性逆轉與雌核發育持續生產全雄黃顙魚方法
2023-10-08 10:13:49 2
專利名稱:性逆轉與雌核發育持續生產全雄黃顙魚方法
技術領域：
性逆轉與雌核發育持續生產全雄黃顙魚方法屬於魚類細胞工程育種領域，特別涉及人工性別控制技術。
背景技術：
正如本申請文件實質審查請求書所提交的附件參考資料[15]所提出的生產單性雄魚有幾種方法可供選擇如人工選擇、雄性激素直接誘導性逆轉、雄核發育、種間雜交、人工誘導三倍體以及遺傳學方法等。但因人工挑選的勞動強度大，而且不能準確區分雌雄魚；用性激素直接誘導性逆轉，有性激素殘留的危險，許多國家早已禁用。雄核發育則存在誘導率、成活率低以及YY♀生理雌魚生育力極低等嚴重的技術障礙，只停留在實驗階段，尚無成功例子。人工誘導三倍體只適用於雄性配子同型的魚類，而且許多種類難於在商業上應用。只有羅非魚種間雜交與遺傳學方法取得成功，在生產上推廣應用。但種間雜交只限於羅非魚屬的幾個雜交組合，產卵率較低以及繁殖群體混雜。只有稱為GMT的遺傳學技術，適用於雄性配子異型的魚類，方法可靠、穩定，而且對環境無任何不良的影響，可以大量生產全雄魚。早在上世紀五、六十年代，日本Yamamoto研究青鱂性別決定與伴性遺傳時(請閱參考資料17、18、19)，利用雌性激素將XY♂雄魚逆轉成XY♀生理雌魚，並與XY♂雄魚交配，首次獲得YY♂超雄魚，證明YY♂超雄魚是可以存活的，而且還可以雌性化，成為YY♀生理雌魚，YY♀與YY♂交配便可大量產生YY♂超雄魚。1980年，我國楊永銓等(請閱參考資料6)應用三系配套途徑生產遺傳上全雄莫三比克羅非魚獲得成功，基本就是利用性激素性逆轉與後代測交的方法，獲得YY♂超雄魚。1989年，Varadaraj等(請閱參考資料22)也提出類似的方法獲得YY♂，超雄莫三比克羅非魚；與此同時，Mair等1988年、Baroiller and Jalabert1989年、Scott等1989年(請閱參考資料20、21、8)也相繼發表有關研究論文提出相同的方法，獲得YY♂超雄尼羅羅非魚，在這些工作的基礎上，Mair等(請閱參考資料的16)1997年發表了規模生產全雄尼羅羅非魚的育種計劃，報導了他們的研究成果，也就是所謂的全雄魚遺傳操作技術(GMT)。這個所謂GMT育種技術是通過五代半的激素性逆轉和後代測交最後獲得YY♂超雄魚和YY♀生理雌魚，並由YY♂超雄魚和XX♀正常雌魚生產XY♂全雄魚。採用這種技術的育種時間較長，而且逐代測交的試驗魚必須嚴格管理，防止混雜，才能最後取得成功。可見，對於世代周期較長的魚類而言，就未必是首選的方法，必須採用其他較為有效的技術手段。1989年，Varadaraj等(請閱參考資料22)報導了激素性逆轉結合雌核發育技術產生超雄莫三比克羅非魚，這種技術據稱可將YY♂超雄魚的產出從25％提高到50％，並可縮短22～8個月的育種時間，還提出商業上大規模生產全雄魚的方案，但未見在生產上推廣應用的報導。至於黃顙魚的性逆轉與雌核發育以及YY♂超雄魚、XY♂全雄魚均未見報導。
發明內容如前所述，目前成功應用於尼羅羅非魚全雄性種群的生產技術，只有種間雜交或遺傳學方法，前者只限於羅非魚中天然存在的幾個雜交組合，不可能應用於其它養殖魚類，而遺傳學方法育種時間過太長(五代半)，不適用於世代周期較長的魚類，至於印度學者提出激素性逆轉結合雌核發育技術，持續生產全雄性莫桑鼻給羅非魚的技術路線不僅縮短了育種時間22～8個月，並且提高超雄魚(YY♂)的產出，這是技術上很大的進步，但仍有進一步提高、改進的餘地。發明人認為上述技術方案及其技術參數是不適用於黃顙魚的，必須另行設計。
黃顙魚是淡水養殖的重要魚類。在相同的養殖條件下，雄性黃顙魚比同胞雌魚的生長速度快30％以上，因此，如能採用適當的性別控制技術，在生產上養殖黃顙魚雄性群體，用以提高漁產品的質量和產量，具有重大的經濟意義與技術價值。發明人分析國內外魚類性別控制的技術經驗，提出採用雌核發育結合激素性逆轉的集成技術，這就是本發明所要解決的技術，以此達到建立超雄黃顙魚和全雄魚黃顙魚的繁育體系的目的。
為此，本發明採用的技術方案如下(1)人工催產選擇體表無傷、腹部膨大柔軟、性腺發育良好的雌魚及性成熟的雄魚用絨毛膜促性腺激素和魚用促排卵素進行人工催產，在每條魚胸鰭基部一次性注射，催產劑的使用劑量雌魚為絨毛膜促性腺激素800IU，魚用排卵素10μg，雄魚為絨毛膜促性激素400IU，魚用排卵素5μg；置於水溫26℃中，24小時後從雄魚體中擠出精液或剖腹取精，從雌魚擠出成熟的卵子進行人工授精；對長吻鮠雄魚劑量加倍；
(2)激素性逆轉用滷蟲幼體作為激素載體，預先在50～300μg/L的乙炔基雌二醇浸泡一個小時，然後抽濾取出滷蟲作為活餌料投餵開口攝食4天的黃顙魚正常魚苗XX♀；XY♂，每天早、中、晚上各投餵一次，投餵量以30分鐘內吃完為準，連續餵養40天；(3)性逆轉的XY♀生理雌魚的雌核發育(3.1)精子滅活，選用長吻鮠雄魚精子激活黃顙魚卵雌核發育，從激素催情後的長吻鮠雄魚剖腹取出精巢，用剪刀剪碎，加6-8倍的Hank’s液稀釋過濾至Φ9cm的培養皿中，精液厚度2-3mm，然後置於轉速115轉/分的冰浴搖床上搖動。用一支波長253730W紫外燈管照射，照距35cm，照射強度為1×764μw/cm2，並隨時取少量精液在解剖鏡下觀察精子活動情況，一般照射30分鐘即可。當精子被水激活後大部分還能緩慢泳動時，即可停止照射；(3.2)雌核二倍體獲得，將XY♀黃顙魚生理雌魚人工催產獲得的成熟魚卵，與長吻鮠滅活的精子進行人工授精，授精後1-10分鐘內，用0-5℃冰水處理5～20分鐘，阻斷減數分裂第二極體排出，恢復雌核二倍體，取出置於26℃的恆溫培養箱中孵化，便可獲得候選的YY♂超雄黃顙魚和XX♀雌魚。
(4)候選YY♂超雄黃顙魚的後代測交，從後代雌雄性比推斷候選雄魚的基因型是YY或XX，取性成熟候選YY♂超雄黃顙魚與XX♀正常雌魚測交，按Mair等制定的尼羅羅非魚標準，用K.Pearson氏X2檢驗法，測定其後代性比的觀察值和理論值的符合度；當符合機率P＞0.05時，則為XY型；當P＜0.001時，則為YY或XX型；以推斷經後代性比測交的供試魚基因型為XY或YY或XX，從而挑選出確認的YY♂超雄黃顙魚；(5)全雄黃顙魚持續生產，將經後代測交確認的YY♂超雄黃顙魚與正常XX♀雌魚交配，即得XY♂全雄黃顙魚；將經後代測交確認的YY♂超雄黃顙魚與性逆轉超雄生理雌魚交配，即得全YY♂超雄黃顙魚。
本發明的有益效果是(1)由於性逆轉與雌核發育相結合集成技術的創建，形成了持續生產YY♂超雄黃顙魚與XY♂全雄黃顙魚的繁育體系，並為黃顙魚及其他雄性配子異型的魚類性別控制提供一條新的技術途徑。
(2)縮短了育種時間，與遺傳學技術(GMT)相比較，可以縮短兩代，即24個月，比Varadaraj等技術縮短了半代，即6個月，提高了工效。三種技術路線比較如附表所示。
(3)有明顯的經濟與社會效益，實驗證明本技術實施方案成活率和性逆轉的比例以及超雄魚的產出均達到了設計指標；基本上解決了全雄性黃顙魚的單性種群的生產問題，在不增加人工、飼料成本的情況下，可以提高單產25％以上；全雄性黃顙魚種苗價格與混性種苗相比較可提高25～30％。
圖1性逆轉與雌核發育持續生產全雄黃顙魚方法技術原理圖。
圖2性逆轉與雌核發育持續生產全雄黃顙魚方法流程圖。
附表三種技術方案工藝過程比較。
具體實施方式實施本發明的方式可參照圖2進行。其具體工藝流程如下(1)人工催產，可按常規進行，即選擇體表無傷、腹部膨大柔軟、性腺發育良好的雌魚及性成熟的雄魚用絨毛膜促性腺激素和魚用促排卵素進行人工催產，在每條魚胸鰭基部一次性注射，催產劑的使用劑量雌魚為絨毛膜促性腺激素800IU，魚用排卵素2號10μg。雄魚劑量減半。即400IU、5μg絨毛膜促性腺激素和魚用排卵素2號為杭州動物藥品廠和蕭山第一獸藥製造有限公司聯合生產的產品。將之置於水溫26℃中，24小時後從雄魚體中擠出精液或剖腹取精，從雌魚擠出成熟的卵子進行人工授精。對於長吻鮠雄魚劑量加倍。
(2)激素性逆轉，用滷蟲幼體作為激素載體，將之置於50～300μg/L的17-乙炔基雌二醇(EE2)中浸泡1小時，然後抽濾取出滷蟲作為活餌料投餵開口攝食4天的黃顙魚正常魚苖(XX♀；XY♂)，每天早、中、晚各投餵一次，投餵量以30分鐘內吃完為準，連續餵養40天，實驗結果證明成活率在60％以上，轉化率在95％以上，XY♀生理雌魚約50％。
(3)性逆轉的XY♀生理雌魚雌核發育，本工藝過程包括以下兩個步驟第一，精子滅活，選用長吻鮠雄魚精子激活黃顙魚卵雌核發育，從激素催情後的長吻鮠雄魚剖腹取出精巢，用剪刀剪碎。加6-8倍的Hank’s液稀釋過濾至φ9cm的培養皿中，精液厚度2-3mm，然後置於轉速115轉/分的冰浴搖床上搖動。再用一支波長253730W紫外燈管照射，照距35cm，照射強度為1×764μw/cm2，並隨時取少量精液在解剖鏡下觀察精子活動情況，一般照射30分鐘即可。當精子被水激活後大部分還能緩慢泳動時，即可停止照射。
第二，雌核二倍體獲得，將XY♀黃顙魚生理雌魚人工催產獲得的成熟魚卵，與長吻鮠滅活的精子進行人工授精，授精後1-10分鐘內，用0-5℃冰水處理5～20分鐘，阻斷減數分裂第二極體排出，恢復雌核二倍體，取出置於26℃的恆溫培養箱中孵化，便可獲得候選的YY♂超雄黃顙魚和XX♀雌魚。
(4)候選YY♂超雄黃顙魚的後代測交，從後代雌雄性比推斷候選雄魚的基因型是YY或XX。取性成熟候選YY♂超雄黃顙魚與XX♀正常雌魚測交，按Mair等制定的尼羅羅非魚標準，用K.Pearson氏X2檢驗法(chi squaretest)測定其後代性比的觀察值和理論值的符合度，雄性配子異型的魚類(XY♂)其後代雌雄比各為50％，這是性比的理論值。當觀察值與理論值越接近時，則X2值越小；反之，X2越大。而符合機率P與X2值成反比，即X2越大，相符則觀察值與理論值不相符。反之X2越小，P值越高，觀察值越與理論值相符。當P＞0.05時，則為XY型，當P＜0.001時，則為YY或XX型，以推斷經後代性比測交的供試魚基因型為XY或YY或XX，從而挑選出確認的YY♂超雄黃顙魚；(5)全雄黃顙魚持續生產，將侯選的經後代測交確認的YY♂超雄黃顙魚與正常XX♀雌魚交配，即得XY♂全雄黃顙魚；將經後代測交確認的YY♂超雄黃顙魚與性逆轉超雄生理雌魚交配，經驗證即得YY♂超雄黃顙魚。
至此，即形成了持續生產全雄和超雄黃顙魚的生產過程以及它們的繁育體系。
權利要求
一種性逆轉與雌核發育持續生產全雄黃顙魚方法，它包括性逆轉與雌核發育，其特徵是按以下工序進行1人工催產選擇體表無傷、腹部膨大柔軟、性腺發育良好的雌魚及性成熟的雄魚用絨毛膜促性腺激素和魚用促排卵素進行人工催產，在每條魚胸鰭基部一次性注射，催產劑使用劑量雌魚為絨毛膜促性腺激素800IU，魚用排卵素10μg，雄魚為絨毛膜促性激素400IU，魚用排卵素5μg；置於水溫26℃中，24小時後從雄魚體中擠出精液或剖腹取精，從雌魚擠出成熟的卵子進行人工授精；對長吻鮠雄魚劑量加倍；
2激素性逆轉用滷蟲幼體作為激素載體，預先在50～300μg/L的乙炔基雌二醇浸泡一個小時，然後抽濾取出滷蟲作為活餌料投餵開口攝食4天的黃顙魚正常魚苗XX♀；XY♂，每天早、中、晚上各投餵一次，投餵量以30分鐘內吃完為準，連續餵養40天；
3性逆轉的XY♀生理雌魚的雌核發育3.1精子滅活，選用長吻鮠雄魚精子激活黃顙魚卵雌核發育，從激素催情後的長吻鮠雄魚剖腹取出精巢，用剪刀剪碎，加6-8倍的Hank’s液稀釋過濾至Φ9cm的培養皿中，精液厚度2-3mm，然後置於轉速115轉/分的冰浴搖床上搖動；用一支波長253730W紫外燈管照射，照距35cm，照射強度為1×764μw/cm2；並隨時取少量精液在解剖鏡下觀察精子活動情況，一般照射30分鐘即可；當精子被水激活後大部分還能緩慢泳動時，即停止照射；3.2雌核二倍體獲得，將XY♀黃顙魚生理雌魚人工催產獲得的成熟魚卵，與長吻鮠滅活的精子進行人工授精，授精後1-10分鐘內，用0-5℃冰水處理5～20分鐘，阻斷減數分裂第二極體排出，恢復雌核二倍體，取出置於26℃的恆溫培養箱中孵化，便可獲得候選的YY♂超雄黃顙魚和XX♀雌魚；
4候選YY♂超雄黃顙魚的後代測交，從後代雌雄性比推斷候選雄魚的基因型是YY或XX，取性成熟候選YY♂超雄黃顙魚與XX♀正常雌魚測交，按Mair等制定的尼羅羅非魚標準，用K.Pearson氏X2檢驗法，測定其後代性比的觀察值和理論值的符合度；當符合機率P＞0.05時，則為XY型；當P＜0.001時，則為YY或XX型；以推斷經後代性比測交的供試魚基因型為XY或YY或XX，從而挑選出確認的YY♂超雄黃顙魚；
5全雄黃顙魚持續生產，將經後代測交確認的YY♂超雄黃顙魚與正常XX♀雌魚交配，即得XY♂全雄黃顙魚；將經後代測交確認的YY♂超雄黃顙魚與性逆轉超雄生理雌魚交配，即得YY♂超雄黃顙魚。
專利摘要
性逆轉與雌核發育持續生產全雄黃顙魚方法屬魚類細胞工程育種，特別涉及人工性別控制技術。它需解決的技術問題是將雌核發育與激素性逆轉相結合用於黃顙魚性別的控制，使之成為全雄黃顙魚。技術方案如下人工催產對性成熟的雌魚及雄魚進行人工催產；人工授精；激素性逆轉用含有激素的滷蟲幼體餵養黃顙魚魚苗，使雄性轉化為生理雌魚；性逆轉生理雌魚的雌核發育它包括精子滅活和雌核二倍體獲得過程，產生候選超雄魚和正常雌魚；經後代測交確認的超雄魚與正常雌魚交配獲得全雄魚，超雄魚性逆轉生理雌魚再與超雄魚交配，得全超雄黃顙魚，從而構成全雄魚和超雄魚生產工藝。形成全雄黃顙魚的繁育體系，適用於全雄黃顙魚的生產。
文檔編號A01K67/027GK1994072SQ200610166518
公開日2007年7月11日 申請日期2006年12月28日
發明者陳宏溪, 劉漢勤 申請人:中國科學院水生生物研究所導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan