濁度法測定桿菌肽及其製劑含量的方法

2023-10-04 11:56:14 3

專利名稱：濁度法測定桿菌肽及其製劑含量的方法
技術領域：
本發明涉及一種抗生素含量的測定方法，尤其是一種濁度法測定桿菌肽及 其製劑含量的方法。
技術背景桿菌肽(Bacitracin)的產生菌為枯草芽孢桿菌(Bacilus subtilis)和 苔蘚樣芽孢桿菌(Bacilus Licheniformis)，系含噻唑環的多肽類多組分抗生 素。桿菌肽能抑制細菌細胞壁中主要成分線性肽聚糖鏈的形成，也影響原生質 體、破壞漿膜等，對革蘭氏陽性菌有高度的抗菌活性，細菌很少對本品產生獲 得性耐藥性，與新黴素(Neomycin)、多粘菌素B (Polymyxin B)等聯合局部 應用有協同作用。目前，桿菌肽原料藥及其製劑為《中國藥典》2005年版二部 所收載，其含量測定方法為抗生素微生物檢定法之管碟法，其基本原理是利用 抗生素在攤布特定試驗菌的瓊脂培養基內的擴散作用，形成一定濃度的含抗生 素的球型區，抑制了試驗菌的繁殖而呈現出透明的抑菌圈，將已知效價的標準 溶液和未知效價的供試品溶液在同樣條件下進行培養，比較兩者抑菌圈大小， 在一定的抗生素濃度範圍內，對數濃度與抑菌圈直徑成正比。管碟法要嚴格控制培養時間，防止不適當的培養時間對抑菌圈的清晰度的 影響，由於某些抗生素呈抑菌作用，在抑菌圈邊緣的菌群只是被抑制，當延長 培養時間後，細菌總量增加，使抗生素敏感度下降。抑菌圈邊緣的菌群繼續生 長導致抑菌圈變小和邊緣不整齊，如採用枯草芽孢桿菌作為檢定菌時，培養時 間過長，菌絲向圈內生長，導致邊緣不整齊，但採用藤黃微球菌作為檢定菌時， 在規定的溫度和時間培養後，可再置室溫和繼續培養2 — 3小時，可使抑菌圈清晰，這可能是抑菌圈邊緣菌群繼續生長，並產生色素，使抑菌圈邊緣緻密而顯 清晰。這樣就造成了管碟法在測定抗生素的含量時對時間的掌控要求較高，並 且耗時較長。所以採用管碟法測定抗生素如桿菌肽的含量有以下缺點操作不 易掌控、測定結果誤差較大、測定速度較慢，使其在工業生產中存在很大的應 用局限性。發明內容本發明要解決的技術問題是提供一種濁度法測定桿菌肽及其製劑含量的方 法，以簡單、快速、準確的測定桿菌肽及其製劑含量。為解決上述技術問題，本發明採用下述方法步驟(1)、標準品溶液的製備稱取桿菌肽標準品2.5mg，用O. 1M鹽酸溶液定容至25ml，製成標準品貯備液； 取上述標準品貯備液5ml，用滅菌緩衝液定容至50ml，製成標準品中間溶液； 用滅菌緩衝液將標準品中間溶液稀釋成桿菌肽標準品濃度在 0. lug/ml-0.8ug/ml之間的3 — 5組溶液，製成標準品系列劑量溶液，其中標準 品系列劑量溶液的濃度中含有0. 4ug/ml的溶液，其它溶液濃度分散在0. 4ug/ml 兩邊；(2) 、供試品溶液的製備稱取桿菌肽樣品2. 5mg，用水定容至25ml量瓶 中，製成樣品貯備液；取上述樣品貯備液5ml，用滅菌緩衝液定容至50ml，制 成樣品中間溶液；取樣品中間溶液4.0ml，用滅菌緩衝液定容至100ml，製成供 試品溶液；(3) 、試驗菌懸液的製備取表皮葡萄球菌斜面培養物，在細菌培養基中 培養，稀釋後製成試驗菌懸液；(4) 、含量測定上述標準品系列劑量溶液和供試品溶液組成4一6個濃度 組，取對應組數的試驗管，在各試驗管內均加入試驗菌懸液9.0ml，再分別加入各濃度的標準品或供試品溶液各1.0ml;在37T:培養3h-4h，用比濁法測量 儀在線測定各管在530rnn處的吸光度；取2支試驗管，其中一支加入pH=6. 0 的磷酸鹽緩衝液1. Oml和抗生素微生物檢定用培養基液體9. Oml，作為同條件 培養的溶液的空白；另一支加入PH二6. 0的磷酸鹽緩衝液1. Oml和試驗菌懸液 9.0ml，作為同條件培養的陽性對照；以重複以上操作，作3 — 5組測定；(5)、在抗生素比濁法測量儀上在線測量並計算結果即得桿菌肽及其製劑 的含量。本發明也可採用下述方法步驟(1)、標準品溶液的製備稱取桿菌肽標準品2. 5mg，用0. 1M鹽酸定容至25ml，製成標準品貯備液；量取上述標準品貯備 液5ml，用滅菌緩衝液稀定容至25ml量瓶中，製成標準品中間溶液；用滅菌緩 衝液將標準品中間溶液稀釋成桿菌肽標準品濃度在0. lug/ml-0. 8ug/ml之間的 2組溶液，製成標準品高劑量溶液和標準品低劑量溶液；(2)、稱取桿菌肽樣品2.5mg，用水定容至25ml，製成樣品的貯備液； 量取上述貯備液5ml，定容至25ml，製成樣品中間溶液；用滅菌緩衝液稀釋樣 品中間溶液，製成與上述標準品溶液濃度相同的供試品高劑量溶液和供試品低 劑量溶液；(3) 、試驗菌懸液的製備取表皮葡萄球菌斜面培養物，在細菌培養基中 培養，稀釋後製成試驗菌懸液；(4) 、含量測定上述標準品系列劑量溶液和供試品溶液組成4個濃度組， 取6個試驗管，在各試驗管內均加入試驗菌懸液9.0ml，再分別加入各濃度的 標準品或供試品溶液各l.Oml;在37。C培養3h-4h，用比濁法測量儀在線測定 各管在530nm處的吸光度；取2支試驗管，其中一支加入pH=6. 0的磷酸鹽緩 衝液1. Oml和抗生素微生物檢定用培養基液體9. Oml，作為同條件培養的溶液的空白；另一支加入pH=6. 0的磷酸鹽緩衝液1. 0ml和試驗菌懸液9. Oml，作 為同條件培養的陽性對照；以重複以上操作，作3 — 5組測定；(5)、在抗生素比濁法測量儀上在線測量並計算結果即得桿菌肽及其製劑 的含量。本發明還可採用下述方法步驟標準品溶液的製備稱取桿菌肽標準品2.5mg，用O. 1M鹽酸溶液定容至25ml，製成標準品貯備液；量取上述標準品貯 備液5ml，用滅菌緩衝液定容至50ml，製成標準品中間溶液；用滅菌緩衝液將 標準品中間溶液稀釋成桿菌肽標準品濃度在0. lug/ml-0. 8ug/ml之間的3組溶 液，製成標準品高劑量溶液、標準品中劑量溶液和標準品低劑量溶液；(2) 、稱取桿菌肽樣品2. 5mg，加水定容至25ml，製成樣品貯備液；量取 樣品貯備液5ml，用滅菌緩衝液定容至50ml，製成樣品中間溶液；用滅菌緩衝 液稀釋樣品中間溶液，製成與上述標準品溶液濃度一致的供試品高劑量溶液、 供試品中劑量溶液和供試品低劑量溶液；(3) 、試驗菌懸液的製備取表皮葡萄球菌斜面培養物，在細菌培養基中 培養，稀釋後製成試驗菌懸液；(4) 、含量測定上述標準品系列劑量溶液和供試品溶液組成6個濃度組， 取6個試驗管，在各試驗管內均加入試驗菌懸液9.0ml，再分別加入各濃度的 標準品或供試品溶液各l.Oml;在37。C培養3h-4h，用比濁法測量儀在線測定 各管在530nm處的吸光度；取2支試驗管，其中一支加入pH=6. 0的磷酸鹽緩 衝液1. Oml和抗生素微生物檢定用培養基液體9. Oml，作為同條件培養的溶液 的空白；另一支加入pH=6. 0的磷酸鹽緩衝液1. Oml和試驗菌懸液9. Oml，作 為同條件培養的陽性對照；以重複以上操作，作3 — 5組測定；(5) 、在抗生素比濁法測量儀上在線測量並計算結果即得桿菌肽及其製劑的含量。本發明採用濁度法測定桿菌肽及其製劑的含量，濁度法又稱為比濁法，其 為測量透過懸浮質點介質的光強度來確定懸浮物質濃度的方法，這是一種光散 射測量技術。當光束通過一含有懸浮質點的介質時，由於懸浮質點對光的散射 作用和選擇性的吸收，使透射光的強度減弱。在濁度法中，透光度和懸浮物質濃度的關係類似於朗伯一 比爾定律^1g+=^<:，式中s為濁光度(或濁率)， 表示由於懸浮物的散射作用而引起的光強度衰減；/。和/分別為入射光強度(通過純溶劑)和透射光強度(通過混濁樣品)；6為光程長度；C為懸浮質點的濃度；《為常數，有時又叫濁度係數，其值與粒子的大小、形狀、入射光的波長、懸浮物和介質的折射率有關。本發明的原理是將一定量的抗生素加至接種有試驗微生物的澄清的營養豐 富的液體培養基中，混勻後，在一定的溫度下，短期培養，培養基變渾濁，其 渾濁程度與細菌數的增加、細菌群體質量的增加和細菌群體細胞容積的增加之 間存在直接關係，當一定光束照射培養基時，通過測定其透過率就可知道細菌 生長的情況，其吸光度與抗生素濃度關係符合比爾定律，即在一定的抗生素濃 度範圍內，劑量反應為一直線。因此，在劑量反應響應曲線的直線範圍內，即 可設計用比濁法測定抗生素含量。濁度法分為一劑量法、二劑量法和三劑量法， 本發明分別選用該三種方法測定桿菌肽及其製劑的含量。本發明採用的濁度法採用振搖培養，以增加氧的供應，促進細菌生長，所 以本發明方法要儘量縮短培養時間，避免因靜置培養過程中，細菌慢慢沉降至 底部，產生梯度的微生物生長區，表面為微親氧性，底部為厭氧性。這樣本方 法就大大縮短了培養的時間，從而加快了測定的速度。本測定方法簡單、準確、 快速，可廣泛的應用與工業生產和實驗室內。本發明的抗生素微生物檢定法-多劑量濁度法是利用抗生素在液體培養基 中對試驗菌生長的抑制作用，通過測定培養後細菌濁度值的大小，比較標準品 與供試品對試驗菌生長抑制的程度，以測定供試品效價的一種方法。採用管碟 法測定含量時，受擴散係數、培養基粘稠度、抑菌圈大小等諸多因素影響，因 此測定誤差較大；而桿菌肽系含噻唑環的多肽類多組分抗生素，組成分較複雜， 各組分在固體培養基中擴散係數不同，抑菌圈極易產生次級圈，從而影響測定， 使結果準確度大大下降。採用濁度法測定，是在液體培養基中進行，可避免上述因素的影響；用固 定波長測定菌液的吸光度，其精密度優於管碟法中對抑菌圈的測定。本發明方 法的培養方式採用振搖培養，以增加氧的供應，促進細菌生長，所以本發明方 法要儘量縮短培養時間，避免因靜置培養過程中，細菌慢慢沉降至底部，產生 梯度的微生物生長區，表面為微親氧性，底部為厭氧性。本發明測定過程3h 4h，加上其他操作，可在當天獲得結果；而採用管碟法需第二天才能獲得結果。 因此本發明測定方法更為快速、準確，當遇到爭議樣品時，採用濁度法作為仲 裁方法。採用一劑量法及二劑量法可以大量快速測定產品，適用於生產企業中間體 的快速檢測，對於產品的投料、產品的合成等有指導意義；也可作為醫院、海 關等部門的快速檢測使用。採用三劑量法測定產品，是產品含量的準確度的最 佳及最高檢測方法，可作為仲裁方法。採用本發明方法測定，其結果能真實反映出供試品的體外抗菌活性。有關 生產企業可根據測定結果優選出最佳的合成生產工藝，因此，抗生素微生物檢 定法-多劑量濁度法對有關生產企業指導生產，進一步改進生產工藝，提高藥品 質量具有不可替代的指導作用。採用抗生素微生物檢定法-多劑量濁度法測定桿菌肽及其製劑的含量不但試驗方法準確、有效、成本低廉，而且試驗結果能真 實反映出桿菌肽及其製劑的抗菌活性，該方法在該藥品及其製劑的生產和質量 控制中具有較強的實用性和操作性。下面對本發明作進一步詳細的說明。
具體實施方式
實驗材料檢定菌採用美國標準菌庫公開出售的表皮葡萄球菌(Staph. Epidermidis) ATCC12228，菌液濃度為6. 0%—8. 0%;培養基採用《中國藥典》 2005年版二部規定的由中國藥品生物製品檢定所公開出售的III號pH二7.0 — 7.2的抗生素檢定用培養基，滅菌緩衝液為pH=6.0的磷酸鹽緩衝液，其配製 方法為取磷酸氫二鉀2g與磷酸二氫鉀8g，加水使成1000ml，濾過，在115 。C滅菌30分鐘，備用；試驗過程(1)標準品溶液的製備l (一劑量法)精密稱取桿菌肽標準品2. 5mg，置 25ml量瓶中，加O. 1M鹽酸溶液溶解並稀釋至刻度，搖勻，製成每lml含桿菌 肽100ug的溶液的貯備液；精密量取上述貯備液5ml，置50ml量瓶中，用滅菌 緩衝液稀釋至刻度，製成每lml含桿菌肽lOiig的溶液的中間溶液。分別取此溶 液1.0ml、 2. Oml、 4. Oml、 6.0ml和8.0ml，置100ml容量瓶中加滅菌緩衝液稀釋至刻度作為標準品系列劑量溶液；製成桿菌肽標準品濃度為0.1ug/ml、 0.2ug/ml、 0.4ug/ml、 0.6ug/ml、 0. 8ug/ml共5組標準品系列劑量溶液。最好 將桿菌肽標準品濃度製成為O. 256ug/ml、 0. 32ug/ml、 0. 40ug/ml、 0. 50ug/ml、 0. 625ug/ml共5組標準品系列劑量溶液，以獲取更佳的檢測結果。標準品溶液的製備2 (二劑量法)精密稱取桿菌肽標準品2. 5mg,置25ml 量瓶中，加0. 1M鹽酸溶液溶解並稀釋至刻度，搖勻，製成每lml含桿菌肽lOOug的溶液的貯備液；精密量取上述貯備液5ml，置25ml量瓶中，用滅菌緩衝液稀 釋至刻度，製成每lml含桿菌肽20ug的溶液的中間溶液。分別取此溶液2. Ornl， 置100ml容量瓶中加滅菌緩衝液稀釋至刻度作為標準品高劑量溶液；置200ml 容量瓶中加滅菌緩衝液稀釋至刻度作為標準品低劑量溶液；製成桿菌肽標準品 濃度為0. 40ug/ml標準品高劑量溶液和0. 20ug/ml的標準品低劑量溶液。標準品溶液的製備3 (三劑量法)精密稱取桿菌肽標準品2. 5mg，置25ml 量瓶中，加0. 1M鹽酸溶液溶解並稀釋至刻度，搖勻，製成每lml含桿菌肽100ug 的溶液的貯備液；精密量取上述貯備液5ml，置50ml量瓶中，用滅菌緩衝液稀 釋至刻度，製成每lml含桿菌肽10ug的溶液的中間溶液。分別取此溶液3. 6ml、 3.0ml、 2.4ml，分置100ml容量瓶中加滅菌緩衝液稀釋至刻度分別作為標準品 高劑量溶液、中劑量溶液、低劑量溶液；製成桿菌肽標準品濃度分別為 0.24ug/ml、 0.30ug/ml、 0. 36ug/ml的標準品低劑量溶液、標準品中劑量溶液 和標準品高劑量溶液(2)供試品溶液的製備1 (一劑量法)精密稱取桿菌肽樣品2. 5mg，置25ml 量瓶中，加水溶解並稀釋至刻度，搖勻，製成每lml含桿菌肽100ug的溶液的 貯備液；精密量取上述貯備液5ml，置50ml量瓶中，用滅菌緩衝液稀釋至刻度， 製成每lml含桿菌肽10ug的溶液的中間溶液。分別取此溶液4.0ml，置100ml 容量瓶中加滅菌緩衝液稀釋至刻度作為供試品溶液；供試品溶液的製備2 (二劑量法)精密稱取桿菌肽樣品2. 5mg，置25ml 量瓶中，加水溶解並稀釋至刻度，搖勻，製成每lml含桿菌肽10Gug的溶液的 貯備液；精密量取上述貯備液5ml，置25ml量瓶中，用滅菌緩衝液稀釋至刻度， 製成每lml含桿菌肽10ug的溶液的中間溶液。分別取此溶液2.0ml，置100ml 容量瓶中加滅菌緩衝液稀釋至刻度作為供試品高劑量溶液；置200ml容量瓶中加滅菌緩衝液稀釋至刻度作為供試品低劑量溶液；供試品溶液的製備3 (三劑量法)精密稱取桿菌肽樣品2. 5mg，置25ml量 瓶中，加水溶解並稀釋至刻度，搖勻，製成每lml含桿菌肽100ug的溶液的貯 備液；精密量取上述貯備液5ml，置50ml量瓶中，用滅菌緩衝液稀釋至刻度， 製成每lml含桿菌肽10ug的溶液的中間溶液。分別取此溶液3. 6ml、 3. Oml、 2. 4ml，分置100ml容量瓶中加滅菌緩衝液稀釋至刻度分別作為標準品高劑量溶 液、中劑量溶液、低劑量溶液；(3) 試驗菌懸液的製備取試驗菌表皮葡萄球菌斜面培養物，接種於營 養瓊脂培養基中，置35 — 37"C培養16 — 18小時後，用無菌0.9%氯化鈉溶液洗 下菌苔，並加無菌O. 9%氯化鈉溶液稀釋，使得其在580nm波長處的吸光度為1. 0。(4) 操作方法 一劑量法6個濃度組，二劑量法4個濃度組，三劑量法6 個濃度組，每一濃度組作3 — 5組測定，最好作5組測定，以減少誤差。在每組 測定中，在各試驗管內精密加入各含表皮葡萄球菌(580nmA^.0， 6. 0%—8. 0%) 的試驗菌懸液9. 0ml，再分別精密加入各濃度的標準品或供試品溶液各1. 0ml。 在37t:培養3—4小時，用比濁法測量儀在線測定，在530nm處測定各管的吸 光度。同時另取2支試驗管各加入pH6. 0的磷酸鹽緩衝液1. Oml後， 一支加入 培養基液9. Oml，作為同條件培養的溶液的空白；另一支加入試驗菌懸液9. Oml，作為同條件培養的陽性對照。(5 )在抗生素比濁法測量儀上在線測量並計算結果即得桿菌肽及其製劑的
權利要求
1. 一種濁度法測定桿菌肽及其製劑含量的方法，其特徵在於該方法步驟為(1)、標準品溶液的製備稱取桿菌肽標準品2.5mg，用0.1M鹽酸溶液定容至25ml，製成標準品貯備液；取上述標準品貯備液5ml，用滅菌緩衝液定容至50ml，製成標準品中間溶液；用滅菌緩衝液將標準品中間溶液稀釋成桿菌肽標準品濃度在0.1ug/ml-0.8ug/ml之間的3-5組溶液，製成標準品系列劑量溶液，其中標準品系列劑量溶液的濃度中含有0.4ug/ml的溶液，其它溶液濃度分散在0.4ug/ml兩邊；(2)、供試品溶液的製備稱取桿菌肽樣品2.5mg，用水定容至25ml量瓶中，製成樣品貯備液；取上述樣品貯備液5ml，用滅菌緩衝液定容至50ml，製成樣品中間溶液；取樣品中間溶液4.0ml，用滅菌緩衝液定容至l00ml，製成供試品溶液；(3)、試驗菌懸液的製備取表皮葡萄球菌斜面培養物，在細菌培養基中培養，稀釋後製成試驗菌懸液；(4)、含量測定上述標準品系列劑量溶液和供試品溶液組成4-6個濃度組，取對應組數的試驗管，在各試驗管內均加入試驗菌懸液9.0ml，再分別加入各濃度的標準品或供試品溶液各1.0ml；在37℃培養3h-4h，用比濁法測量儀在線測定各管在530nm處的吸光度；取2支試驗管，其中一支加入pH＝6.0的磷酸鹽緩衝液1.0ml和抗生素微生物檢定用培養基液體9.0ml，作為同條件培養的溶液的空白；另一支加入pH＝6.0的磷酸鹽緩衝液1.0ml和試驗菌懸液9.0ml，作為同條件培養的陽性對照；以重複以上操作，作3-5組測定；(5)、在抗生素比濁法測量儀上在線測量並計算結果即得桿菌肽及其製劑的含量。
2、 根據權利要求1所述的濁度法測定桿菌肽及其製劑含量的方法，其特徵 在於試驗菌懸液用下述方法製備取試驗菌表皮葡萄球菌斜面培養物，接種於營養瓊脂培養基中，置35'C-37。C培養16h-18h後，用無菌0. 9%氯化鈉溶液洗 下菌苔，並加無菌O. 9Q/。氯化鈉溶液稀釋，使得其在580nm波長處的吸光度為1. 0。
3、 根據權利要求1或2所述的濁度法測定桿菌肽及其製劑含量的方法，其 特徵用滅菌緩衝液將標準品中間溶液稀釋成桿菌肽標準品濃度為0. lug/ml、 0.2ug/ml、 0.4ug/ml、 0.6ug/ml、 0. 8ug/ml共5組標準品系列劑量溶液。
4、 根據權利要求1或2所述的濁度法測定桿菌肽及其製劑含量的方法，其 特徵用滅菌緩衝液將標準品中間溶液稀釋成桿菌肽標準品濃度為0. 256ug/ml、 0. 32ug/ml、 0.40ug/ml、 0. 50ug/ml、 0. 625ug/ml共5組標準品系列劑量溶液。
5、 一種濁度法測定桿菌肽及其製劑含量的方法，其特徵在於該方法步驟為 (1)、標準品溶液的製備稱取桿菌肽標準品2.5mg，用O. 1M鹽酸定容至25ml，製成標準品貯備液；量取上述標準品貯備液5ml，用滅菌緩衝液稀定容 至25ml量瓶中，製成標準品中間溶液；用滅菌緩衝液將標準品中間溶液稀釋成 桿菌肽標準品濃度在0. lug/ml-0. 8ug/ml之間的2組溶液，製成標準品高劑量 溶液和標準品低劑量溶液；(2)、供試品溶液的製備稱取桿菌肽樣品2.5mg，用水定容至25ml， 製成樣品的貯備液；量取上述貯備液5ml，定容至25ml，製成樣品中間溶液； 用滅菌緩衝液稀釋樣品中間溶液，製成與上述標準品溶液濃度一致的供試品高 劑量溶液和供試品低劑量溶液； (3) 、試驗菌懸液的製備取表皮葡萄球菌斜面培養物，在細菌培養基中 培養，稀釋後製成試驗菌懸液；(4) 、含量測定上述標準品系列劑量溶液和供試品溶液組成4個濃度組，取6個試驗管，在各試驗管內均加入試驗菌懸液9.0ml，再分別加入各濃度的 標準品或供試品溶液各l.Oml;在37"C培養3h-4h，用比濁法測量儀在線測定 各管在530nm處的吸光度；取2支試驗管，其中一支加入pH=6. 0的磷酸鹽緩 衝液1. Oml和抗生素微生物檢定用培養基液體9. Oml，作為同條件培養的溶液 的空白；另一支加入pH=6. 0的磷酸鹽緩衝液1. Oml和試驗菌懸液9. Oml，作 為同條件培養的陽性對照；以重複以上操作，作3 — 5組測定；(5)、在抗生素比濁法測量儀上在線測量並計算結果即得桿菌肽及其製劑 的含量。
6、 根據權利要求5所述的濁度法測定桿菌肽及其製劑含量的方法，其特徵 在於試驗菌懸液用下述方法製備取試驗菌表皮葡萄球菌斜面培養物，接種於 營養瓊脂培養基中，置35。C-37。C培養16h-18h後，用無菌0. 9%氯化鈉溶液洗 下菌苔，並加無菌O. 996氯化鈉溶液稀釋，使得其在580mn波長處的吸光度為1.0。
7、 根據權利要求5或6所述的濁度法測定桿菌肽及其製劑含量的方法，其 特徵在於在標準品溶液的製備過程中，用滅菌緩衝液將標準品中間溶液稀釋成 桿菌肽標準品濃度為0. 40 ug/ml標準品高劑量溶液和0. 2ug/ml的標準品低劑 量溶液；供試品溶液高、低劑量溶液的濃度與標準品高低劑量溶液的濃度相同。
8、 一種濁度法測定桿菌肽及其製劑含量的方法，其特徵在於該方法步驟為 (1)、標準品溶液的製備稱取桿菌肽標準品2. 5mg,用O. 1M鹽酸溶液定容至25ml，製成標準品貯備液；量取上述標準品貯備液5ml，用滅菌緩衝液定 容至50ml，製成標準品中間溶液；用滅菌緩衝液將標準品中間溶液稀釋成桿菌 肽標準品濃度在0. lug/ml-0. 8ug/ml之間的3組溶液，製成標準品高劑量溶液、 標準品中劑量溶液和標準品低劑量溶液；(2)、供試品溶液的製備稱取桿菌肽樣品2. 5mg，加水定容至25ml，製成樣品貯備液；量取樣品貯備液5ml，用滅菌緩衝液定容至50ml，製成樣品中 間溶液；用滅菌緩衝液稀釋樣品中間溶液，製成與上述標準品溶液濃度相同的 供試品高劑量溶液、供試品中劑量溶液和供試品低劑量溶液；(3) 、試驗菌懸液的製備取表皮葡萄球菌斜面培養物，在細菌培養基中 培養，稀釋後製成試驗菌懸液；(4) 、含量測定上述標準品系列劑量溶液和供試品溶液組成6個濃度組， 取6個試驗管，在各試驗管內均加入試驗菌懸液9. Oml，再分別加入各濃度的 標準品或供試品溶液各l.Oml;在37'C培養3h-4h，用比濁法測貴儀在線測定 各管在530nm處的吸光度；取2支試驗管，其中一支加入pH=6. 0的磷酸鹽緩 衝液1. Oml和抗生素微生物檢定用培養基液體9. Oml，作為同條件培養的溶液 的空白；另一支加入pH=6. 0的磷酸鹽緩衝液1. Oml和試驗菌懸液9. Oml，作 為同條件培養的陽性對照；以重複以上操作，作3 — 5組測定；(5) 、在抗生素比濁法測量儀上在線測量並計算結果即得桿菌肽及其製劑 的含量。
9、 根據權利要求8所述的濁度法測定桿菌肽及其製劑含量的方法，其特徵 在於試驗菌懸液用下述方法製備取試驗菌表皮葡萄球菌斜面培養物，接種於 營養瓊脂培養基中，置35"C-37X:培養16h-18h後，用無菌0. 9%氯化鈉溶液洗 下菌苔，並加無菌O. 9y。氯化鈉溶液稀釋，使得其在580nm波長處的吸光度為1. 0。
10、 根據權利要求8或9所述的濁度法測定桿菌肽及其製劑含量的方法， 其特徵在於在標準品溶液的製備過程中，用滅菌緩衝液將標準品中間溶液稀釋 成桿菌肽標準品濃度分別為0.24ug/ml、 0.30ug/ml、 0. 36ug/ml的標準品低劑 量溶液、標準品中劑量溶液和標準品高劑量溶液；供試品高劑量溶液、供試品 中劑量溶液和供試品低劑量溶液的濃度分別與標準品高劑量溶液、標準品中劑匱溶液和標準品劑量低溶液的濃度相同。
全文摘要
本發明公開了一種濁度法測定桿菌肽及其製劑含量的方法，該方法含有標準品溶液的製備、供試品溶液的製備、試驗菌懸液的製備、含量測定等步驟。採用本發明的抗生素微生物檢定法-多劑量濁度法測定桿菌肽及其製劑的含量不但試驗方法準確、有效、成本低廉，而且試驗結果能真實反映出桿菌肽及其製劑的抗菌活性，該方法在該藥品及其製劑的生產和質量控制中具有較強的實用性和操作性。
文檔編號G01N33/68GK101271117SQ200810054939
公開日2008年9月24日 申請日期2008年5月9日 優先權日2008年5月9日
發明者姜建國, 張西如, 王茉莉, 彬 韓, 高燕霞 申請人:高燕霞