一種精氨酸雜合細胞穿膜肽及其應用的製作方法

2023-10-04 15:50:19 2

專利名稱：一種精氨酸雜合細胞穿膜肽及其應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物分子領域。
背景技術：
隨著生物工程學，基因組學，生物和有機化學的發展，各種類型的新型藥物分 子，如短肽(P印tides)，單克隆抗體蛋白(monoclonal antibodies)，反義寡核苷酸 (antisenseoligo薦leotides)，核酶(ribozymes)，催化DNA(catalytic DNA)等紛紛被開 發出來。這些具有極大生物學和醫學意義的分子(當然也包括傳統的質粒和融合蛋白)往 往由於其過大的分子量和本身的親水性質，限制了他們的在體應用。由於生物膜系統的阻 礙，這些分子很難進入到靶向器官和組織的細胞中去發揮作用。針對這些問題，不同的技術 被開發出來，他們都有各自的優缺點。 病毒片段重組技術(recombinant viral vector)可以通過病毒片段的表達，將重 組蛋白(recombinant proteins)，核醇(ribozymes)，反義RNA (antisense RNAs)在革巴細胞 中原位表達。病毒片段重組技術目前已被廣泛應用。但是該技術並不是在所有情況下適用。 同時，其在轉染效率和生物毒性上都面臨困難。同時，該技術也無法做到組織靶向性。目前 很多非病毒載體被研發出來，但是大多數的非病毒載體在轉染效率上依舊難以超越病毒載 體。 也有研究者採用物理透膜方式如電穿孔、微管注射、穿孔蛋白法等。這些方式雖然 各有優勢，但是也存在一些缺點導入率低、對細胞剌激大甚至可能導致細胞死亡、靶向性 不強。因此研究者致力於尋求更具高效的透膜方式。 多肽介導的生物活性分子透膜技術，在許多方面優於常用的透膜方式。另外在合 成上多肽具有高產率，對細胞毒性低，而且肽骨架能夠進行不同的修飾，這樣的多肽在未來 的給藥平臺具有很大潛在的利用價值 細胞穿膜肽(cell-penetrating p印tides， CPP)也稱蛋白轉導域 (proteintransduction domains, PTDs)的發現和應用給藥物投遞系統帶了新的方向和希 望。細胞穿膜肽發源於人免疫缺損病毒HIV-1編碼的TAT蛋白衍生物和果蠅觸角同源異型 的轉錄調節蛋白(Ante皿即edia)，目前已經發展有各種形式，包括全L型/D型多聚精氨酸 (oilgo-Arginines)，非天然肽(non_natural peptides)，擬肽(p印toids)，胍基端聚合物 (guanidinium-terminated dendrimers)等。1988年，Green禾口 Frankel首次發現人免疫缺 損病毒(HIV)-1的反式激活蛋白TAT能夠穿透細胞膜進入細胞內部，並能進一步定位於細 胞核。1994年，Fawell等人將TAT蛋白片段TAT(37-72)與某些蛋白(P-galactosidase orhorseradish peroxydase)共價連接，發現TAT蛋白片段可以將大分子蛋白帶入到不同 細胞系中。後續的研究發現TAT蛋白的部分序列TAT(49-57)即可行使蛋白轉運功能，而 且可以攜帶多種物質，包括親水性蛋白、多肽、DNA甚至顆粒型物質進入細胞。研究者提 出，對於TAT蛋白類穿膜肽的穿膜能力起核心作用的是精氨酸的數目，也即胍基基團的數 目。在各式各樣的穿膜肽中，富含精氨酸的細胞穿膜肽(arginine-rich cell-penetratingp印tides)，簡稱AR-CPPs，由於其高效的穿膜效率和低細胞毒性，目前吸引了廣泛的關注和研究。 富含精氨酸的細胞穿膜肽(AR-CPPs)的穿膜機理目前還不是很清楚。最初的研究者認為，AR-CPPs以一種直接透過細胞膜的方式(非囊泡攝取方式)進入細胞，這種方式不受溫度，能量的影響，也不需要受體。當AP-CPPs通過直接進膜的方式進入細胞後，可以自由擴散到細胞質中，隨著時間的積累，會進一步在細胞核中出現並積累。但是，2003年，Richard等人指出在傳統觀察CPPs穿膜的實驗中，將細胞固定的操作使實驗結果受到了人為因素的幹擾。通過使用非固定的活細胞實驗，他們觀測到螢光標記的TAT(48-60)和(L-Arg)9進入細胞後，被困在囊泡狀小體中(endosome-like punctuate vesicles)，同時，在細胞質或者細胞核中卻沒有檢測到螢光標記的穿膜肽存在(由於無法衝破囊泡小體的限制)。實驗也驗證，細胞穿膜肽進入細胞需要能量的支持，同時受溫度變化的影響。雖然關於AR-CPPs的穿膜機理依舊存在爭論和質疑，胞吞作用(endocytosis)是AR-CPPs進入細胞的普遍方式在目前已經被廣泛接受。這種胞吞機制的建立也給AR-CPPs的生物學應用提出了新的問題和困難在AR-CPPs或者攜帶外源貨物分子的AR-CPPs進入細胞後，如何將其從囊泡小體釋放出來使其真正行使功能？目前，已經有很多研究小組報導，雖然AR-CPPs有很高的穿膜效率，但是大部分進入細胞的AR-CPPs及其負載的貨物分子都被困在了囊泡小體中，無法釋放到細胞質或細胞核中去真正行使功能。當然，也有一些研究小組指出，當濃度提高到一定程度後，可以看到部分穿膜肽可以從囊泡釋放到細胞質中去，但是這種高濃度也伴隨著高毒性。因此，目前認為，在較低濃度下，找到有效將AR-CPPs從囊泡小體中釋放出來的方法是實現AR-CPPs真正高效穿膜進入細胞質或細胞核的關鍵因素。儘管已經有研究小組嘗試提出一些方案來實現AR-CPP的囊泡小體釋放，但是這些方案要麼無法實現活體應用，要麼使得載體本身結構過於複雜。 AR-CPPs實現高效穿膜還需要面臨的另一個方面的挑戰由天然L型a胺基酸(L-a-amino acids)構建的AR-CPPs很容易被生物體中的酶降解而失去活性。 一般的解決的方法是採用非天然肽來構建細胞穿膜肽，常用的有P肽(P-p印tides)，擬肽(p印toid)以及天然肽(L型)所對應的D型化合物(D-ismoers)。但是，這些非天然肽由於其單體昂貴的價格或還沒有商業化而難以製備，不適合商業生產。

發明內容
本發明的目的是解決上述問題，提供一種精氨酸雜合細胞穿膜肽及其應用，該細胞穿膜肽能夠攜帶標記物和貨物分子高效、低細胞毒性的進入細胞內部，同時具有很強的抗酶解、抗血清降解能力，並且進入細胞後可以從囊泡小體中逃逸。另外，這種細胞穿膜肽相比由全非天然胺基酸構建的穿膜肽，合成的價格更加低廉，適合商業普及。
本發明所採用的技術方案是 —種精氨酸雜合細胞穿膜肽，該細胞穿膜肽由非天然D型精氨酸(r)與天然L型精氨酸(R)雜合構建而成，分子式為(r)n(R)m，r與R在結構中可以隨機排列，n和m是胺基酸殘基數目，滿足4《n+m《12，1《n《ll，l《m《11。 進一步地，所述細胞穿膜不能由全非天然D型精氨酸(r)與全天然L型精氨酸(R)雜合構建而成。
—種精氨酸雜合細胞穿膜肽的應用該細胞穿膜肽的N端和C端可以單獨或者同
時連接不同的標記物或者貨物分子，並攜帶標記物和貨物分子進入到細胞內部。 進一步地，所述細胞穿膜肽攜帶標記物和貨物分子能進入到細胞核內進行核定位。
上面所述的標記物可以為螢光素，生物素，放射性物質或者特定的親和基團等；貨
物分子可以為蛋白，多肽，DNA、藥物小分子前體、多胺類，甚至比自身分子量大很多倍的寡
聚核苷酸，金屬顆粒等。
本發明具有以下優點 (1)該細胞穿膜肽能夠攜帶標記物和貨物分子高效、低細胞毒性的進入細胞內部。
(2)該穿膜肽具有很強的抗酶解能力(天然胺基酸構建的穿膜肽在5min內被胰酶 降解，而混合型穿膜肽可以在胰酶溶液保存數天)，可以保證穿膜肽在攜帶各類貨物分子進 入組織或細胞時，不會被生物體內的蛋白酶降解掉。同時，在長時間後，也可以逐步被分解， 從而不會在生物體內長時間積累而造成毒性。 (3)該穿膜肽有一定的抗血清降解能力。可以保證穿膜肽在攜帶各類貨物分子進 入組織或細胞時，不會被血清降解，同樣的，在長時間後，也可以逐步被血清分解，從而不會 在生物體內長時間積累而造成毒性。 (4)該穿膜肽區別以往的穿膜肽的最大特點在於，在進入細胞後可以的從囊泡小 體中逃逸，實現真正的在進入細胞內部，擴散到細胞質和細胞核中，尤其是特異性的進入細 胞核核仁區域。


圖1為細胞穿膜肽的抗胰酶降解實驗中的結果顯示圖；
圖2為流式細胞儀檢測細胞穿膜肽穿膜效率的顯示圖；
圖3為細胞穿膜肽孵育細胞後雷射共聚焦成像的顯示圖；
圖4為MTT檢測細胞穿膜肽細胞毒性實驗的結果顯示圖。
具體實施方式

實施例1 將非天然D型精氨酸(r = D-arginine)和天然L型精氨酸(R = L-arginine)交 替連接成一個八聚肽，命名為(rR)4。作為對照組，設計了全L型精氨酸八聚物，命名為Rs。 R8的穿膜效率遠高於傳統的TAT,57蛋白，但是由於同樣依靠內吞作用，在穿膜後被困在囊 泡中。將兩種穿膜肽分別用常見的無毒性螢光素FITC標記。 在檢測細胞穿膜肽的實驗中，不同研究小組檢測穿膜肽進入細胞的結果往往各 異。從不同研究小組的實驗流程和結果顯示，細微的實驗條件變化都將影響細胞實驗結果。 研究表明如果採用先固定細胞後觀察的方案，就會導致細胞穿膜肽在細胞內分布的結果受 到人為幹擾，從而影響了對細胞穿膜機制判斷。我們的實驗顯示，影響細胞穿膜肽進入細胞 的效率和及其在細胞內分布的因素，不僅包括細胞種類和孵育的穿膜肽的濃度；孵育時間， 孵育溫度，細胞生長狀態，細胞數目，穿膜肽孵育體積，穿膜肽給藥方式(不可直接向樣品 直接加入穿膜肽，應先將穿膜肽與培養基先混合均勻，再溫和的將混合後穿膜肽均勻緩慢的滴加)都對細胞穿膜效率尤其是進入細胞後的分布有顯著的影響。為了保證實驗的嚴謹性，我們使用目前公認為高效且常用的R8作為對照穿膜肽，選擇已被廣泛使用的HeLa細胞作為細胞模型，同時對上述所有的實驗條件進行嚴格監控，保證在相同的條件下評估對兩組穿膜肽進行評估。
合成肽 (rR)4的合成通過標準的固相態合成，標記基團螢光素FITC(FITC =fluoresceinisothiocyanat)通過正氨基己酸(aminohexanioc acid， AHC)與縮合肽N端相連。作為對照，標記了 FITC的R8通過同樣的流程合成。
細胞穿膜肽抗胰酶降解實驗 將胰酶溶於甘油Tris *HC1(1 : 1)混合溶液配成胰酶母液，將穿膜肽溶於Tris 'HCl(100mM， pH 7.2)中，終濃度為150 yM。按胰酶穿膜肽(100 : 1)的比例，把胰酶母液(終濃度35. 8mg/mL)加入穿膜肽溶液，37。C孵育。每隔一段時間，從混合溶液終取出50iiL，加入150mL IN HCL並冰浴，中止胰酶的作用，將該樣品通過反向液相色譜(RP-HPLC)進行分析(flow = 1. OmL/min ;gradient :0min，A : B = 80 : 20 ;25min，A : B=55 : 45 ;A = 0. 1% TFA in water, B = 0. 1% TFA in acetonitrile)。
其結果顯示見附圖1 (a)和附圖1 (b) ，FITC-AHC_R8在5分鐘內被降解完全。而同樣條件下，FITC-AHC-(rR)4在60分鐘內一直保持穩定，直到70小時，還有近一半的穿膜肽沒有被降解。因此，相較於FITC-AHC-R8， FITC-AHC- (rR) 4有更好的酶穩定性，這保證了穿膜肽在有酶存在的情況下，也能很好地運載貨物分子。同時，可以發現FITC-AHC-(rRh依舊可以緩慢地被酶降解，這保證了在攜帶貨物分子進入細胞後，可以將貨物分子釋放出來，並且進入了細胞的穿膜肽也能夠被清除，從而降低對細胞和組織的毒性。
流式細胞儀檢測穿膜效率實驗 流式細胞儀無法區分螢光是來自於進入細胞的肽還是附在細胞膜上的肽。在用流式細胞儀檢測前，所有細胞樣品都用胰酶(trypsin)清洗來降解掉附著於胞外的細胞穿膜肽。但是由於已證明FITC-AHC-(rR)4有很好的胰酶(trypsin)抗性，而臺盼藍(trypanblue, TB)可以淬滅掉附著於細胞膜外側的穿膜肽，因此所有樣品需要用臺盼藍清洗。
從同一批次原代HeLa細胞接種相同數目(lX105Cells/Well)的細胞於24孔板，37°C、5% (A環境下培養過夜，使細胞重新貼壁。37°C，5% C02環境下，孵育細胞穿膜肽(10 M，孵育體積，350 L) 10分鐘，孵育混合液分別為無血清培養基DMEM和含10%胎牛血清(FBS)的培養基DMEM。孵育後，用PBS(ra 7.2)清洗，胰酶消化細胞。將消化下的細胞重懸後4000rpm離心5min。用冰浴的含PI (5 y g/mL)的PBS清洗細胞。清洗後用含1 %FBS的PBS(ra 7.2)將細胞重懸，避光冰浴保存等待檢測。檢測時，取出等份細胞懸液與臺盼藍(TB，500mg/mL溶於冰浴的ra 7. 2PBS)孵育lmin，直接上樣檢測。流式細胞儀型號FC-500BeckmanCoulter cytometer。分析軟體WinMdi。 其穿膜效率的顯示圖見附圖2，在加血清和不加血清的兩種情況下，本發明設計的FITC-AHC-(rR)4都比FITC_AHC_R8有著更好的穿膜效率。有報導全D型精氨酸寡聚物穿膜效率遠高於全L型精氨酸寡聚物，其原因主要在於全D型精氨酸寡聚物比全L型精氨酸寡聚物有更好的血清穩定性，在無血清孵育的條件下，兩者的穿膜效率幾乎等同。而實驗展示，即使在無血清孵育的條件下，FITC-AHC-(rRh的穿膜效率依舊遠高於全L型的FITC-AHC-R8。 穿膜肽孵育細胞雷射共聚焦成像 從同 一 批次原代HeLa細胞接種相同數目(2xl0、ells/we11)的細胞於 Lab-Tek I 8孔板。37°C、5% C02環境下培養過夜，使細胞重新貼壁。將PI (8 y g/mL)和 Hochest33324(10iig/mL)與細胞穿膜肽10 y M)共孵育。所有孵育分子混溶於無血清DMEM 高糖培養基。將混合好後的混合培養基緩慢均勻滴加入Lab-Tek I 8孔板。37°C、5%C02 環境下孵育10分鐘。孵育時間結束後，首先丟棄孵育培養基，用含PI的PBS(終濃度8yg/ mL)清洗細胞三次後，加入新的無PI的PBS，上鏡觀察。觀察結束後，將孔板內的PBS丟棄， 加入臺盼藍(trypanblue，TB，500ii g/mL)，孵育2min，丟棄孔板中的臺盼藍(trypan blue, TB)，再次用含PI的PBS (終濃度8 g/mL)清洗細胞三次後，加入新的無PI的PBS，上鏡觀 察。 成像條件所有細胞樣品通過共聚焦顯微鏡FV1000觀察。FITC由Ar雷射器在 488nm處激發，在495_555nm接受。PI由Ar雷射器在488nm處激發，在600-670nm接受。 Hochest33324由半導體雷射器在488nm處激發，在462_523nm接受。共聚焦顯微鏡型號 FV1000 (Ol卿us， Japan)。 其孵育細胞後雷射共聚焦成像的顯示圖見附圖3，其中圖3(a)表示R8孵育細胞 後，不用臺盼藍清洗，直接成像的穿膜肽(FITC標記)在細胞定位雷射共聚焦成像的顯示 圖，圖3(b)表示Rs孵育細胞後，加入臺盼藍清洗後的穿膜肽(FITC標記)在細胞定位雷射 共聚焦成像的顯示圖。可以看到臺盼藍萃滅掉細胞膜表面的穿膜肽後，Rs在細胞的定位始 終是囊泡狀小體。3(c)表示(rR)J哮育細胞後，不用臺盼藍清洗直接成像的穿膜肽(FITC 標記)在細胞定位雷射共聚焦成像的顯示圖，圖3(d)表示(rR)4孵育細胞後，加入臺盼藍清 洗後的穿膜肽(FITC標記)在細胞定位的雷射共聚焦成像的顯示圖。可以看到，臺盼藍可 以萃滅掉大部分膜上的穿膜肽(依舊可以看到的少許螢光斑點，應該是未萃滅完全的附在 膜上的穿膜肽)，(rR)J桴育細胞後，穿膜肽廣泛的分布到了細胞質中，同時，該穿膜肽同時 特異的標記細胞核，特別是核仁。圖3(e)表示(rR)J桴育細胞時，PI染色情況。PI可以特 異性染色死細胞的細胞核，該結果說明所有成像細胞生長狀態良好。圖3(f)表示(rR)J桴 育細胞時，Hochest33324染色情況。Hochest33324可以特異染色活細胞的細胞核。該結果 可以確定活細胞細胞核的位置。圖3(g)表示(rR)J桴育細胞後，將穿膜肽(FITC標記)定 位螢光圖、PI染色螢光圖、Hochest33324染色螢光圖疊加到一起的情況。可以看到穿膜肽 (FITC)和Hochest33324共定位，從而說明穿膜肽可以特異的標記活細胞細胞核。圖3 (h) 表示(rR)J桴育細胞時的細胞圖。可以看到細胞狀態良好。TB淬滅掉細胞膜上的大部分螢光後，FITC-AHC-(rR)4展現了與FITC_AHC_R8不同 的細胞內定位。FITC-AHC-R8雖然可以高效地進入細胞，但是進入細胞後全部被困在囊泡小 體中。而FITC-AHC-(rR)4廣泛地分布到了細胞質中，並且在核仁中發生了聚集，沒有看到 明顯的聚集在囊泡中的現象。
MTT檢測細胞毒性實驗 從同一批次原代HeLa細胞接種相同數目(4xl(fcells/we11)的細胞於96孔 板。37°C、5% (A環境下培養過夜，使細胞重新貼壁。37°C，5% 0)2環境下，孵育不同濃度 (3 ii m 30 ii m)細胞穿膜肽12小時，孵育後加入MTT (5mg/mL)。再次孵育2小時。丟棄所有孵育溶液，加入200iiL DMS0。通過酶標儀在570nm下檢測各孔的吸收值。酶標儀型號ELISAReader Genios Plus(Tecan，Switzland)通過MTT(3_4，5_dimethylthiazol_2_yl)_2，5_diphenyltetrazolium)檢測
FITC-AHC-(rR)4和FITC_AHC_R8的細胞毒性。兩種穿膜肽在不同濃度下分別孵育12小時
候，細胞活性並無顯著降低，兩者都展示了很低的細胞毒性，其結果如圖4所述。 對於精氨酸雜和細胞穿膜肽的結構，精氨酸殘基數目不僅僅限於8個。4 12個
精氨酸殘基構建的一系列寡具多肽都有相似的穿膜肽性質。穿膜效率隨著精氨酸數目增加
而增加。所以本發明所設計的精氨酸雜合細胞穿膜肽也不僅僅限於實例所述的8個精氨酸
殘基的細胞穿膜肽。精氨酸殘基數為4 12個，其中精氨酸殘基由不同比例天然精氨酸與
非天然精氨酸混合，這樣構建的細胞穿膜肽必然同樣具有實例中說述(rR)J勺各種性質。這
裡很難窮舉所有這樣的精氨酸雜合細胞穿膜肽結構，所以我們列舉了其中的一種情況，其
胺基酸序列表見說明書後面的序列表和光碟，該基因序列表僅僅指出實例中說述(rR)4的結構。 實施例2 按照上面的步驟，我們陸續做了其他結構的精氨酸細胞穿膜肽的驗證試驗，其中包括(rR)3、(rR)^等，這些實驗得出的各種結論也與(rR)4得情況基本相同，從而表明由非天然D型精氨酸(r)與天然L型精氨酸(R)雜合構建而成，結構為(r)n(R)m的精氨酸細胞，均可以攜帶標記物和貨物分子進入到細胞內部，而且具有穿膜效率高、抗酶解能力強、可以特異的標記活細胞細胞核以及低細胞毒性的特性。 以上實施例僅用以說明本發明的技術方案而非限制，儘管參照較佳實施例對本發
明進行了詳細說明，本領域的普通技術人員應當理解，可以對本發明的技術方案進行修改
或者等同替換，而不脫離本發明技術方案的精神和範圍，其均應涵蓋在本發明的權利要求
範圍當中。 序列表 〈110〉華中科技大學 〈120〉 一種精氨酸雜合細胞穿膜肽及其應用 〈160>8 〈210>1 〈211>8 〈212>PRT 〈213〉人工序列 〈400〉 1 Arg (D) -Arg (U -Arg (D) -Arg (U -Arg (D) -Arg (U -Arg (D) -Arg (U
Arg (D) -Arg (U -Arg (D) -Arg (U -Arg (D) -Arg (U -Arg (D) -Arg (U
權利要求
一種精氨酸雜合細胞穿膜肽，其特徵在於，所述細胞穿膜肽由非天然D型精氨酸(r)與天然L型精氨酸(R)雜合構建而成，分子式為(r)n(R)m，r與R在結構中可以隨機排列，n和m是胺基酸殘基數目，滿足4≤n+m≤12，1≤n≤11，1≤m≤11。
2. 根據權利要求1所述的精氨酸雜合細胞穿膜肽，其特徵在於，所述細胞穿膜不能由全非天然D型精氨酸(r)與全天然L型精氨酸(R)雜合構建而成。
3. —種精氨酸雜合細胞穿膜肽的應用，其特徵在於，所述細胞穿膜肽的N端和C端可以單獨或者同時連接不同的標記物或者貨物分子，並攜帶標記物和貨物分子進入到細胞內部。
4. 根據權利要求3所述的精氨酸雜合細胞穿膜肽的應用，其特徵在於，所述細胞穿膜肽攜帶標記物和貨物分子能進入到細胞核內進行核定位。
全文摘要
本發明公開了一種精氨酸雜合細胞穿膜肽及其應用，屬於生物分子領域。所述細胞穿膜肽由非天然D型精氨酸(r)與天然L型精氨酸(R)雜合構建而成，結構為(r)n(R)m，r與R在結構中可以隨機排列，n和m是胺基酸殘基數目，滿足4≤n+m≤12，1≤n≤11，1≤m≤11；該細胞穿膜肽的N端和C端可以單獨或者同時連接不同的標記物或者貨物分子，並攜帶標記物和貨物分子進入到細胞內部。該細胞穿膜肽能夠攜帶標記物和貨物分子高效、低細胞毒性的進入細胞內部，同時具有很強的抗酶解、抗血清降解能力，並且進入細胞後可以從囊泡小體中逃逸。
文檔編號C07K5/11GK101781356SQ20091030966
公開日2010年7月21日 申請日期2009年11月13日 優先權日2009年11月13日
發明者張玉慧, 馬嚴, 駱清銘 申請人:華中科技大學