一種野大麥成熟胚愈傷組織誘導及再生體系建立方法與流程
2023-10-09 03:55:24 1
本發明涉及屬於農業栽培中通過組織培養技術的植物再生領域，具體涉及一種野大麥成熟胚愈傷組織誘導及再生體系建立方法。
背景技術：
野大麥又稱短芒大麥，為禾本科大麥屬多年生草本植物，是一種具短根莖的多年生牧草，無性繁殖力較強，經常以株叢形式分布於鹽生植物群落中，在松嫩平原鹼化草甸可形成大面積的單優群落。野大麥具有草質好，營養豐富，乾草中蛋白質及脂肪含量較高，適口性好，抗惡劣環境，耐踐踏等優良特性，是人工栽培草地和草地改良過程中的優選良種。
隨著草場的退化和耕地面積的日益減少，不斷培育優質、高產、多抗的牧草新品種成為國內外牧草研究工作者關注的熱點問題。就育種而言，除了傳統的育種手段，結合基因工程技術來培育新品種能加速育種進程，更有效地選育出目標品種。而野大麥組織培養是利用基因工程技術進行基因改良的基礎，只有建立了穩定、高頻的再生體系，才能構建較好的遺傳轉化體系，提高轉化效率，獲得轉基因植株，進而獲得改良新品種。
目前，國內野大麥離體再生體系研究還不完善，朱進等以野大麥的成熟胚為外植體誘導愈傷組織，在含 NaCl的MS培養基上篩選到的耐鹽變異體具有一定的耐鹽性且較穩定，並分化出了再生植株。
技術實現要素：
為了解決現有技術中存在的問題，本發明提供了一種野大麥成熟胚愈傷組織誘導及再生體系建立方法。本發明公開了一種通過野大麥成熟胚為外植體，構建愈傷組織誘導、植株再生獲得再生體系，為探索其細胞工程育種和遺傳改良研究提供可靠的技術支持。
本發明提供一種野大麥成熟胚愈傷組織誘導及再生體系建立方法，步驟如下：
（1）選擇野大麥種子並消毒；
（2）誘導培養基、分化增殖培養基和生根培養基的篩選：
誘導培養基：基礎培養基+0.1-0.5 mg·L-1 6-BA +1.0-2.0 mg·L-1 2,4-D；
分化增殖培養基：基礎培養基+0.5-1.5mg/L 6-BA + 0.2-0.4mg/L NAA，
生根培養基：1/2基礎培養基；
所述基礎培養基為：MS培養基+蔗糖30g·L-1+瓊脂10g·L-1；
（3）成熟胚的處理和誘導分化：取步驟（1）中消毒的野大麥種子，置於誘導培養基中培養，繼代幾次後轉入分化和增殖培養基中繼續培養，繼代幾次後轉入生根培養基中進行培養，待分化苗的根長4-6cm時，將瓶苗移出培養室，自然光下閉瓶煉苗，2d後注入自來水，自然光下開瓶煉苗3d，然後洗淨根部，滅菌，用基質培養，獲得完整的再生植株。
作為優選，步驟（2）中，
所述誘導培養基為：基礎培養基+0.3 mg·L-1 6-BA +1.5 mg·L-1 2,4-D；
所述分化增殖培養基為：基礎培養基+0.5mg/L6-BA + 0.2mg/L NAA；
所述生根培養基為：1/2基礎培養基；
所述基礎培養基為：MS培養基+蔗糖30g·L-1+瓊脂10g·L-1。
作為優選，步驟（3）中所述誘導培養的條件為：於恆溫25±2℃條件下黑暗培養30d。
作為優選，步驟（3）中所述分化增殖培養的條件為：光照培養，光照強度1500-2000Lux，每天光照16 h·d-1，培養溫度為25℃。
作為優選，步驟（3）中所述生根培養的培養條件為：在 25±2℃、光照強度為2000-3000lx、光照時間16h·d-1條件下培養。
本發明的有益效果為：
（1）本發明公開了一種野大麥成熟胚愈傷組織誘導培養及再生體系的構建方法，以採集臨澤的野大麥成熟胚為外植體，通過不同生長調節物質對愈傷組織的誘導、分化、生根等步驟的影響，進行愈傷組織誘導培養基的篩選，獲得出愈率較高的培養基為：基礎培養基+0.3mg/L6-BA+1.5mg/L2,4-D,誘導率為50%；分化和植株再生培養基為基礎培養基+0.5mg/L6-BA+0.2mg/L NAA，分化率為80%，生根成苗培養基為：1/2基礎培養基，生根率達100%；其中，基礎培養基為MS培養基加蔗糖30g·L-1和瓊脂10g·L-1。提供了一種高效效野大麥成熟胚組織培養方法。與已有的野大麥再生體系報導相比，本發明的植株再生率顯著提高。
（2）本發明選用野大麥成熟胚為外植體，進行組織再生培養，不受取材材料時空限制。本發明為野大麥愈傷組織誘導的組培方法，操作簡單，成本廉價；建立的野大麥成熟胚培養植株再生方法體系，為探索其細胞工程育種和遺傳改良研究提供可靠的技術支持。
附圖說明
附圖用來提供對本發明的進一步理解，並且構成說明書的一部分，與本發明的實施例一起用於解釋本發明，並不構成對本發明的限制。在附圖中：
圖1為成熟胚誘導愈傷組織；
圖2為愈傷組織分化綠苗；
圖3為生根的幼苗；
圖4為移栽後的再生植株。
具體實施方式
以下的實施例便於更好地理解本發明，但並不限定本發明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為市售。
本發明的方法具體步驟如下：
（1）植物材料選取及處理：選擇色澤、大小均勻的野大麥成熟種子，去除外稃後在流水下衝洗30分鐘，然後用75%酒精處理5min，無菌水衝洗2-3次，用10%次氯酸鈉消毒10min，無菌水衝洗3-5次，將種子置於無菌濾紙，直至種子水分吸乾後待用；所述的野大麥種子指的是：採集於甘肅臨澤野大麥野生種子。
（2）誘導和分化增殖培養基篩選：基礎培養基為MS培養基加蔗糖30 g·L-1和瓊脂10 g·L-1；
誘導培養基和分化增殖培養基為基礎培養基附加不同處理激素。
誘導培養基是在基礎培養基的基礎上添加6-BA和2,4-D。設置6-BA濃度為0.1 mg·L-1、0.3 mg·L-1、0.5 mg·L-1；2,4-D的濃度為1. 0 mg·L-1、1.5 mg·L-1、2.0 mg·L-1（表1）；
分化和增殖培養基是在基礎培養基的基礎上添加6-BA和NAA。設置6-BA濃度為0.5 mg·L-1、1.0 mg·L-1、1.5 mg·L-1；NAA的濃度為0.2 mg·L-1、0.4 mg·L-1（表2）；
生根培養基為1/2基礎培養基。
以上培養基pH均調至5.8～6.0，在121℃下高壓溼熱滅菌20min。
（3）成熟胚的處理和誘導分化：本步驟對各部分的培養條件進行了優化選擇，在以下培養條件時能夠取得最佳的培養效果。具體培養方法如下：取步驟（1）中消毒處理好的種子，置於含有不同濃度的誘導培養基中，於恆溫培養箱(25±2)℃條件下黑暗培養30d，期間將意外染菌重複除去，統計出愈率和生長狀況。並將愈傷組織轉入最優的誘導培養基進行繼代增殖，繼代周期為15d，繼代三次後轉入含有不同濃度的分化和增殖培養基進行光照培養，光照強度1500-2000Lux，每天光照16 h·d-1，培養溫度為25℃，每2周繼代一次，繼代3次，30d後統計愈傷組織分化率及出苗率；
（4）待分化苗長至2-3cm時，將應用最優分化和增殖培養基培養的分化苗轉入生根培養基，在 (25±2)℃、光照強度為2000～3000lx、光照時間16 h·d-1條件下培養。待分化苗的根長5cm左右，將瓶苗移出培養室，自然光下閉瓶煉苗，2d後注入自來水，自然光下開瓶煉苗3d後統計生根率。洗淨根部後，移入高壓蒸汽滅菌後基質（珍珠巖：蛭石：營養土（購自杭州瑞波園藝資材部）=2:3:1）培養，獲得完整的再生植株。
表1 不同濃度6-BA 和2,4-D組合對野大麥愈傷組織形成的影響
由表1可知，當培養基中添加0.1mg/L6-BA + 1.5mg/L2,4-D時，誘導率達75%，但愈傷組織質地較鬆散，不利於後期的分化組織的形成；添加0.3mg/L6-BA + 1.5mg/L2,4-D誘導率為49.72%，愈傷組織為淡黃色，質地緻密，增殖速度快。總體而言，愈傷組織的誘導率在6-BA的濃度為0.1-0.3mg/L之間，隨著2,4-D濃度的增加呈先升高後下降，但是差異性不顯著。因此，最佳誘導培養基為：基礎培養基+0.3 mg·L-1 6-BA +1.5 mg·L-1 2,4-D。
表2不同濃度6-BA和NAA組合對野大麥愈傷組織分化能力的影響
由表2可知，在培養基中加入不同激素及其濃度組合，分化率存在明顯差異。當NAA濃度相同時，隨著6-BA濃度的升高，愈傷組織的分化率呈先升高後下降的趨勢，激素為1.0mg/L6-BA + 0.4mg/L NAA 和1.5mg/L6-BA + 0.2mg/L NAA組合，愈傷組織的分化率最高，分別達到93.33%和86.66%，但是分化苗後期生長狀況不是很好，死亡率較高。當激素濃度為0.5mg/L6-BA + 0.2mg/L NAA時，愈傷組織的分化率為80%，分化苗後期成活率高，生長較旺盛。因此，野大麥愈傷組織分化的最佳培養基為基礎培養基+0.5mg/L6-BA + 0.2mg/L NAA。
實施例1
本發明的方法具體步驟如下：
（1）植物材料選取及處理：選擇色澤、大小均勻的野大麥成熟種子，去除外稃後在流水下衝洗30分鐘，然後用75%酒精處理5min，無菌水衝洗2-3次，用10%次氯酸鈉消毒10min，無菌水衝洗3-5次，將種子置於無菌濾紙，直至種子水分吸乾後待用；所述的野大麥種子指的是：採集於甘肅臨澤的野生野大麥種子。
（2）誘導培養基、分化增殖培養基和生根培養基的配方如下：
基礎培養基為MS培養基加蔗糖30g×L-1和瓊脂10 g×L-1；
愈傷組織誘導培養基為：基礎培養基+0.3 mg·L-1 6-BA +1.5 mg·L-1 2,4-D；
分化增殖培養基為：基礎培養基+0.5mg/L6-BA + 0.2mg/L NAA；
生根培養基為：1/2基礎培養基。
以上培養基pH均調至5.8～6.0，在121℃下高壓溼熱滅菌20min；
（3）成熟胚的處理和誘導分化：取步驟（1）中消毒處理好的種子，置於誘導培養基中，於恆溫培養箱(25±2)℃條件下黑暗培養30d，期間將意外染菌重複除去，然後進行繼代增殖，繼代周期為15d，繼代三次後，測得誘導率為50%；轉入分化增殖培養基進行光照培養，光照強度1500-2000Lux，每天光照16 h·d-1，培養溫度為25℃，每2周繼代一次，繼代3次，30d後統計愈傷組織分化率及出苗率，增殖率為80%；
（4）待分化苗長至2-3cm時，轉入生根培養基，在 (25±2)℃、光照強度為2000～3000lx、光照時間16 h·d-1條件下培養，生根率為100%。待分化苗的根長5cm左右，將瓶苗移出培養室，自然光下閉瓶煉苗2d後注入自來水，自然光下開瓶煉苗3d後統計生根率。洗淨根部後，移入高壓蒸汽滅菌後基質（珍珠巖：蛭石：營養土（購自杭州瑞波園藝資材部）=2:3:1）培養，獲得完整的再生植株。
最後應說明的是：以上所述僅為本發明的優選實施例而已，並不用於限制本發明，儘管參照前述實施例對本發明進行了詳細的說明，對於本領域的技術人員來說，其依然可以對前述各實施例所記載的技術方案進行修改，或者對其中部分技術特徵進行等同替換。凡在本發明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護範圍之內。