pro-Thr-Glu VP22(267～300)-Arg-Pro-Arg-Ala-Pro-Ala-Arg-Ser-A1a-Ser-Arg-Pro-Arg-Arg-Pro-Val-Glu(SEQ ID NO8)Membrane Fusion SequenceGALFLGWLGAAGSTMGA(SEQ ID NO9) Gp41融合序列GALFLGFLGAAGSTMGAWSQPKSKRKV MPG(gp41融合序列-SV40NLS)(SEQ ID NO10)MGLGLHLLVLAAALQGAWSQPKKKRKV 寬吻鱷Ig(v)輕鏈-SV40NLS(SEQ ID NO11)PLSSIFSRIGDP(SEQ ID NO12) PreS2-TLMFWRGDLVFDFQV(SEQ ID NO13) VP3核心蛋白質KFTIVFPHNQKGNWKNVPSNYHYCP(SEQ ID NOVSV-G肽14)AKRARLSTSFNPVYPYEDES(SEQ ID NO15) Ad纖維GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL Transportan(SEQ ID NO16)RGGRLSYSRRRFSTSTGR(SEQ ID NO17)SynB1AAVALLPAVLLALLAP(SEQ ID NO18) MPS(Kaposi FGF訊號序列)AAVLLPVLLAAP(SEQ ID NO19) MPS(Kaposi FGF訊號序列)VTVLALGALAGVGVG(SEQ ID NO20) MPS(人類整合素β3訊號序列)VAYISRGGVSTYYSDTVKGRFIRQKYNKRA(SEQ P3ID NO21)KLALKLALKALKAALKLA(SEQ ID NO22) 模型兩性肽WEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALKACEA KALA(SEQ ID NO23)本發明的一優選實施方案為提供一用於輸送所需分子進入細胞或細胞核的融合蛋白質，包括i)一冷休克結構域及其同源物或功能等價衍生物，及ii)一膜轉位序列或其功能等價肽及/或衍生物。本領域已知PTD可輸送核酸穿越細胞膜及核膜。藉由結合CSD及PTD，本發明的融合蛋白質可成功地輸送所需核酸至細胞質或細胞核。研究已發現數種PTD及其特性、特徵及功效(Fischer等人，BioconjugateChem.，2001，Vol.12，No.6，825-841；Lindgren等人，Tips，2000年3月，Vol.21；Becker-Hapak等人，Methods 24，247-256，2001；及Ho等人，Cancer Research 61，474-477，2001年1月15日)。例如，Tat系一種86至102個胺基酸長度(取決於病毒品系)的轉錄活化因子，並涉及HIV的複製。最小的Tat轉導結構域為基本殘基49至57。VP22，一種來自單純泡疹病毒-1的38-kDa結構性蛋白質，具有細胞間傳輸的優異特性。最小的VP22轉導結構域為基本殘基267至300。Antp為一果蠅類似(homeotic)轉錄因子，由三個α-螺旋及位於螺旋2及3的間的β-轉折所組成。Antp的第三個α-螺旋(殘基43至58)系轉導所需者。
優選地，PTD系選自由SEQ ID NO1至8所組成的組。更優選地，PTD系選自由SEQ ID NO1、2、4、5、6及7所組成的組。
本發明另一實施方案系提供一用於輸送所需分子進入細胞或細胞核的融合蛋白質，包括i)一冷休克結構域及其同源或功能等價衍生物。本領域亦已知膜融合序列可將分子轉位至細胞膜。藉由結合CSD及膜融合序列，本發明的融合蛋白質可輸送所需核酸至細胞質。為輸送所需核酸至細胞核，該融合蛋白質須進一步包含一膜定位序列。例如，一代表性膜融合序列為PreS2-TLM。PreS2系一穿透性肽，其轉位基序稱為PreS2-TLM。PreS2-TLM對應於一介於PreS2蛋白質的殘基41及52間的兩性(amphipathic)α-螺旋。該肽似乎可穿透各種細胞，包括植物細胞。優選地，該膜融合序列系選自由SEQ ID NO9至23所組成的組。更優選地，該膜融合序列系選自由SEQ ID NO9、10、11、12、13、17、19、20及21所組成的組。
蛋白質純化標識序列依據本發明，該融合蛋白質可進一步包含蛋白質純化標識序列。依據本發明，該純化標識序列只是該融合蛋白質的選擇性組件，僅用於蛋白質純化。本發明的融合蛋白質可通過化學純化技術予以純化。例如，含Tat-PTD的蛋白質可通過肝素管柱純化(Hakansson等人，Protein Science(2001)，102138-2139)。再者，DNA柱亦可用於純化本發明的融合蛋白質。
依據本發明，該蛋白質純化標識序列可融合於基因輸送蛋白質載體的N-或C-端。優選地，該蛋白質純化標識序列系選自由HA、GST、His6標記所組成的組。更優選地，該蛋白質純化標識序列為His6標記。
本發明融合蛋白質的製備本發明融合蛋白質可通過在適於表達該蛋白質的條件下培養經重組載體轉化的宿主細胞，及純化藉此產生的蛋白質而製造的。
本發明可使用適於表達依據本發明的融合蛋白質的DNA構建體，亦即重組DNA分子。為表達本發明蛋白質，將該DNA構建體轉殖入一表達本發明融合蛋白質的表達載體中。該表達載體當然系依據選定用於表達該蛋白質的宿主細胞的本質而選擇的。適合的此類表達載體可在市面購得。當適合的表達載體系原核生物表達載體，如由Novagen公司所提供的pET系統細菌質粒時，表達較佳繫於原核生物宿主中進行，更佳繫於微生物宿主中，特別是大腸桿菌。
本發明融合蛋白質的應用本發明提供一種作為輸送載體的融合蛋白質。本發明的融合蛋白質在體外，及特別是體內，具有高轉染效率而可輸送基因進入細胞、胚胎及活體動物中。由該融合蛋白質所進行的基因輸送可以物種特異性，甚至個體特異性的方式進行。因此，本發明的融合蛋白質在基因療法及轉基因動物的製造上系有效的工具。
下列實施例僅供例示而非設限。
實施例實施例1本發明融合蛋白質的克隆及構建挑選單一菌落的DH5α品系大腸桿菌，然後添加100μl滅菌水。將所得溶液煮沸5分鐘。短暫離心後，取10μl的份量用作以聚合酶鏈反應(PCR)擴增CspA基因的模板。使用引物1及引物2由大腸桿菌擴增CspA基因。引物1及引物2的序列如下引物15』-gctagcATGTCCGGTAAAATGACTGGTATCGTAAA-3』引物25』-ctcgagATTACAGGCTGGTTACGTTA-3』(小寫字母表示NheI切割處。下標線小寫字母表示XhoI切割處。)進行25個PCR循環後(退火溫度設定於55℃，1分鐘)後，以1.2％瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產物，然後以QIAquick PCR產物純化試劑盒(QIAGEN公司)純化。純化的PCR產物克隆入pGEM-T載體中(Promega公司)並依製造商的技術手冊指示篩選重組質粒，獲得pGEM(T)/CspA質粒，然後以DNA測序加以確認。因此，通過在本發明冷休克結構域中插入DNA濃縮或結合結構域，將該冷休克蛋白質A(CspA；冷休克結構域)進一步修飾以用於結合雙鏈核酸。融合蛋白質I最簡單形式的融合蛋白質，包含由TAT及CSD而來的NLS+/PTD組合，稱為rTAT(見圖1)。該DNA結合/NLS+/PTD，Tat肽序列的反向形式(rTAT)，系由下列合成寡核苷酸所編碼寡核苷酸(1)5』-taTGGGTCGCCGTCGTCAACGTCGTAAAAAGCGCCGTT-3』寡核苷酸(2)5』-ctagAACCGCGCTTTTTACGACGTTGACGACGGCGACCCA-3』融合蛋白質II第二種形式的融合蛋白質包含由TAT及(SPKR)4及CSD的DNA濃縮序列而來的NLS+/PTD組合，稱為(SPKR)4-iTAT-CspA(見圖2)。該DNA濃縮序列，(SPKR)4，系由下列合成寡核苷酸所編碼寡核苷酸(3)5』-taTGGGCTCTCCTAAACGCTCTCCTAAACGCTCTCCTAAACGCTCTCCTAAACGTGGTT-3』寡核苷酸(4)5』-ctagAACCACGTTTAGGAGAGCGTTTAGGAGAGCGTTTAGGAGAGCGTTTAGGAGAGCCCA-3』分別混合100pmol寡核苷酸(1)及寡核苷酸(2)或寡核苷酸(3)及寡核苷酸(4)，並於95℃加熱5分鐘。退火的雙鏈寡核苷酸緩慢冷卻至4℃並於-20℃下貯存過夜。依製造商的建議指示以T4多核苷酸激酶(購自Amersham公司)及ATP標定退火的雙鏈寡核苷酸的5』-端。於37℃下靜置1小時後，以熱滅活化停止反應，然後以苯酚氯仿異戊醇(isoamyloalcohol)(v/v/v＝25∶24∶1；Applichem公司)萃取。以糖原(glycogen；Roche公司)及冷無水乙醇(Merck公司)沉澱退火的雙鏈寡核苷酸。
以T4 DNA連接酶(New England Biolab.公司)分別將編碼Tat肽序列的反向形式(rTAT)或DNA濃縮序列(SPKR)4的合成寡核苷酸克隆入經NdeI、NheI處理的pGEM(T)/CspA中，並轉化入DH5α品系大腸桿菌以分別得到pGEM(T)/rTAT-CspA及pGEM(T)/(SPKR)4-CspA DNA質粒。為進一步構建具膜轉位活性的經修飾(SPKR)4-CspA，我們使用引物3及4(其系互補於CspA部份編碼序列)，將來自TAT的PTD編碼序列併入引物4中，並使用pGEM(T)/(SPKR)4-CspA DNA質粒作為PCR模板。經25個PCR循環後，以引物3及4用Taq酶(購自Takara公司)將PTD序列導入pGEM(T)/(SPKR)4-CspA。PTD的引物3及4的序列如下引物35′-NNNNNGGATCCAGAGAAGTGTACGAACACATC-3′引物45′-NNNNNGGATCCCGCAAGAAACGCCGTCAACGCCGCAGAGGATCTCTGGACGAAGGTCAGAAA(下標線字母表示Bam HI切割處。)退火溫度設定於54℃，1分鐘。經25個PCR循環後，所得PCR產物以QIAquick PCR純化試劑盒純化，並以DpnI及Bam HI消化之。經限制酶消化後，以1％瓊脂糖凝膠(1×TAE)分離並以QIAquick凝膠純化試劑盒(QIAGEN公司)純化DNA。純化的DNA經自我連接，然後轉化入DH5α品系大腸桿菌，以得到pGEM(T)/(SPKR)4-iTat-CspA質粒。
表達載體的構建以NdeI及XhoI消化由pGEM(T)/rTAT-CspA或(SPKR)4-iTat-CspA質粒所編碼的融合蛋白質序列，然後以1％瓊脂糖凝膠分離，分別以切下的含有rTAT-CspA或(SPKR)4-iTat-CspA融合蛋白質的編碼序列的DNA片段作為DNA插入物。以相同的限制酶NdeI及XhoI處理表達載體pET28a(Novagen公司)，然後分別與DNA插入物(rTAT-CspA或(SPKR)4-iTat-CspA融合蛋白質的編碼序列)連接；接著轉化入DH5α品系大腸桿菌，以得到pET28a/rTAT-CspA或pET28a/(SPKR)4-iTat-CspA質粒；然後對pET表達載體做DNA測序。經測序辨識的pET28a/rTAT-CspA或pET28a/(SPKR)4-iTat-CspA質粒分別轉化入大腸桿菌菌株BL21(DE3)codon-plus細胞(購自Stratagene公司)，以表達本發明融合蛋白質。
本發明融合蛋白質的表達與純化內含pET28a/rTAT-CspA或pET28a/(SPKR)4-iTat-CspA質粒的大腸桿菌菌株BL21(DE3)codon-plus細胞生長於LB(Kan+、Cm+)培養皿上。挑選單一菌落接種於2mlLB肉湯培養基(Kan+、Cm+)中，然後於37℃下培養4小時。取1ml份量的細菌培養物接種於400ml極端(terrific)肉湯培養基(Kan+、Cm+)中，進一步培養至光學密度OD600達於0.6-0.8。加入最終濃度1mM的IPTG，再於37℃下培養5到7小時。以離心收取經IPTG誘導的大腸桿菌細胞。所得沉澱物(pellet)貯存於-70℃的冷凍櫃中，待進一步的蛋白質純化。
本發明融合蛋白質的純化本發明融合蛋白質的純化系依據pET系統的製造商指導手冊進行。將經IPTG誘導表達的大腸桿菌宿主沉澱物再懸浮於含有8M尿素的1×His鍵合緩衝液(500mM NaCl、20mM咪唑及20mM Tris-Cl，pH7.9)中，然後以超聲波處理打破細胞。高速離心後，超聲波處理上清液部分以鎳離子親和力柱處理，之後以10倍體積的含有8M尿素的1×結合緩衝液(500mM NaCl、25mM咪唑及20mM Tris-Cl，pH7.9)及含有8M尿素的1×洗滌緩衝液(500mM NaCl、40mM咪唑及20mM Tris-Cl，pH7.9)洗滌柱。以含有8M尿素的1×溶析緩衝液(500mMNaCl、60mM咪唑及20mM Tris-Cl，pH7.9)將His6標記的融合蛋白質自柱析出。依次以4 M尿素及滅菌水透析該His6標記的融合蛋白質。凍幹經透析的蛋白質，將蛋白質粉末溶解於1×PBS溶液，並以BCA(PIERCE公司)方法測定蛋白質濃度。純化的融合蛋白質以5％至15％SDS-PAGE分析，並以亞甲基藍染色凝膠(見圖3)。所得蛋白質溶液可直接用於核酸結合試驗(凝膠阻滯或EtBr排阻分析(EtBrexclusion assay))並測試其基因輸送活性。
實施例2本發明融合蛋白質的DNA結合容量簡言的，取0.5ug報告質粒pEGFP-N1(購自Clontech公司)與不同量的融合蛋白質載體(rTAT-CspA或(SPKR)4-iTat-CspA)共置於1×PBS緩衝液中。於室溫下放置30分鐘後，於1％瓊脂糖凝膠(1×TBE)上分離DNA-蛋白質複合物並以EtBr染色及照相。一旦大的DNA-蛋白質複合物形成時，報告質粒DNA即因與融合蛋白質結合而被留置於凝膠頂端的孔中，故無法跑入凝膠中且無法被EtBr充分染色(見圖4)。
實施例3以融合蛋白質載體及pEGFP-N1報告質粒於體外轉染Hela細胞培養物置於以血清塗覆的蓋玻片上生長過夜的次匯合(subconfluent)單層Hela細胞，溫和地以無血清DMEM培養液洗滌2次、以1×PBS緩衝液洗滌5次，然後分別以5μg報告質粒pEGFP-N1或融合蛋白質(rTAT或(SPKR)4-iTat-CspA)-報告DNA質粒複合物(5μg)處理細胞。將Hela細胞於37℃下培養1小時，然後添加0.45ml的新鮮有血清DMEM培養液並於37℃下培養6小時，再添加1ml有血清DMEM培養液，繼續培養。培養24小時後，直接以螢光顯微鏡(Leica公司)檢視有表達EGFP蛋白質的經轉染Hela細胞。如圖5所示，經融合蛋白質-pEGFP-N1複合體轉染的Hela細胞在細胞中展現出顯著的綠色螢光訊號。該結果顯示本發明融合蛋白質可有效輸送DNA進入細胞中。
實施例4以本發明融合蛋白質及pEGFP-N1報告質粒於體外轉染區域(zona)移除的小鼠胚胎用於轉染的小鼠胚胎基本上系依據Gordon等人(Gordon，J.W.及Ruddle，F.H.(1983)Gene transfer into mouse embryos.Production oftransgenic mice by pronuclear injection.Methods in Enzymol.，Recombinant DNA，Part C.，101，411-433)及Hogan，B.、Costantini，F.及Lacy，E.(1986；Manipulating the mouse embryoA LaboratoryManual)所述者製備的。簡言之，ICR外系繁殖品系系購自臺大實驗動物中心(臺北)，然後注射2.5IU的懷孕母馬血清促性腺激素(購自Sigma，G4527)使其過度排卵，48小時後注射5IU的人類絨毛膜促性腺激素(hCG；Sigma公司，C8554)，並個別與ICR雄性同籠過夜。於注射hCG後24小時時，衝洗輸卵管以收集單細胞小鼠胚胎。小鼠胚胎以內含0.5％鏈黴蛋白(pronase；Sigma公司，P5147)的M2培養液於37℃下處理5分鐘以去除透明(pellucida)區，並以M2培養液及1×PBS緩衝液溫和地清洗數次，然後以對照組質粒pcDNA3.1(購自Invitrogen公司)或融合蛋白質載體(SPKR)4-iTat-CspA及報告pEGFP-N1質粒，在與轉染Hela細胞相同的條件下(除了使用0.75μg對照組質粒pcDNA3.1或pEGFP-N1報告質粒)轉染。於37℃下靜置15分鐘後，添加1ml M16培養液(Sigma公司，M7292)，然後將胚胎置於礦物油中(Sigma公司，M8410)。在靜置期間，每隔24小時以螢光顯微鏡(Leica公司)檢查EGFP蛋白質表達。如圖6所示，融合蛋白質(SPKR)4-iTat-CspA-pEGFP-N1報告質粒(左)在螢光顯微鏡相片中展現出顯著的綠色螢光訊號，表示該融合蛋白質可成功輸送DNApEGFP-N1報告質粒進入胚胎中。
實施例5以本發明融合蛋白質輸送報告DNA質粒pEGFP-N1進入小鼠中取20μg DNA質粒pEGFP-N1與本發明融合蛋白質rTAT-CspA或(SPKR)4-iTat-CspA於1×PBS緩衝液中混合，於室溫下靜置15分鐘，然後分別以腹腔內注射入小鼠中。48小時後，處死小鼠並將其肝臟做成冷凍組織切片，然後以共聚焦雷射掃描顯微鏡(Leica公司)檢查EGFP蛋白質表達。圖7顯示本發明融合蛋白質rTAT-CspA或(SPKR)4-iTat-CspA可成功於體內輸送DNA質粒pEGFP-N1至肝細胞。
實施例6本發明融合蛋白質的RNA結合負載量將人類5S rDNA的PCR產物克隆入pGEM(T)載體(Promega公司，Elong Lin博士所贈)中。以Spe I消化pGEM(T)/h5S rDNA質粒，然後以1％瓊脂糖凝膠(1×TAE)分離的。將線形pGEM(T)/h5SrDNA片段由瓊脂糖凝膠切離，並以QIAquick凝膠純化試劑盒(QIAGEN公司)純化之。使用RiboMAX/T7大量RNA生產系統(Promega公司)合成人類5S rRNA，並依據製造商指導手冊以UTP[α-32P](800ci/mmol，10mci/ml；NEN公司)均勻標記人類5S rRNA。體外合成的人類5SrRNA以12％UREA-PAGE分離，然後以UV遮蔽方法由凝膠純化。經醋酸銨及乙醇沉澱後，人類5S rRNA於沸水浴中加熱5分鐘使其變性，然後緩慢冷卻至室溫並於-20℃下貯存過夜。取125ng人類5SrRNA與不同量的本發明蛋白質rTAT蛋白質混合，於室溫下靜置30分鐘，然後再於37℃下靜置10分鐘同時以或不以RNase T1(10U；Ambion公司)處理。以8％天然PAGE(0.5×TBE)分離結合複合物，然後以10％醋酸固定該凝膠，接著乾燥凝膠並進行放射自顯影。如圖8所示，RNase-抗性的結合複合物以符號「*」標識。
序列表110基因梭生技醫藥股份有限公司120作為載體的新的融合蛋白質130FF-02-004140JP 2002-1404411412002-05-1516029170PatentIn version 3.2210121116212PRT213Pantp；Penetratin4001Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys1 5 10 15210221116212PRT213Retro-inVerso pAntp4002Lys Lys Trp Lys Met Arg Arg Asn Gln Phe Trp Val Lys Val Gln Arg1 5 10 15210321116212PRT213W/R Penetrain4003Arg Arg Trp Arg Arg Trp Trp Arg Arg Trp Trp Arg Arg Trp Arg Arg1 5 10 1521042117212PRT213Pantp4004Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys1 5210521113212PRT213HIV TAT4005Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln15 10210621111212PRT213HIV TAT4006Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg1 5 1021072117212PRT213R74007Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg1 5210821130212PRT213VP224008Asp Ala Ala Thr Arg Ser Ala Ala Ser Arg Pro Thr Glu Arg Pro Arg1 5 10 15Ala Pro Ala Arg Ser Ala Ser Arg Pro Arg Arg Pro Val Glu20 25 30210921117212PRT213Gp41融合序列4009Gly Ala Leu Phe Leu Gly Trp Leu Gly Ala Ala Gly Ser Thr Met Gly1 5 1015Ala2101021127212PRT213MPG(Gp41融合序列-SV40NLS)40010Gly Ala Leu Phe Leu Gly Phe Leu Gly Ala Ala Gly Ser Thr Met Gly1 5 10 15Ala Trp Ser Gln Pro Lys Ser Lys Arg Lys Val20 252101121127212PRT213寬吻鱷Ig(v)輕鏈-SV40NLS40011Met Gly Leu Gly Leu His Leu Leu Val Leu Ala Ala Ala Leu Gln Gly1 5 10 15Ala Trp Ser Gln Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val20 252101221112212PRT213PreS2-TLM40012Pro Leu Ser Ser Ile Phe Ser Arg Ile Gly Asp Pro1 5 102101321120212PRT213Ad纖維40013Ala Lys Arg Ala Arg Leu Ser Thr Ser Phe Asn Pro Val Tyr Pro Tyr1 5 10 15Glu Asp Glu Ser202101421127212PRT213轉移40014Gly Trp Thr Leu Asn Ser Ala Gly Tyr Leu Leu Gly Lys Ile Asn Leu1 5 10 15Lys Ala Leu Ala Ala Leu Ala Lys Lys Ile Leu20 252101521118212PRT213SynBl40015Arg Gly Gly Arg Leu Ser Tyr Ser Arg Arg Arg Phe Ser Thr Ser Thr1 5 10 15Gly Arg2101621116212PRT213MPS(Kaposi FGF信號序列)40016Ala Ala Val Ala Leu Leu Pro Ala Val Leu Leu Ala Leu Leu Ala Pro1 5 10 152101721112212PRT213MPS(Kaposi FGF信號序列)40017Ala Ala Val Leu Leu Pro Val Leu Leu Ala Ala Pro1 5 102101821115212PRT213人整合素3信號序列40018Val Thr Val Leu Ala Leu Gly Ala Leu Ala Gly Val Gly Val Gly1 5 10 152101921130212PRT213P340019Val Ala Tyr Ile Ser Arg Gly Gly Val Ser Thr Tyr Tyr Ser Asp Thr1 5 10 15Val Lys Gly Arg Phe Thr Arg Gln Lys Tyr Asn Lys Arg Ala20 25 302102021118212PRT213兩性肽模型40020Lys Leu Ala Leu Lys Leu Ala Leu Lys Ala Leu Lys Ala Ala Leu Lys1 5 10 15Leu Ala2102121130212PRT213KALA40021Trp Glu Ala Lys Leu Ala Lys Ala Leu Ala Lys Ala Leu Ala Lys His1 5 10 15Leu Ala Lys Ala Leu Ala Lys Ala Leu Lys Ala Cys Glu Ala20 25 302102221135212DNA213引物140022gctagcatgt ccggtaaaat gactggtatc gtaaa 352102321126212DNA213引物240023ctcgagatta caggctggtt acgtta 262102421138212DNA213Oligo(1)40024tatgggtcgc cgtcgtcaac gtcgtaaaaa gcgccgtt382102521140212DNA213Oligo(2)40025ctagaaccgc gctttttacg acgttgacga cggcgaccca 402102621159212DNA213Oligo(3)40026tatgggctct cctaaacgct ctcctaaacg ctctcctaaa cgctctccta aacgtggtt 592102721161212DNA213Oligo (4)40027ctagaaccac gtttaggaga gcgtttagga gagcgtttag gagagcgttt aggagagccc60a612102821127212DNA213引物340028ggatccagag aagtgtacga acacatc272102921157212DNA213引物440029ggatcccgca agaaacgccg tcaacgccgc agaggatctc tggacgaaggtcagaaa5權利要求
1.一種用於輸送所需分子進入細胞或細胞核的融合蛋白質，包含i)一冷休克結構域及其同源或功能等價衍生物，及ii)一膜轉位序列或其功能等價肽及/或衍生物。
2.如權利要求1的融合蛋白質，其中該冷休克結構域選自由下列所組成的一組CspA、CspB、CspC、CspD、rpl S1 RNA結合結構域、真核生物的Y-盒蛋白質、DNA結合蛋白質B(DBPB)、DBPA、EFE-1、mRNP3、mRNP4、FRG Y1及核酸酶敏感組件結合蛋白質1(NSEP1)。
3.如權利要求1的融合蛋白質，其中該冷休克結構域選自由下列所組成的一組CspA、rpl S1 RNA結合結構域、人類YB-1及DNA結合蛋白質A及B、及FRG Y1。
4.如權利要求1的融合蛋白質，其中該冷休克結構域的功能等價衍生物是藉由在該冷休克結構域內插入一DNA濃縮結構域或DNA結合結構域而修飾。
5.如權利要求4的融合蛋白質其中該DNA濃縮或結合結構域選自由DNA濃縮結構域(SPKR)3-4及正電荷細胞核定位序列(NLS+)所組成的組。
6.如權利要求1的融合蛋白質，其中該膜轉位序列為蛋白質轉導結構域(PTD)或膜融合序列。
7.如權利要求1的融合蛋白質，其中該膜轉位序列為選自由SEQ ID NO1、2、4、5、6、7及8所組成的組的蛋白質轉導結構域(PTD)。
8.如權利要求1的融合蛋白質，其中該膜轉位序列為選自由SEQ ID NO1、2、4、5、6及7所組成的組的蛋白質轉導結構域(PTD)。
9.如權利要求1的融合蛋白質，其中該膜融合序列選自由SEQID NO9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22及23所組成的組。
10.如權利要求1的融合蛋白質，其中該膜融合序列選自由SEQID NO9、10、11、12、13、17、19、20及21所組成的組。
11.如權利要求1的融合蛋白質，其進一步包含一蛋白質純化標識序列。
12.如權利要求11的融合蛋白質，其中該蛋白質純化標識序列選自由HA、GST、His6標記所組成的組。
13.如權利要求1的融合蛋白質其用於輸送選自由DNA及RNA所組成的組的核酸進入基因輸送用細胞。
14.如權利要求1的融合蛋白質，其用於輸送核酸至體內的基因輸送用細胞。
15.如權利要求1的融合蛋白質，其用於輸送核酸至胚胎或活體動物以製造轉基因動物。
16.一種融合蛋白質，包含i)一冷休克結構域及其同源或功能等價衍生物，及ii)一蛋白質轉導結構域或其功能等價肽及衍生物。
17.如權利要求16的融合蛋白質，其進一步包含一蛋白質純化標識序列。
18.如權利要求17的融合蛋白質，其中該蛋白質純化標識序列系選自由HA、GST、His6標記所組成的組。
19.如權利要求16的融合蛋白質，其用於輸送核酸至基因輸送用細胞。
20.如權利要求16的融合蛋白質，其用於輸送核酸至體內的基因輸送用細胞。
21.如權利要求16的融合蛋白質，其用於輸送核酸至胚胎或活體動物以製造轉基因動物。
22.一種融合蛋白質，包含i)一冷休克結構域及其同源或功能等價衍生物，及ii)一膜融合序列或其功能等價肽及衍生物。
23.如權利要求22的融合蛋白質，其進一步包含一蛋白質純化標識序列。
24.如權利要求23的融合蛋白質，其中該蛋白質純化標識序列系選自由HA、GST、His6標記所組成的組。
25.如權利要求22的融合蛋白質，其用於輸送核酸至基因輸送用細胞。
26.如權利要求16的融合蛋白質，其用於輸送核酸至體內的基因輸送用細胞。
27.如權利要求22的融合蛋白質，其用於輸送核酸至胚胎或活體動物以製造轉基因動物。
28.如權利要求22的融合蛋白質，其進一步包含一細胞核定位序列。
29.如權利要求28的融合蛋白質，其進一步包含一蛋白質純化標識序列。
30.如權利要求29的融合蛋白質，其中該蛋白質純化標識序列系選自由HA、GST、His6標記所組成的組。
31.如權利要求28的融合蛋白質，其用於輸送核酸至基因輸送用細胞。
32.如權利要求28的融合蛋白質，其用於輸送核酸至體內的基因輸送用細胞。
33.如權利要求28的融合蛋白質，其用於輸送核酸至胚胎或活體動物以製造轉基因動物。
全文摘要
本發明提供了一種融合蛋白質，其包含一用於將所需分子輸送進入細胞或細胞核的融合蛋白質，所述蛋白質包含i)一冷休克結構域及其同源物或功能等價衍生物，及ii)一膜轉位序列或其功能等價肽及/或其衍生物。該融合蛋白質可用作體外輸送核酸的載體，特別是可用作體內輸送核酸的載體以用於基因療法及製造轉基因動物。
文檔編號C12N15/87GK1495200SQ0312365
公開日2004年5月12日 申請日期2003年5月12日 優先權日2002年5月13日
發明者胡倫, 倫 胡 申請人:基因梭生技醫藥股份有限公司