一種不動桿菌敗血菌、含有該菌的菌劑及其應用和鈍化砷的方法與流程

2023-10-08 11:33:44

本發明涉及重金屬砷汙染的生物修復
技術領域：
，具體地，涉及一種不動桿菌敗血菌、含有該菌的菌劑及其應用和一種鈍化砷的方法。
背景技術：
：砷(As)是五大劇毒元素之一。土壤中的砷主要來源於天然和人為兩大途徑。天然來源主要是土壤本身所含的砷元素，除富砷地區以外，大多數的土壤砷背景值約為15mg/kg。土壤砷汙染主要來源於人類活動。砷元素及其衍生物被廣泛用於生產製造業，如電子產品、合金和塗料等。同時金屬採礦和煤炭開採活動也會釋放大量的砷到土壤和大氣環境中。農業生產中使用的含砷農藥和化肥也是土壤中砷的一類重要來源。砷化物曾被廣泛用於農業中作殺蟲劑、消毒液、殺菌劑和除草劑。另外，一些化肥中也含有一定量的砷。磷肥中一般含有20-50mg/kg的砷，其中複合肥中的砷含量更高，長期施用使土壤中富集大量的砷元素，導致嚴重汙染。無機砷化合物在土壤中持久存在，並可為植物所利用，進而毒害植物影響作物生長。鑑於砷本身的特性，必須進行人工治理和修復。可以採用的方法包括物理方法、化學方法和生物學方法，有以下幾個方面：固定化/穩定化技術、玻璃化技術、土壤淋洗技術、原位電動修復技術。上述修複方法均會不同程度地破壞土壤生態環境。也就是說，目前所採用的物理、化學修復技術不僅操作複雜，而且所採用化學試劑或物理操作均會對土壤環境造成不可逆的破壞。相反，生物修復技術修復效果好、投資省、實施簡便、不產生二次汙染。因此，為了保持土壤結構和微生物的活性，篩選出高效鈍化菌株鈍化土壤中的砷是目前亟待解決的問題。技術實現要素：本發明的目的是為了克服砷汙染生物修復中存在的上述缺陷，提供一種不動桿菌敗血菌、含有該菌的菌劑及其應用和一種鈍化砷的方法。本發明的不動桿菌敗血菌，具有較高的砷鈍化能力，可耐受高濃度的砷汙染，操作簡便，可在砷汙染的土壤或含砷廢水的生物修復過程中發揮重要作用。為了實現上述目的，本發明的發明人進行了大量的篩選實驗，結果篩選到一種具有較高的砷鈍化能力、可耐受高濃度的砷汙染的不動桿菌敗血菌。因此，第一方面，本發明提供了一種不動桿菌敗血菌(Acinetobactersepticus)，該不動桿菌敗血菌的保藏號為CGMCCNO：10855。第二方面，本發明提供了一種含有上述不動桿菌敗血菌(Acinetobactersepticus)的菌劑。第三方面，本發明提供了上述不動桿菌敗血菌和/或菌劑在鈍化砷中的應用。第四方面，本發明提供了一種鈍化砷的方法，所述方法包括：將上述不動桿菌敗血菌和/或上述菌劑與砷汙染樣品接觸，以對砷汙染樣品中的砷進行鈍化。本發明的不動桿菌敗血菌為重金屬砷高效鈍化菌株，能夠降低砷在水相或土壤相中的生物可利用度。與現有技術相比，本發明的不動桿菌敗血菌能夠高效鈍化土壤相(對土壤擾動小)或水相中的砷，可耐受高濃度的砷汙染，操作簡便，可在砷汙染的土壤或含砷廢水的生物修復過程中發揮重要作用，實現環保綠色修復的目的。本發明的其它特徵和優點將在隨後的具體實施方式部分予以詳細說明。附圖說明圖1為平板劃線得到的單菌落圖。圖2為AgNO3溶液漫過不動桿菌敗血菌菌落後的菌落效果圖。生物保藏本發明的不動桿菌敗血菌(Acinetobactersepticus)，於2015年5月22日被保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，郵政編碼：100101)(保藏單位的縮寫為CGMCC)，保藏編號為CGMCC：10855。具體實施方式以下對本發明的具體實施方式進行詳細說明。應當理解的是，此處所描述的具體實施方式僅用於說明和解釋本發明，並不用於限制本發明。第一方面，本發明提供了一種不動桿菌敗血菌(Acinetobactersepticus)，該不動桿菌敗血菌的保藏號為CGMCCNO：10855。本發明的保藏號為CGMCCNO：10855的不動桿菌敗血菌，為革蘭氏陰性菌，屬於莫拉氏菌科不動桿菌屬敗血菌。該菌株來源於安徽宣城砷汙染土壤，採用土壤環流方式篩選並通過稀釋平板方法分離純化得到。生物學特性包括：形態特徵為在LB固體培養基上菌落為淡黃色、圓形、邊緣整齊、表面溼潤光滑，顯微鏡觀察呈粗短杆狀，無鞭毛；革蘭氏染色試驗、澱粉酶實驗、氧化酶試驗、硝酸鹽還原試驗、產H2S實驗陰性，明膠液化試驗、接觸酶試驗陽性，不能利用甘露糖。其中，本發明的不動桿菌敗血菌的分離過程可以包括：將100g土壤與適量粒徑約為3mm的砂粒混合均勻，置於環流富集裝置的上層，200mlLB培養基作為環流液置於下層。啟動蠕動泵，富集過程中根據環流液的蒸發情況定期補加環流液。富集結束後，取上層土壤與下層環流液進行平板劃線純化分離：將上清液分別稀釋10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8， 吸取適量塗布於含有25、50、100、150、200、400mg/LAs3+的LB固體培養基上，25-30℃培養3天後取菌落進行平板劃線，分離單菌落，如圖1所示。本發明從篩選出的菌株中獲得了一株對重金屬砷耐抗性最強的菌株As‐T，對該菌株進行生理生化鑑定分析，其生物學特性包括：形態特徵為在LB固體培養基上菌落為淡黃色、圓形、邊緣整齊、表面溼潤光滑，顯微鏡觀察呈粗短杆狀，無鞭毛；革蘭氏染色試驗、澱粉酶實驗、氧化酶試驗、硝酸鹽還原試驗、產H2S實驗陰性，明膠液化試驗、接觸酶試驗陽性，不能利用甘露糖。同時，根據天根細菌基因組DNA提取試劑盒(TIANampbacteriaDNAkit)步驟提取該菌株的DNA，進行16SrDNA基因序列分析，其16srDNA基因序列如SEQIDNO.1所示，結果表明該菌為不動桿菌敗血菌(Acinetobactersepticus)。將該不動桿菌敗血菌菌保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCCNO：10855。本發明提供的不動桿菌敗血菌經過培養能夠產生大量不動桿菌敗血菌的活菌體，所述培養的方法沒有特別的要求，只要是能使所述不動桿菌敗血菌增殖即可，例如，可以按照107CFU/mL的接種量將不動桿菌敗血菌的活菌體接種於LB培養基中，在25-38℃的溫度下培養12-48小時後，得到培養液。本發明中，對於不動桿菌敗血菌的培養條件沒有特別的限定，可以為本領域常用的各種培養條件，例如，培養時所用的LB液體培養基的組成可以為：0.8-1重量％蛋白腖，0.5-0.8重量％酵母粉，1-1.5重量％氯化鈉，pH＝6.8-7.0。固體LB培養基中還含有2.5-3.0重量％的瓊脂。培養時所用的無機鹽培養基的組成可以為：0.8-1.2重量％KH2PO4，0.8-1.2重量％K2HPO4，1-1.5重量％NH4NO3，0.03-0.08重量％MgSO4，0.001-0.003重量％CaCl2，0.01-0.03重量％FeSO4·7H2O，pH＝6.0-7.5。本發明可以進一步分離上述培養液中的不動桿菌敗血菌的活菌體，所述分離的方法沒有特別的限制，只要是能從培養液中富集菌體即可，例如可以通過離心和/或過濾的方法實現，所述離心和所述過濾的條件可以為公知的條件，本發明在此不再贅述。本發明還可以進一步從不動桿菌敗血菌的活菌體中得到細胞內提取物，對於得到細胞內提取物的方法沒有特別的限定，可以為本領域常用的各種方法，例如可以為在冰浴條件下對菌體進行超聲破碎，離心取上清。第二方面，本發明提供了含有保藏號為CGMCCNO：10855的不動桿菌敗血菌(Acinetobactersepticus)的菌劑。本發明的發明人在研究的過程中意外的發現，本發明的不動桿菌敗血菌的死菌體和活菌體均能夠有效對重金屬砷進行鈍化。因此，如上所述的不動桿菌敗血菌的菌體可以為活菌體，也可以為死菌體，還可以為活菌體和死菌體的混合菌體。即菌劑含有所述不動桿菌敗血菌的死菌體和/或活菌體。但更令人驚奇的是，本發明的發明人發現，本發明提供的不動桿菌敗血菌的細胞內提取物，對重金屬砷的鈍化效果更佳，因此，優選情況下，菌劑含有所述不動桿菌敗血菌的細胞內提取物。根據本發明，對於以上死菌體的製備方法沒有特別的限制，例如但不限於，可以通過自然裂解製備，也可以通過熱致死製備，還可以通過冰浴條件下超聲破碎製備，其中以冰浴條件下超聲破碎製備效果最優。對於得到細胞內提取物的方法沒有特別的限定，可以為本領域常用的各種方法，例如可以為在冰浴條件下對菌體進行超聲破碎，離心取上清。本發明中，對菌劑中所述不動桿菌敗血菌的濃度或細胞內提取物的量沒有特別的限定，可以根據具體的情況進行具體的選擇，在此不再詳細贅述。另外，根據預定的用途不同，本發明提供的菌劑可以製備為不同的劑型，並添加相應的賦形劑等成分。其中，在何種劑型的菌劑中添加何種賦形劑為 本領域技術人員所公知，在此不再詳細贅述。第三方面，本發明提供了上述不動桿菌敗血菌和/或菌劑在鈍化砷中的應用。優選情況下，砷源為砷汙染的土壤或含砷廢水。本發明中，「鈍化砷」是指降低砷汙染樣品中重金屬砷(As3+)的含量及其生物有效性，從而達到修復重金屬砷汙染的環境的目的。第四方面，本發明提供了一種鈍化砷的方法，該方法包括：將保藏號為CGMCCNO：10855的不動桿菌敗血菌和/或含有保藏號為CGMCCNO：10855的不動桿菌敗血菌的菌劑與砷汙染樣品接觸，以對砷汙染樣品中的砷進行鈍化。本發明方法中，對於接觸的方法沒有特別的限定，可以為本領域常用的各種的方法，例如可以在砷汙染樣品中加入保藏號為CGMCCNO：10855的不動桿菌敗血菌和/或含有保藏號為CGMCCNO：10855的不動桿菌敗血菌的菌劑，混合均勻。優選情況下，所述樣品為土壤或含砷廢水。本發明方法中，對於加入至砷汙染樣品中的不動桿菌敗血菌的形式並沒有特別的限定，只要保證加入後所述不動桿菌敗血菌能夠在所述砷汙染樣品中起作用並且對重金屬砷有效鈍化即可，加入的所述不動桿菌敗血菌的形式，例如，可以為培養至對數期的菌體或菌液，也可以為冷凍乾燥後的菌體乾粉，還可以為其細胞內提取物。本發明對加入的不動桿菌敗血菌的數量和菌劑的量也沒有特別的限制，這可以根據所述砷汙染樣品中的砷的含量以及鈍化難易程度來決定，例如，當所述樣品中的砷含量較高或較難鈍化或對於所述不動桿菌敗血菌的生存較不利時，可以提高所述不動桿菌敗血菌的接種量和菌劑的加入量；當所述樣品中的砷含量較低或較易鈍化或對所述不動桿菌敗血菌的生存的影響較小時，可以減少所述不動桿菌敗血菌的接種量和菌劑的加入量。根據本發明，當砷汙染樣品為土壤時，為了進一步促進本發明提供的不 動桿菌敗血菌對砷的鈍化效率，優選的，將土壤中的水含量控制在至少15重量％，更優選為18-30重量％。實施例以下將通過實施例和對比例對本發明進行詳細描述，但並不因此限制本發明。以下實施例和對比例中的實驗方法中，如無特殊說明，均為本領域常規方法。下述實施例和對比例中所用的實驗材料，如無特殊說明，均為自常規生化試劑商店購買得到。砷去除率＝(處理前As3+含量-處理後As3+含量)/處理前As3+含量×100％。製備例將本發明的保藏號為CGMCCNO：10855的不動桿菌敗血菌在LB液體培養基中活化2次，每次活化均在170rpm、30±1℃下進行12小時，得到菌液，將得到的菌液以3體積％的接種量接種於300mlLB液體培養基中，在170rpm、30±1℃的培養條件下進行培養，2h後進入對數期，12h後到達穩定期，菌濃度OD600約為6。實施例1本實施例用於說明本發明的保藏號為CGMCCNO：10855的不動桿菌敗血菌的氧化效果將300mlLB液體培養基在121℃下滅菌15min，接入1體積％的製備例得到的菌液，170rpm、30±1℃下培養12h。取1ml菌液，按照10-3、10-4、10-5稀釋後分別均勻塗布於LB固體培養基上，3天後均長出淡黃色圓形菌落，然後在LB固體培養基的一側均分別添加1ml新配製的5重量％AgNO3溶液， 使AgNO3溶液分別漫過菌落，靜置30min，如圖2(圖2中從左到右依次對應10-3、10-4、10-5稀釋後的菌落圖)所示，觀察到AgNO3溶液漫過區域明顯變黑，表明該菌具有很強的氧化性。實施例2本實施例用於說明本發明的保藏號為CGMCCNO：10855的不動桿菌敗血菌在水相中對砷的耐受性及鈍化能力向300mlLB液體培養基中加入As3+溶液(將As2O3溶解於37.5％的HCl溶液中，得到As3+溶液)，使As3+濃度分別為50mg/L、100mg/L、200mg/L和250mg/L，將培養基的pH值調節為7.0後121℃滅菌15min。分別向滅菌後的前述LB液體培養基中以3體積％的接種量接入製備例得到的菌液。170rpm、30±1℃下培養，取樣測菌液OD600值及As3+的濃度並計算As3+去除率。其中，As3+的濃度用ICP-AES法進行測定，測定方法包括：取適量菌液，8000rpm離心5min，取上清液，採用ICP-AES檢測上清液中As3+濃度，ICP-AES的條件包括：吸收波長為189.0nm。結果顯示：48h時，在As3+濃度為50mg/L、100mg/L、200mg/L和250mg/L下，該菌株能達到的最高OD600值分別為5.20、6.55、7.07和6.32，對As3+的去除率分別為43.66％、65.20％、88.0％和66.0％。表明本發明的保藏號為CGMCCNO：10855的不動桿菌敗血菌不僅能夠耐受高濃度的砷汙染，而且還有較高的砷鈍化能力。實施例3本實施例用於說明本發明的保藏號為CGMCCNO：10855的不動桿菌敗血菌對土壤中砷的鈍化效果將100mlLB液體培養基在121℃下滅菌15min，接入1體積％的製備例 得到的菌液，170rpm、30±1℃下培養12h。然後將前述菌液加入到1kg重金屬砷汙染土壤(As3+含量為49.33mg/kg)中，加入適量無菌去離子水，攪拌均勻，培養15d，保證每天土壤中含水量為20％。15天後，將土壤在70℃下烘乾，準確稱取0.5g，加入10ml65％重量％的HNO3後在195℃下微波消解20min，取上清液過濾，用ICP-AES測定As3+含量。土壤中As3+由49.33mg/kg降到8.26mg/kg。表明經此菌株處理過的砷汙染土壤中砷的含量明顯下降，說明該菌株對土壤中重金屬砷的鈍化具有良好的效果，能夠有效降低砷在土壤中的生物可利用度。實施例4本實施例用於說明本發明的保藏號為CGMCCNO：10855的不動桿菌敗血菌在水相中不同形態對砷的鈍化效果將100mlLB液體培養基在121℃下滅菌15min，然後接入1體積％的製備例得到的菌液，170rpm、30±1℃下培養12h。將菌液平均分成2份，一份4℃離心取上清，即為上清樣品；另一份121℃滅菌15min，然後將菌液4℃離心取上清，即為高溫滅菌樣品。用10mmol/LTris-HCI緩衝液(pH7.0)洗滌與上清樣品對應的離心得到的菌體2次後重懸，然後在冰浴條件下超聲破碎，超聲頻率為25KHz，超聲時間為20min，4℃離心取上清，即為細胞內提取物樣品。3份樣品分別加入一定量的As3+溶液(將As2O3溶解於37.5％的HCl溶液中，得到As3+溶液)，使As3+濃度為200mg/L，並調節樣品最終pH值為7.0。48h後離心並測定上清液中的As3+濃度，As3+去除率結果如表1所示。表1項目As3+去除率上清樣品32.8％高溫滅菌樣品22.4％細胞內提取物樣品87.5％由表1可以看出，細胞內提取物樣品對As3+去除率高達87.5％，遠高於上清樣品和高溫滅菌樣品，表明本發明的CGMCCNO：10855的不動桿菌敗血菌的細胞內提取物樣品能夠更有效的鈍化砷。以上詳細描述了本發明的優選實施方式，但是，本發明並不限於上述實施方式中的具體細節，在本發明的技術構思範圍內，可以對本發明的技術方案進行多種簡單變型，這些簡單變型均屬於本發明的保護範圍。另外需要說明的是，在上述具體實施方式中所描述的各個具體技術特徵，在不矛盾的情況下，可以通過任何合適的方式進行組合，為了避免不必要的重複，本發明對各種可能的組合方式不再另行說明。此外，本發明的各種不同的實施方式之間也可以進行任意組合，只要其不違背本發明的思想，其同樣應當視為本發明所公開的內容。當前第1頁1&nbsp2&nbsp3&nbsp