提高生物反應調節蛋白功效的方法和典型變異蛋白的製作方法

2023-10-04 06:05:29 1

專利名稱：提高生物反應調節蛋白功效的方法和典型變異蛋白的製作方法
技術領域：
本發明研製出一種蛋白質變體，其結合區的苯丙氨酸殘基被纈氨酸所取代，在該區域與受體、配體或底物結合能夠發揮生物反應修飾功能。更準確地說，本發明研製出一種蛋白質變體，其位於α螺旋區人細胞因子與相應受體結合區的苯丙氨酸殘基被纈氨酸所替代。
背景技術：
人類許多疾病由蛋白質缺陷或不足引起的功能缺失造成。要治療這種疾病只須給病人直接服用相應蛋白質。然而，許多有生理活性的蛋白質藥用後常常還沒到達發揮作用的靶點在血清裡就會被降解。因此對於多數有生理活性和治療價值的蛋白質，患者常常過量、過於頻繁服用以維持能夠發揮滿意治療效果的適當的濃度水平。要解決上述問題可以結合聚乙烯乙二醇(聚乙二醇化)或者將有生理活性的蛋白質裝入微膠囊。然而這些方法過於繁瑣，因為靶蛋白最初由微生物產生，已經經過提純。此外，計劃之外的位點可能會發生交聯進而影響最終產品的同質性。另一種解決途徑是糖基化，即對細胞表面蛋白和真核細胞分泌蛋白進行糖基化修飾。它可以影響活體蛋白質穩定性、功能和生理屬性。但是因為糖基化蛋白質依賴於具有此功能的真核細胞而且生產過程複雜，難以製造出在所有目標位點都完成糖基化的同質終
女口
廣 PFt ο此外，傳統方法雖然可以降低服藥頻率，但是不能提高蛋白質的生理功效，這樣會導致過量服藥。例如，安進公司開發的NESP (參見U. S. Pat. No. 6，586，398)通過延長蛋白質血內半排出期來降低服藥頻率，但是無法增強生理功效而導致過量服用，還可能誘導阻斷抗體生成。通過誘導野生型蛋白質胺基酸殘基發生突變能夠改善其生物活性。以下特許刊物刊登了相關蛋白質變體(1)美國，專利號5，457，089，人紅細胞生成素(EPO)變體通過改變羧基末端能夠增強與受體結合力。(2)國際專利，出版物號02/077034，人粒細胞集落刺激因子(G-CSF)變體，改變T細胞抗原表位降低對人粒細胞集落刺激因子的免疫原性。(3) 國際專利，出版物99/57147，人血小板生成素(TPO)變體，在位點115用賴氨酸、精氨酸或酪氨酸取代穀氨酸，其餘從7號到151號位點構成同成熟人血小板生成素。(4)美國，專利號6，136，563和6，022，711，人生長激素變體在18、22、25、26、29、65、168和174位發生丙氨酸取代。然而上述蛋白質變體側重改善治療效果而沒有關注體內抗原性的改變。因此不同規模、程度、位點的改變可能引起不同程度的免疫反應。抗原性可能引起嚴重的副反應。 (Casadevall et al. N. Eng. J. Med. 2002, vol. 346, p. 469).

發明內容
本發明通過增強生物反應修飾蛋白功效、改良製備蛋白變體工藝，提供一種新型生物反應修飾蛋白變體，它的藥理活性有所增強，能夠最大限度發揮原有功效並能有效防止阻斷抗體形成。一方面，本發明研製出一種蛋白質變體，其結合區的苯丙氨酸殘基被纈氨酸所替代，在該區域與受體、配體或底物結合能夠發揮生物反應修飾功能。另一方面，本發明研製出一種編碼蛋白變體的DNA，該蛋白變體結合區的苯丙氨酸殘基被纈氨酸所替代，在該區域與受體、配體或底物結合能夠發揮生物反應修飾功能。進一步說，本發明研製出一種與編碼蛋白變體DNA相結合的重組載體，其結合區的苯丙氨酸殘基被纈氨酸所替代，在該區域與受體、配體或底物結合能夠發揮生物反應修飾功能。再進一步，本發明研製出一種被DNA編碼蛋白質變體重組載體所轉化或轉染的宿主細胞，其結合區的苯丙氨酸殘基被纈氨酸所替代，在該區域與受體、配體或底物結合能夠發揮生物反應修飾功能。更加深入，本發明研製出一種製備蛋白質變體的方法，包括怎樣培養被DNA編碼蛋白質變體重組載體所轉化或轉染的宿主細胞，其結合區的苯丙氨酸殘基被纈氨酸所替代，在該區域與受體、配體或底物結合能夠發揮生物反應修飾功能，也包括如何從培養基殘渣中分離蛋白質變體。更加準確地說，本發明研製出一種藥理成分和一種藥理學可接受載體，其中包括蛋白質變體，其結合區的苯基丙氨酸殘基被纈氨酸所替代，在該區域與受體、配體或底物結合能夠發揮生物反應修飾功能。


通過以下詳細介紹和附帶圖紙你可以清楚了解上述和其他目標、該發明特色和其他優點。圖IA顯示了位於4-螺旋細胞活素受體結合區域的多胺基酸序列。圖IB顯示了位於幹擾素受體結合區域的多胺基酸序列。圖2A顯示了利用本技術取得的血小板生成素(TPO)變體的免疫印記成像。(從最左邊依次為標記、野生型 TP0、TP0-[F46V]、TP0-[F128V]、TP0-[F131V]和 TP0_[F141V])圖2B顯示了利用本技術取得的紅細胞生成素變體(EPO)的免疫印記成像。(從最左邊依次為標記、野生型 EPO、EPO- [F48V]、EPO- [F138V]、EPO- [F142V]和 EPO- [F148V])圖2C顯示了利用本技術取得粒細胞集落刺激因子(G-CSF)變體的免疫印記成像。 (從最左邊依次為標記、野生型 G-CSF、G-CSF-[F 13V]、G-CSF-[F83V]、G-CSF-[F113V]、 G-CSF- [F140V]、G-CSF- [F144V]和 G-CSF- [F160V])圖3A顯示了同野生型TPO相比，利用本技術取得的TPO變體的相對表達水平。圖3B顯示了同野生型EPO相比，利用本技術取得的EPO變體的相對表達水平。圖3C顯示了同野生型G-CSF相比，利用本技術取得的G-CSF變體的相對表達水平。圖4A通過ELISA化驗顯示了利用本技術取得的TPO變體與受體結合的親和力。圖4B通過ELISA化驗顯示了利用本技術取得的EPO變體與受體結合的親和力。圖4C通過ELISA化驗顯示了利用本技術取得的G-CSF變體與受體結合的親和力。
圖4D通過ELISA化驗顯示了利用本技術取得的GH變體與受體結合的親和力。圖5A顯示了通過SI3R化驗利用本技術取得的TPO變體與受體結合的親和力。圖5B顯示了通過SI3R化驗利用本技術取得的EPO變體與受體結合的親和力。圖6A顯示了通過FACS分析，利用本技術取得的TPO變體與受體結合的親和力。圖6B顯示了通過FACS分析，利用本技術取得的EPO變體與受體結合的親和力。圖7A顯示了通過分析利用本技術取得的TPO變體濃度測得的TF-1/c-Mpl細胞增殖率。圖7B顯示了通過分析利用本技術取得的EPO變體濃度測得的TF-I細胞增值率。圖7C顯示了通過分析利用本技術取得的G-CSF變體濃度測得的HL60細胞增值率。圖7D顯示了通過分析利用本技術取得的GH變體濃度測得的Nb2細胞增值率。圖8A顯示了利用本技術取得的TPO變體的藥物動力學測試，在實驗中，給兔子靜脈注射TPO變體，並測量其血清水平。圖8B顯示了利用本技術取得的EPO變體的藥物動力學測試，在實驗中，給兔子靜脈注射EPO變體，並測量其血清水平。圖8C顯示了利用本技術取得的EPO變體的藥物動力學測試，在實驗中，給小鼠腹膜注射EPO變體，並測量其血清水平。圖9A、9B、9C分別顯示了紅血球增值率、網狀細胞增殖率和血細胞比容變化，反應體內利用本技術取得的EPO變體活性。在實驗中給小鼠腹膜注射EPO變體。圖10A、10BU0C分別顯示了血小板、白細胞、嗜中性粒細胞增殖率變化，反應活體利用本技術取得的TPO變體活性。在實驗中，給小鼠腹膜注射TPO變體。
具體實施例方式依照國際生化聯盟關於胺基酸縮寫的規定，現用單個大寫字母代表相應胺基酸。A 丙氨酸；B 天冬醯胺酸或天冬氨酸C 胱氨酸；D 天冬氨酸；E 穀氨酸F 苯丙氨酸；G :甘氨酸；H :組胺酸I 異亮氨酸；K 賴氨酸L 亮氨酸M 蛋氨酸；N:天冬醯胺酸；P:脯氨酸Q 谷甘氨酸R 精氨酸S 絲氨酸T :蘇氨酸；V :纈氨酸；W :色氨酸Y 酪氨酸Z 穀氨醯胺或穀氨酸以下這種命名法「(代表某種胺基酸的大寫字母)(胺基酸位點)(代表另一種胺基酸的大寫字母)」表示前一個胺基酸在指定位點被後一個所取代。例如，F48V表明位於某蛋白48位的苯丙氨酸被纈氨酸所取代。胺基酸位點從成熟野生型蛋白質N端算起。本文中提及的「蛋白質變體」是指胺基酸序列異於野生型的蛋白質，比如某種同受體、配體或底物結合具有生理活性的蛋白質的苯丙氨酸殘基被纈氨酸所取代，尤其當這種替代發生在結構域時。方便起見本項發明提及的蛋白質變體命名為「蛋白質名稱_[(代表某種胺基酸的大寫字母)(胺基酸位點)(代表另一種胺基酸的大寫字母)]」例如，TP0-[F131V]指代一種野生型131位點原苯丙氨酸殘基被纈氨酸所取代生成的TPO變體。「生物反應修飾蛋白」指的是通過誘導、中止、調節發生於多細胞個體中多種多樣的生物反應，來維持軀體穩態的一類蛋白，它們通常通過與受體、配體或底物結合來發揮功效。本項發明能夠改變全部通過結合受體、配體或底物具有固有調節生物反應功能的蛋白質。非限制性蛋白質包括細胞活素及其受體、粘附分子、腫瘤壞死因子(TNF)受體、 酶、受體酪氨酸激酶、化學活素受體、其他細胞表面蛋白和可溶性配體。非限制性細胞活素包括CNTF(細胞神經滋養因子)、GH(生長激素)、IL-1，IL-IRa(白介素-1受體拮抗劑)、 胎盤催乳激素(PL)、心磷脂、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-10、IL-12、1L-17、TNF、 TGF (轉化生長因子)、IFN (幹擾素)、GM-CSF (粒細胞-單核細胞集落刺激因子)、G-CSF (粒細胞集落刺激因子)、EPO (促紅細胞生成素)、TPO (血小板生成素)、M-CSF (單核細胞集落刺激因子)、LIF(白血病抑制因子)、0SM(制瘤素-M)、SCF(幹細胞因子)、HGF(肝細胞生長因子)、FGF (纖維原細胞生長因子)、IGF (胰島素樣生長因子)和LPT (瘦素)。非限制性細胞活素受體包括生長激素受體(GHR)、IL-13R、IL-1R、IL-2R、IL-3R、 IL-4R、L-5R、IL-6R、L-7R、IL-9R、IL-15R、TNFR、TGFR、IFNR(例如，IFN- y Ra 鏈、IFN- y R)、 interferon- a R、- β R 禾口 - γ R、GM-CSFR、G-CSFR、EPOR、cMpl、gpl30 禾口 Fas (Apo 1)。化學活素受體包括CCRl和CXCR1-4。受體酪氨酸激酶包括TrkA、TrkB, TrkC, Hrk、REK7、Rse/ Tyro-3、肝細胞生長因子受體、血小板衍生生長因子受體和Flt-I。其他細胞表面蛋白包括CD2、CD4、CD5、CD6、CD22、CD27、CD28、CD30、CD31、CD40、 CD44、CD100、CD137、CD150、LAG-3、B7、B61、β -neurexin、CTLA-4、I COS, ICAM-U 補體 R-2(⑶21)、IgER、溶酶體膜gp-1、α 2_微球蛋白受體相關蛋白、促尿鈉排洩肽受體。本發明研製出能結合相比野生型有較強疏水性的受體、配體或底物的蛋白質變體，以提高上述多種蛋白質的生物反應調節功能，本發明的特色是在每種蛋白的結構域用纈氨酸取代苯丙氨酸殘基。苯丙氨酸基本上屬於非極性胺基酸，有一個芳香支鏈，疏水指數達到3. 0。纈氨酸屬於非極性胺基酸，有一個脂肪支鏈，疏水指數達到4. 0。此外，當體積較小的纈氨酸取代苯丙氨酸後，蛋白質可以在鑲嵌模式下更緊密地與相應受體、配體或底物結合，增加疏水性、 親和力，進而提高生物反應調節功效。此外因為用纈氨酸替代苯丙氨酸屬於保守替代，對蛋白質的二級和三級結構影響降到最低，這樣很少影響蛋白質功能的發揮(Argos,EMB0 J. 1989，vol. 8，pp779_85)。還因為苯丙氨酸主要位於強疏水區域，難以暴露出來，當它被纈氨酸所取代時，纈氨酸的強疏水性會使蛋白質遠離表面。因此這種替代誘導抗體產生的惡可能性較小。某種蛋白應當首先同相應受體、配體或底物結合再調節某種生物反應。結合越緊密，調節生物反應功效越強， 本項發明可以改造所有相關蛋白質，生產所有蛋白變體。人自身免疫病NK細胞表達的Fc γ RIIIa(⑶16)發生突變可以證明苯丙氨酸為纈氨酸所取代後蛋白質親和力增強。人受體蛋白具有基因多形性，即人群分為兩組位於識別抗體配體的Fc段的176位點，一組人是苯丙氨酸，另一組是纈氨酸。受體176位點是苯丙氨酸的個體與抗體配體Fc段結合時親和力較低，對系統性紅斑狼瘡易感性很高。(JianmingWu et al. J. Clin. Invest. 1997，vol. 100，pp. 1059—70)另一方面，如上所述，本發明特別之處在於位於有生物反應修飾作用蛋白結構域的苯丙氨酸殘基為纈氨酸所取代。這裡所說的「結構域」是指通過與受體、配體或底物結合能夠發揮生物功能蛋白質的一部分(或某區域)，相對該蛋白上其他區域，該區域有強疏水性和抵抗原性，該術語在技術領域家喻戶曉。例如，用來指代本發明的某些4-α螺旋束細胞活素和幹擾素分別具有D-α螺旋結構和Α-α螺旋結構，這些結構就是與相應受體結合的結構域。然而根據本發明更改的結構域不局限於技術領域為人熟知的結構域。因為生物反應調節蛋白與受體、配體或底物的結合同時受到與之直接結合和其它幾個胺基酸殘基的影響。根據本發明更改的生物反應調節蛋白結構域還包括技術領域為人熟知的結構域中從兩端算起的約50個胺基酸殘基，或者更適宜說約25個甚至約10個胺基酸殘基。本發明包括通常含有幾個α螺旋結構的細胞活素，其中位於N段的第一和最後位螺旋被稱作與相應受體結合的結構域(見圖1)。技術領域普遍接受細胞活素與相應受體結合的α螺旋因細胞活素種類而異。例如，IL-2第二和第五個螺旋與IL-2受體中的 ρ55α受體結合，第一個螺旋與IL-2受體中的ρ75 γ受體結合，第六個螺旋與γ受體結合。 (Fernando Bazan, Science J. 1992，vol. 257，pp. 410-2).如上所述，細胞活素不同的螺旋結構參與與不同受體的結合，但是螺旋結構胺基酸序列很相近。本發明研製出一種細胞活素變體，它位於結構域中的α螺旋的苯丙氨酸殘基為纈氨酸所取代，與野生型相比具有更高的受體親和力。細胞活素包括4-螺旋束細胞活素家族，例如CNTF、ΕΡ0、Flt3L、GM-CSF, IL-2, IL-3、L-4、IL-5、L_6、IL_12p35、LPT、LIF、M-CSF, OSM、PL、SCF, TPO, G-CSF, GHR 和 IFN。它們都具有四個α螺旋結構，分別命名為A-α螺旋、B-α螺旋、C_a螺旋和D_ α螺旋。與受體結合的主要是 A-α 螺旋禾口 D-α 螺旋。(Fernando Bazan, Immunology today, 1990, vol.11 pp. 350-4，The Cytokine Facts Book, 1994，pp.104—247)上述4-螺旋束細胞活素家族中，CNTF、EPO, Flt3L、GM-CSF, IL-2, IL-3, I L-4, IL-5、IL-6、L-12p35、LPT、LIF、M-CSF, OSM、PL、SCF, TPO, G-CSF 和 GHR 都包括一個 D- α 螺旋和C-α螺旋與D-α螺旋的聯合區。結合區包括4-螺旋束細胞活素家族中位於110和 180位點間的胺基酸殘基。綜上，本發明研製出一種4-螺旋束細胞活素變體，該家族中位於 110和180位點間苯丙氨酸殘基為纈氨酸所取代，與野生型相比具有更高的受體親和力。上述4-螺旋束細胞活素家族中，幹擾素(例如IFN-a2A、IFN-a 2B, IFN- β , IFN-Y、IFN-ω、IFN-τ)結合區中包含一個Α_α螺旋。具體說來，幹擾素的結合區包括處於位點1到50間的胺基酸殘基。因此，本發明研製出一種幹擾素變體，它位於1和50位點間的苯丙氨酸殘基為纈氨酸所取代，與野生型相比具有更高的受體親和力。另一方面，根據本技術修飾的結合區可能包括兩個或以上苯丙氨酸殘基，它們可能都會被纈氨酸所取代。然而因為這樣會導致蛋白表達水平下降，最好只有一個苯丙氨酸被取代。關於這一點，本發明發現當位於高疏水區域的苯丙氨酸殘基被纈氨酸所取代後，生物反應調節蛋白功效會明顯改善。因此，本發明選擇用位於高疏水區域的苯丙氨酸殘基來被纈氨酸所取代。某一胺基酸序列某特殊區域的疏水性可以確定(Kyte，J.et al.J.Mol. Biol. 1982, vol. 157, pp. 105-132, Hopp, Τ. P. et al. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1981,vol. 78(6)，pp. 3824-3828)。可以根據技術領域廣為人知的化學合成方法利用本發明來製造生物反應調節蛋白變體(Creighton，Proteins-Structures and Molecular Principles, W. H. Freeman and Co. , NY 1983)。這裡舉出幾種常用方法，但不限於此，比如液相、固相合成法、片段濃縮法、F-M0C、T-B0C 化學合成法(Chemical Approaches to theSynthesis of Peptides and Proteins，Williams et al.，Eds.，CRC Press，BocaRaton Florida，1997 ；A Practical Approach，Atherton & Sheppard，Eds.，IRLPress, Oxford,England，1989)。本發明改造的生物反應調節蛋白變體也可採用DNA重組技術製備。該技術包括準備編碼本發明改造的蛋白變體的DNA序列，可以通過改變編碼野生型蛋白的DNA序列來獲得。簡言之，合成編碼野生型蛋白的DNA序列之後，通過點突變使含有苯丙氨酸的密碼子變成含有纈氨酸的密碼子，以此合成目標DNA序列。同時，製備編碼本發明改造蛋白變體的DNA序列也可通過化學方法，例如利用寡核苷酸合成器。基於目標蛋白變體的胺基酸序列，或者不如說選擇產生此種蛋白變體宿主細胞採用的適宜密碼子來合成寡核苷酸。技術領域普遍認同遺傳密碼存在簡併性，即有些胺基酸有幾個密碼子為之編碼。本發明涵蓋眾多簡併性編碼蛋白變體的DNA序列。編碼本發明改造蛋白變體的DNA序列可能包括也可能不包括編碼信號序列的DNA 序列。如果存在的話，信號序列應該能夠被表達蛋白變體的宿主細胞識別。信號序列可能來自原核或真核細胞，或者同時來自這兩種細胞，或者屬於固有蛋白的信號序列。通過檢測以重組細胞分泌物形式表達的蛋白變體水平可以評價信號序列水平。如果宿主細胞是原核細胞，DNA序列通常不編碼信號序列而是更傾向於N端含有蛋氨酸來直接表達目標蛋白。一般採用從野生型蛋白衍生的信號序列。把用上述方法製備的DNA序列與其它編碼本發明改造蛋白的DNA序列結合在一起，插入包含調節結果DNA序列表達的一個或多個表達調控序列的載體。這樣宿主細胞就轉化或轉染有結果重組表達載體。轉化株和轉染株在適宜DNA序列表達的條件下進行培養。從培養基中取得編碼DNA序列的高純度生物反應調節蛋白變體。「載體」是指能穩定地將外源性基因攜帶入宿主細胞的DNA分子。為了方便應用， 載體應該能夠複製、能夠將自身引入宿主細胞並且具有可供選擇的標記物。此外，「重組表達載體」是指能將外源性基因帶入宿主細胞的環狀DNA分子。重組表達質體在被引入宿主細胞後，無論宿主染色體DNA是不是在大量複製都能夠自身複製產生異種DNA。技術領域普遍接受為了提高宿主內傳染基因表達水平，該基因應該同宿主表達系統中轉錄、翻譯調節序列合理連接起來。如果表達調控序列和外源性基因能被裝入帶有細菌選擇標記和複製起點的單表達載體，效果會更好。如果選用真核細胞作表達系統，表達載體應該包含適用於真核宿主細胞的表達標記物。與重組表達載體連用的「表達調控序列」是指對於該發明改造的蛋白變體必要或有益的核苷序列。調控序列可能與編碼蛋白變體的核苷序列同源或異源。非限制性表達調控序列包括前導序列、多腺苷酸序列、末端肽、啟動子、增強子或上遊活化序列、信號肽序列和轉錄終止子。表達調控序列至少包含一個啟動子序列。「適宜結合」是指不同核苷序列的結合狀態能夠保障應有功能的正常發揮。核苷序列可能是基因或調控序列，當適宜分子(例如，轉錄活化蛋白)結合到調控序列時，就可以誘導基因表達。舉例來說，如果前序列或分泌前導能夠協助成熟蛋白分泌，就稱之為「與蛋白結合適宜」。當啟動子調節編碼序列轉錄時，它與編碼序列結合適宜。如果核糖體結合位點允許編碼序列翻譯正常進行，就說它與編碼序列結合適宜。通常「適宜結合」指核苷序列彼此相連。就分泌型前導序列而言，它的適宜結合是指與編碼序列相連，且位於該序列的領頭區段。然而增強子不一定要和編碼序列相連。核苷序列連接可以在方便的限制酶識別位點完成。沒有限制酶識別位點時，可應用傳統方法合成的寡核苷酸結合體。為了表達編碼本發明改造蛋白變體DNA序列，有多種宿主細胞和載體重組體可供選擇。可用於轉化真核宿主細胞的載體包含諸如SV40、牛乳頭瘤病毒、腺病毒、腺相關病毒、 細胞巨化病毒、逆轉錄病毒等表達調控序列。細菌宿主載體包含從大腸桿菌中提取的質體 (例如 pET、pRSET、pBluescript、pGEX2T、pUC、pBR322 和 pMB9)及其衍生物，來自多種宿主細胞的質體，如RP4、抗菌素DNA，多種λ抗菌素衍生物如λ gtlO、λ gtll和NM989，其它抗菌素DNA如絲狀單鏈DNA抗菌素(例M13)。適用於酵母細胞的表達載體含2 μ質體及其衍生物。適用於昆蟲細胞的表達載體含PVL 941。為了表達編碼本發明改造蛋白變體DNA序列，這些載體有多種表達調控序列可供選擇。這些有用的表達調控序列包括那些與上述載體的結構基因相關的那些序列。有用的表達調控序列包括SV40或腺病毒、乳糖系統、trp系統、TAC或TRC系統的早期和晚期啟動子，T3和T7啟動子、噬菌體λ操縱子和啟動子的主要區域、fd蛋白衣調控區、3-磷酸甘油酯激酶和其它糖酵解酶的啟動子、磷脂酶啟動子，例如Pho5、酵母α雜交體統啟動子、調控原核或/和真核細胞及其病毒基因表達的其他序列。特別地，Τ7 RNA聚合酶啟動子Φ10有助於大腸桿菌多肽的表達。經上述重組載體轉化或轉染的宿主細胞還包含本發明的另外一方面成果。有多種單核宿主細胞可以用來表達編碼本發明改造蛋白變體的DNA序列。這樣的宿主細胞包括諸如大腸桿菌、假單細胞菌、桿菌、鏈黴菌、真菌、酵母等原核或真核細胞，諸如Sp0d0ptFrugiperda(Sf9)這樣的昆蟲細胞，諸如中國倉鼠卵巢細胞 (CHO)或小鼠細胞等動物細胞，非洲綠猴細胞例如C0S1、C0S7、BSC1、BSC40或BMT10，人組織培養細胞和植物細胞。常常選用大腸桿菌、枯草芽孢桿菌等細菌和哺乳動物的組織培養細胞作宿主細胞。可以根據基礎實驗入門裡描述的方法對宿主細胞進行轉化或轉染(Davis et al. , Basic Methods in Molecular Biology, 1986 ；Sambrook,J. ,et al. ,Basic Methodsin Molecular Biology, 1989)。一般採用鈣磷酸鹽轉染法、DEAE右旋糖苷介導轉染法、轉位法、 顯微注射、陽離子脂介導轉染法、電穿孔法、轉導變異、刮載法、彈道介導和感染法將編碼本發明改造蛋白變體的DNA序列載入宿主細胞。在表達編碼本發明改造蛋白變體的DNA序列時，所有載體和表達調控序列發揮的功能不盡相同。同樣，在同樣的表達系統裡所有宿主細胞發揮的功能也不盡相同。然而，技術熟練的人不需做很多實驗就能選出本發明所要求的適宜的載體、表達調控序列和宿主。 例如，選擇載體時應該也把宿主考慮在內，因為載體需要能夠在宿主內部複製。應該仔細斟酌載體的複製量、控制複製量的能力、該載體編碼的其他蛋白的表達 (比如抗體標記物)。同時選擇表達調控序列時也應該考慮多方面的因素，比如相對強度、 調控能力、與本發明中DNA序列的兼容性，尤其要注意與二級結構相關的因素。選擇宿主時應該考慮與載體的兼容性、核苷序列編碼產物的毒性、產物的分泌屬性、正確摺疊多肽鏈的能力、發酵條件、組織培養條件、核苷序列編碼產物是否容易提純等等。製備本發明改造蛋白變體的過程中，把宿主細胞放在適宜多肽生存成的營養環境中培養，如搖暖培養，小或大規模實驗室或工業發酵桶發酵(要求培養基條件適宜多肽表達和/或分離)。要求培養基按照規範程序配製，含有適量碳、氮和無機鹽。培養基可以從供貨商那裡購得也可依據公布的配比自行配製(如American TypeCulture Collection目錄)。如果多肽分泌入培養基，它應該能再直接復原；如果沒有分泌入培養基，它應該能從細胞溶解產物中復原。本發明改造的生物反應調節蛋白變體能通過以下傳統方法復原，但不限於這幾種方法，如離心、過濾、提取、噴霧烘乾、蒸發或沉澱法。蛋白變體能通過以下傳統方法提純， 但不限於這幾種方法，如色譜法(離子交換、親和力、疏水性、大小篩選)、電泳、差別溶解度(銨硫酸鹽沉澱)、SDS-PAGE或提取法。本發明研製出生產生物反應調節蛋白變體的藥物配比和藥劑學上可接受的載體。 本發明研製出的藥物配比是治療有效劑量。本發明藥物配比中的載體包括製藥領域常用的載體、佐劑、賦形劑，這些統稱為藥劑學可接受載體。本發明藥物配比中的非限制性藥劑學可接受載體包括離子交換劑、氧化鋁、硬脂酸鋁、卵磷脂、血清蛋白(如人血清白蛋白)、緩衝劑(如磷酸鈉、氨基乙酸、山梨酸、山梨酸鉀、植物飽和脂肪酸的偏甘油酯混合物)、水、鹽、電解質(如硫酸精蛋白、磷酸氫二鈉、磷酸氫鉀、氯化鈉、鋅鹽)、矽膠、三矽酸鎂、聚乙烯吡咯烷酮、纖維素底物、聚乙烯乙二醇、羥甲基纖維素鈉鹽、多芳基化合物、蠟、聚乙烯_聚氧丙烯_阻斷共聚物、聚乙烯乙二醇和羊毛脂。服用本發明的藥物配比可以隨意採用常用方式，只要採用該方式能夠達到目標組織即可，如局部用藥、口服、非腸道使用、眼內使用、經皮、直腸內使用，可製成溶液、懸浮液、 藥片、藥丸、膠囊或緩釋形式。非腸道使用包括皮下、鼻內、靜脈內、腹膜內、機內、關節內、滑膜內、幹內、心內、鞘內、病灶內和顱內注射或灌輸技術。本發明的藥物配比可以製備成水溶液採用非腸道服用。如果合理地選用Hank溶液、注射溶液或生理鹽等緩衝溶液，效果會更好。注射水懸濁液可以同時補充能夠提高粘性的物資，如羧甲基纖維素鈉鹽、山梨醇、右旋糖苷。此外，有效成分懸濁液如注射油性懸濁液，包括親脂性溶劑或載體，如芝麻油等脂肪酸和油酸乙酯、甘油三酯、脂質體等合成脂肪酸酯。聚陽離子非脂氨基聚合物也可作為載體。懸浮液可以適當添加穩定劑或藥物來增加蛋白變體溶解度，同時獲得高濃度蛋白變體溶液。本發明的藥物配比若經過消毒處理，採用注射方式會更好，如製成水性或油性懸濁液進行注射。懸濁液可採用適宜分散或潤溼物質(如Tween 80)和懸浮物質。也可以製成消毒供注射溶液或無毒非腸道注射可接受稀釋液或溶劑，如1，3-丁二醇溶液。可接受載體和溶劑包括甘露醇、水、注射溶液和等滲氯化鈉溶液。此外，習慣上採用消毒的非揮發性油作溶劑或懸濁液溶液。這樣可以採用刺激性小的非揮發性油，如合成的單或雙甘油酯。另外，油酸、甘油酯衍生物等脂肪酸可以同製藥可接受的天然油脂(如橄欖油和蓖麻油)一樣用來製備注射用藥，尤其是聚氧乙基衍生物。上述水性配比主要通過濾去細菌、摻入消毒劑或聯合應用輻射進行消毒。經過消毒成分會變硬，如通過冰凍烘乾來獲得變硬的產品，實際應用中，再把它溶於消過毒的水或稀釋液中。與本發明藥物配比相關的「治療有效劑量」是指應用本發明藥物成分時治療疾病時有效成分的劑量達到改善的或治療的效果。本發明藥物配比的治療有效劑量因病人的年齡、性別、應用部位、服藥頻率、服藥持續時間，藥品形式是仿製還是佐劑而異。通常， 與野生型蛋白產品相比，服藥本發明藥物劑量應酌減，如0.01-1000 μ g/kg/天，更適宜
0.1-500 μ g/kg/ 天，最好 1-100 μ g/kg/day。另一方面，技術領域資深人士接受本發明配比類型不同的蛋白適用於治療不同類型的疾病。作為本發明代表的EPO和TPO可以用來治療單獨的或作為其它疾病併發症(如腸炎、更加嚴重的腎病、腎衰竭引發的貧血、用齊多夫定(AZT)治療HIV感染者並發的貧血、 腫瘤化療引發的貧血、亨廷頓疾病(HD)、鐮刀型紅細胞貧血、子宮交換輸血後新生兒次再生性貧血聯合Rh溶血性疾病)的貧血。此外，本發明改造的G-CSF可以用來治療原發性和骨髓移植、腫瘤化療誘導的嗜中性白血球減少症。GH變體可以用來治療侏儒症、兒科慢性腎功能衰竭。然而，本發明的應用範疇遠不止於此。以下，本發明研製出4-螺旋束細胞活素纈氨酸取代苯丙氨酸殘基生成的幹擾素變體，詳細地說，包括 CNTF、EPO、Flt3L、G-CSF, GM-CSF, GH、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、L-6、 IL-12p35、LPT、LIF、M-CSF、0SM、PL、SCF、TP0、IFN-a 2A、IFN-a 2B、IFN-3 , IFN- γ , IFN-ω 禾口 IFN- τ 0另一方面，本發明提供以下蛋白變體⑴野生型CNTF胺基酸序列(SEQ ID NO. 1)的3、83、98、105、119、152或178位點上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成CNTF變體。(2) 野生型EPO胺基酸序列(SEQ ID NO. 2)的48、138、142或148位點上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成EPO變體。(3)野生型Flt3L胺基酸序列(SEQID NO. 3)的6、15、81、87、96或 124位點上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成Flt3L變體。(4)野生型G-CSF胺基酸序列(SEQ ID NO. 4)的13、83、113、140、144或160位點上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成G-CSF變體。(5)野生型GM-CSF胺基酸序列(SEQ ID NO. 5)的47、103、106、113或119位點上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成GM-CSF變體。(6)野生型GH胺基酸序列(SEQ ID N0. 6)的
1、10、25、31、44、54、92、97、139、146、166、176或191位點上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成 GH 變體。(7)野生型 IFN-a 2A 胺基酸序列(SEQ ID N0. 7)的 27、36、38、43、47、64、67、 84、123或151位點上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成IFN- a 2A變體。(8)野生型IFN_a2B 胺基酸序列(SEQ ID N0. 8)的27、36、38、43、47、64、67、84、123或151位點上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成IFN-a2B變體。(9)野生型IFN-β胺基酸序列(SEQ ID Ν0. 9)的8、 38、50、67、70、111或154位點上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成IFN-β變體。(10)野生型 IFN-Y 胺基酸序列(SEQ ID N0. 10)的 18、32、55、57、60、63、84、85、95 或 139 位點上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成IFN-γ變體。(11)野生型IFN-ω胺基酸序列(SEQ ID N0. 11) 的27、36、38、65、68、124或153位點上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成IFN-ω變體。(12) 野生型 IFN-τ 胺基酸序列(SEQ ID Ν0. 12)的 8、39、68、71、88、127、156、157、159 或 183 位點上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成IFN-τ變體。(13)野生型IL-2胺基酸序列(SEQ ID Ν0. 13)的42、44、78、103、117或124位點上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成IL-2變體。 (14)野生型IL-3胺基酸序列(SEQ ID N0. 14)的37、61、107、113或133位點上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成IL-3變體。(1 野生型IL-4胺基酸序列(SEQ ID NO. 15)的33、 45、55、73、82或112位點上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成IL-4變體。(16)野生型IL-5 胺基酸序列(SEQ ID NO. 16)的49、69、96或103位點上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成 IL-5 變體。(17)野生型 IL-6 胺基酸序列(SEQ ID NO. :17)的 73、77、93、104、124、169 或 172位點上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成IL-6變體。(18)野生型IL-12p35胺基酸序列 (SEQ ID NO. 18)的13、39、82、96、116、132、150、166或180位點上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成IL-12p35變體。(19)野生型LPT胺基酸序列(SEQ ID NO. :19)的41或92位點上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成LPT變體。O0)野生型LIF胺基酸序列(SEQ ID N0. 20)的41、52、67、70、156或180位點上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成1^正變體。Ql)野生型 M-CSF 胺基酸序列(SEQ ID NO. :21)的 35、37、54、67、91、106、121、135、143、229、255、 311、439、466或485位點上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成M-CSF變體。Q2)野生型OSM 胺基酸序列(SEQ ID N0. 22)的56、70、160、169、176或184位點上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成OSM變體。(23)野生型PL胺基酸序列(SEQ ID NO. :23)的10、31、44、52、54、92、 97、146、166、176或191位點上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成PL變體。Q4)野生型SCF 胺基酸序列(SEQ ID N0. 24)的 63、102、110、115、116、119、126、129、158、199、205、207 或 245位點上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成SCF變體。0 野生型TPO胺基酸序列(SEQ ID N0. 25)的46、1觀、131、141、186、204、240或286位點上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成TPO變體。 另一方面，本發明提供以下DNA分子(1)野生型CNTF胺基酸序列(SEQ ID N0. 1)的3、83、98、105、119、152或178位點上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成CNTF變體，編碼此變體的DNA。(2)野生型EPO胺基酸序列(SEQ ID N0. 2)的48、138、142或148位點上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成EPO變體，編碼此變體的DNA。( 野生型Flt3L胺基酸序列(SEQ ID N0. 3)的6、15、81、87、96或IM位點上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成Flt3L 變體，編碼此變體的DNA。(4)野生型G-CSF胺基酸序列(SEQ ID N0. 4)的13、83、113、 140、144或160位點上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成G-CSF變體，編碼此變體的DNA。(5) 野生型GM-CSF胺基酸序列(SEQ ID N0. 5)的47、103、106、113或119位點上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成GM-CSF變體，編碼此變體的DNA。(6)野生型GH胺基酸序列(SEQ ID N0. 6)的 1、10、25、31、44、54、92、97、139、146、166、176 或 191 位點上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成GH變體，編碼此變體的DNA。(7)野生型IFN-α 2A胺基酸序列(SEQ ID Ν0. 7) 的27、36、38、43、47、64、67、84、123或151位點上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成正^0 2八變體，編碼此變體的DNA。(8)野生型IFN-a2B胺基酸序列(SEQ ID N0. 8)的27、36、38、 43、47、64、67、84、123或151位點上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成IFN_a2B變體，編碼此變體的DNA。(9)野生型IFN-β胺基酸序列(SEQ ID Ν0. 9)的8、38、50、67、70、111或巧4位點上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成IFN-β變體，編碼此變體的DNA。(10)野生型 IFN-Y 胺基酸序列(SEQ ID NO. :10)的 18、32、55、57、60、63、84、85、95 或 139 位點上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成IFN-Y變體，編碼此變體的DNA。(11)野生型IFN-ω胺基酸序列(SEQ ID N0. 11)的27、36、38、65、68、1M或153位點上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成IFN-ω變體，編碼此變體的DNA。(12)野生型IFN-τ胺基酸序列(SEQ ID NO. :12) 的8、39、68、71、88、127、156、157、159或183位點上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成IFN- τ變體，編碼此變體的DNA。(13)野生型IL-2胺基酸序列(SEQ ID NO. :13)的42、44，、78、 103、117或IM位點上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成IL-2變體，編碼此變體的DNA。(14) 野生型IL-3胺基酸序列(SEQ ID NO. :14)的37、61、107、113或133位點上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成IL-3變體，編碼此變體的DNA。(1 野生型IL-4胺基酸序列(SEQ ID NO. 15)的33、45、55、73、82或112位點上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成IL-4變體，編碼此變體的DNA。(16)野生型IL-5胺基酸序列(SEQID NO. :16)的49、69、96或103位點上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成IL-5變體，編碼此變體的DNA。(17)野生型IL-6胺基酸序列(SEQ ID NO. 17)的73、77、93、104、1M、169或172位點上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成IL-6變體，編碼此變體的DNA。(18)野生型IL-12p35胺基酸序列(SEQ ID NO. :18) 的13、39、82、96、116、132、150、166或180位點上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成IL_12p35 變體，編碼此變體的DNA。(19)野生型LPT胺基酸序列(SEQ ID NO. :19)的41或92位點上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成LPT變體，編碼此變體的DNA。O0)野生型LIF胺基酸序列(SEQ ID N0. 20)的41、52、67、70、156或180位點上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成 LIF變體，編碼此變體的DNA。Ql)野生型M-CSF胺基酸序列(SEQ ID NO. :21)的35、37、 54、67、91、106、121、135、143、229、255、311、439、466 或 485 位點上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成M-CSF變體，編碼此變體的DNA。02)野生型OSM胺基酸序列(SEQ ID NO. :22) 的56、70、160、169、176或184位點上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成OSM變體，編碼此變體的 DNA。(23)野生型 PL 胺基酸序列(SEQ ID NO. :23)的 10、31、44、52、54、92、97、146、 166、176或191位點上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成PL變體，編碼此變體的DNA。Q4) 野生型 SCF 胺基酸序列(SEQ ID NO. :24)的 63、102、110、115、116、119、126、129、158、199、 205,207或245位點上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成SCF變體，編碼此變體的DNA。Q5) 野生型 TPO 胺基酸序列(SEQ ID NO. :25)的 46、128、131、141、186、204、240 或 286 位點上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成TPO變體，編碼此變體的DNA。 本發明提供以下重組表達載體(1)野生型CNTF胺基酸序列(SEQ ID N0. 1)的 3、83、98、105、119、152或178位點上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成CNTF變體，裝有編碼此變體DNA的適宜載體。(2)野生型EPO胺基酸序列(SEQ ID N0. 2)的48、138、142或 148位點上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成EPO變體，裝有編碼此變體DNA適宜載體。(3) 野生型Flt3L胺基酸序列(SEQ ID N0. 3)的6、15、81、87、96或IM位點上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成Flt3L變體，裝有編碼此變體DNA適宜載體。(4)野生型G-CSF胺基酸序列(SEQ ID N0. 4)的13、83、113、140、144或160位點上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成 G-CSF變體，裝有編碼此變體DNA適宜載體。(5)野生型GM-CSF胺基酸序列(SEQ ID N0. 5)的47、103、106、113或119位點上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成GM-CSF變體，裝有編碼此變體DNA適宜載體。(6)野生型GH胺基酸序列(SEQ ID N0. 6)的1、10、25、31、44、54、 92、97、139、146、166、176或191位點上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成GH變體，裝有編碼此變體DNA適宜載體。(7)野生型IFN-α 2A胺基酸序列(SEQ ID Ν0. 7)的27、36、38、43、 47、64、67、84、123或151位點上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成IFN-α 2A變體，裝有編碼此變體DNA適宜載體。(8)野生型IFN-a2B胺基酸序列(SEQ ID N0. 8)的27、36、38、43、 47、64、67、84、123或151位點上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成IFN_a2B變體，裝有編碼此變體DNA的適宜載體。(9)野生型IFN-β胺基酸序列(SEQ ID Ν0. 9)的8、38、50、67、70、111或巧4位點上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成IFN-β變體，裝有編碼此變體DNA的適宜載體。(10)野生型 IFN-γ 胺基酸序列(SEQ ID NO. :10)的 18、32、55、57、60、63、84、85、 95或139位點上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成IFN-γ變體，裝有編碼此變體DNA適宜載體。(11)野生型 IFN-ω 胺基酸序列(SEQ ID NO. :11)的 27、36、38、65、68、1 或 153 位點上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成IFN-ω變體，裝有編碼此變體DNA的適宜載體。(12)野生型 IFN-τ 胺基酸序列(SEQ ID NO. :12)的 8、39、68、71、88、127、156、157、159 或 183 位點上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成IFN-τ變體，裝有編碼此變體DNA的適宜載體。(13) 野生型IL-2胺基酸序列(SEQ ID NO. :13)的42、44、78、103、117或1 位點上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成IL-2變體，裝有編碼此變體DNA的適宜載體。(14)野生型IL-3胺基酸序列(SEQ ID NO. 14)的37、61、107、113或133位點上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成 IL-3變體，裝有編碼此變體DNA的適宜載體。(15)野生型IL-4胺基酸序列(SEQ ID N0. 15)的33、45、55、73、82或112位點上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成IL-4變體，裝有編碼此變體DNA的適宜載體。(16)野生型IL-5胺基酸序列(SEQ ID NO. :16)的49、69、96或 103位點上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成IL-5變體，裝有編碼此變體DNA的適宜載體。 (17)野生型 IL-6 胺基酸序列(SEQ ID NO. :17)的 73、77、93、104、124、169 或 172 位點上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成IL-6變體，裝有編碼此變體DNA的適宜載體。(18)野生型 IL-12p;35 胺基酸序列(SEQ ID NO. :18)的 13、39、82、96、116、132、150、166 或 180 位點上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成IL_12p35變體，裝有編碼此變體DNA的適宜載體。(19) 野生型LPT胺基酸序列(SEQ ID NO. :19)的41或92位點上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成LPT變體，裝有編碼此變體DNA的適宜載體。00)野生型LIF胺基酸序列(SEQ ID N0. 20)的41、52、67、70、156或180位點上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成LIF變體，裝有編碼此變體DNA的適宜載體。Ql)野生型M-CSF胺基酸序列(SEQ ID NO. :21)的35、37、54、 67、91、106、121、135、143、229、255、311、439、466或485位點上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成M-CSF變體，裝有編碼此變體DNA的適宜載體。02)野生型OSM胺基酸序列(SEQ ID N0. 22)的56、70、160、169、176或184位點上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成OSM變體， 裝有編碼此變體DNA的適宜載體。03)野生型PL胺基酸序列(SEQ ID NO. :23)的10、31、 44、52、討、92、97、146、166、176或191位點上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成PL變體，裝有編碼此變體DNA的適宜載體。04)野生型SCF胺基酸序列(SEQ ID NO. :24)的63、102、 110、115、116、119、126、129、158、199、205、207或245位點上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成SCF變體，裝有編碼此變體DNA的適宜載體。05)野生型TPO胺基酸序列(SEQ ID N0. 25)的46、1觀、131、141、186、204、240或286位點上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成TPO變體，裝有編碼此變體DNA的適宜載體。 進一步說，本發明提供以下宿主細胞(1)被編碼CNTF變體DNA的適宜載體轉染的宿主細胞，CNTF變體由野生型CNTF胺基酸序列(SEQ ID N0. 1)的3、83、98、105、119、 152或178位點上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成。( 被編碼EPO變體DNA的適宜載體轉染的宿主細胞，EPO變體由野生型EPO胺基酸序列(SEQ ID N0. 2)的48、138、142或148 位點上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成。( 被編碼Flt3L變體DNA的適宜載體轉染的宿主細胞，Flt3L變體由野生型Flt3L胺基酸序列(SEQ IDN0. 3)的6、15、81、87、96或IM 位點上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成。(4)被編碼G-CSF變體DNA的適宜載體轉染的宿主細胞，G-CSF變體由野生型G-CSF胺基酸序列(SEQ ID NO. 4)的13、83、113、140、144或 160位點上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成。( 被編碼GM-CSF變體DNA的適宜載體轉染的宿主細胞，GM-CSF變體由野生型GM-CSF胺基酸序列(SEQ ID NO. 5)的47、103、106、113 或119位點上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成。(6)被編碼GH變體的DNA的適宜載體轉染的宿主細胞，GH變體由野生型GH胺基酸序列(SEQ ID NO. 6)的1、10、25、31、44、54、92、 97、139、146、166、176或191位點上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成GH變體。(7)被編碼 IFN- α 2Α變體的DNA的適宜載體轉染的宿主細胞，IFN- α 2Α變體由野生型IFN- α 2Α胺基酸序列(SEQ ID NO. 7)的27、36、38、43、47、64、67、84、123或151位點上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成。(8)被編碼IFN-a2B變體的DNA的適宜載體轉染的宿主細胞，IFN-a2B變體由野生型 IFN-a2B 胺基酸序列(SEQ ID NO. :8)的 27、36、38、43、47、64、67、84、123 或 151 位點上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成。(9)被編碼IFN-β變體的DNA的適宜載體轉染的宿主細胞，IFN-β變體由野生型IFN-β胺基酸序列(SEQ ID Ν0. 9)的8、38、50、67、70、 111或巧4位點上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成。(10)被編碼IFN-Y變體的DNA的適宜載體轉染的宿主細胞，IFN-γ變體由野生型IFN-γ胺基酸序列(SEQ IDN0. 10)的18、32、 55、57、60、63、84、85、95或139位點上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成。(11)被編碼IFN-ω 變體胺基酸序列的DNA的適宜載體轉染的宿主細胞，IFN-ω變體由野生型IFN-ω胺基酸序列(SEQ ID N0. 11)的27、36、38、65、68、1M或153位點上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成。(12)被編碼IFN-τ變體胺基酸序列的DNA的適宜載體轉染的宿主細胞，IFN-τ變體由野生型 IFN-τ 胺基酸序列(SEQ ID NO. :12)的 8、39、68、71、88、127、156、157、159 或 183位點上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成。(1 被編碼IL-2胺基酸序列的DNA的適宜載體轉染的宿主細胞，IL-2變體由野生型IL-2胺基酸序列(SEQ ID NO. :13)的42、44、78、 103、117或IM位點上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成。(14)被編碼IL-3胺基酸序列的 DNA的適宜載體轉染的宿主細胞，IL-3變體由野生型IL-3胺基酸序列(SEQ ID NO. :14)的 37、61、107、113或133位點上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成。(1 被編碼IL-4胺基酸序列的DNA的適宜載體轉染的宿主細胞，IL-4變體由野生型IL-4胺基酸序列(SEQ ID N0. 15)的33、45、55、73、82或112位點上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成。(16)被編碼IL-5 胺基酸序列的DNA的適宜載體轉染的宿主細胞，IL-5變體由野生型IL-5胺基酸序列(SEQ ID N0. 16)的33、45、55、73、82或112位點上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成。(17)被編碼IL-6胺基酸序列的DNA的適宜載體轉染的宿主細胞，IL-6變體由野生型IL-6胺基酸序列(SEQ ID N0. 17)的73、77、93、104、1M、169或172位點上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成。(18)被編碼IL-12p35胺基酸序列的DNA的適宜載體轉染的宿主細胞，IL_12p35變體由野生型 IL-12p35 胺基酸序列(SEQ ID NO. :18)的 13、39、82、96、116、132、150、166 或 180位點上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成。(19)被編碼IL-12p35胺基酸序列的DNA的適宜載體轉染的宿主細胞，IL_12p35變體由野生型IL-12p35胺基酸序列(SEQ ID NO. :19) 的41或92位點上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成。00)被編碼LIF胺基酸序列的DNA的適宜載體轉染的宿主細胞，LIF變體由野生型LIF胺基酸序列(SEQ ID NO. :20)的41、52、 67、70、156或180位點上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成。Ql)被編碼LIF胺基酸序列的 DNA的適宜載體轉染的宿主細胞，LIF變體由野生型LIF胺基酸序列(SEQ ID NO. :21)的 35、37、54、67、91、106、121、135、143、229、255、311、439、466 或 485 位點上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成。02)被編碼OSM胺基酸序列的DNA的適宜載體轉染的宿主細胞，OSM變體由野生型OSM胺基酸序列(SEQ ID NO. :22)的56、70、160、169、176或184位點上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成。被編碼PL胺基酸序列的DNA的適宜載體轉染的宿主細胞，PL 變體由野生型 PL 胺基酸序列(SEQ IDN0. 23)的 10、31、44、52、54、92、97、146、166、 176或191位點上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成。04)被編碼SCF胺基酸序列的DNA的適宜載體轉染的宿主細胞，SCF變體由野生型SCF胺基酸序列(SEQ ID NO. :24)的10、31、 44、52、M、92、97、146、166、176或191位點上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成。0 被編碼SCF胺基酸序列的DNA的適宜載體轉染的宿主細胞，SCF變體由野生型SCF胺基酸序列 (SEQ ID NO. :25)的46、1沘、131、141、186、204、240或286位點上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成。 進一步說，本發明提供以下製備蛋白變體的方法(1)野生型CNTF胺基酸序列 (SEQ ID NO. :1)的3、83、98、105、119、152或178位點上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成 CNTF變體，培養裝有編碼此變體DNA適宜載體宿主細胞的方法和把它從培養基分離出來的方法。⑵野生型EPO胺基酸序列(SEQ ID NO. 2)的48、138、142或148位點上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成EPO變體，培養裝有編碼此變體DNA適宜載體宿主細胞的方法和把它從培養基分離出來的方法。(3)野生型Flt3L胺基酸序列(SEQ ID N0. 3)的6、15、 81、87、96或IM位點上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成Flt3L變體，培養裝有編碼此變體 DNA適宜載體宿主細胞的方法和把它從培養基分離出來的方法。(4)野生型G-CSF胺基酸序列(SEQ ID N0. 4)的13、83、113、140、144或160位點上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成G-CSF變體，培養裝有編碼此變體DNA適宜載體宿主細胞的方法和把它從培養基分離出來的方法。(5)野生型GM-CSF胺基酸序列(SEQ ID N0. 5)的47、103、106、113或119位點上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成GM-CSF變體，培養裝有編碼此變體DNA適宜載體宿主細胞的方法和把它從培養基分離出來的方法。(6)野生型GH胺基酸序列(SEQ ID N0. 6)的1、10、25、31、44、54、92、97、139、146、166、176或191位點上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成GH變體，培養裝有編碼此變體DNA適宜載體宿主細胞的方法和把它從培養基分離出來的方法。(7)野生型 IFN-α 2A 胺基酸序列(SEQ ID Ν0. 7)的 27、36、38、43、47、64、67、 84、123或151位點上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成IFN- α 2Α變體，培養裝有編碼此變體 DNA適宜載體宿主細胞的方法和把它從培養基分離出來的方法。(8)野生型IFN-a2B胺基酸序列(SEQ IDN0. 8)的27、36、38、43、47、64、67、84、123或151位點上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成IFN-a2B變體，培養裝有編碼此變體DNA適宜載體宿主細胞的方法和把它從培養基分離出來的方法。(9)野生型IFN-β胺基酸序列(SEQ ID N0. 9)的8、38、50、67、 70,111或巧4位點上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成IFN-β變體，培養裝有編碼此變體 DNA適宜載體宿主細胞的方法和把它從培養基分離出來的方法。(10)野生型IFN-γ胺基酸序列(SEQ ID N0. 10)的18、32、55、57、60、63、84、85、95或139位點上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成IFN-γ變體，培養裝有編碼此變體DNA適宜載體宿主細胞的方法和把它從培養基分離出來的方法。(11)野生型IFN-ω胺基酸序列(SEQ ID NO. :11)的27、36、38、 65、68、IM或153位點上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成IFN-ω變體，培養裝有編碼此變體DNA適宜載體宿主細胞的方法和把它從培養基分離出來的方法。(12)野生型IFN-τ胺基酸序列(SEQ ID Ν0. 12)的 8、39、68、71、88、127、156、157、159 或 183 位點上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成IFN- τ變體，培養裝有編碼此變體DNA適宜載體宿主細胞的方法和把它從培養基分離出來的方法。(13)野生型IL-2胺基酸序列(SEQ ID NO. :13)的42、 44、78、103、117或IM位點上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成IL-2變體，培養裝有編碼此變體DNA適宜載體宿主細胞的方法和把它從培養基分離出來的方法。(14)野生型IL-3胺基酸序列(SEQ ID NO. 14)的37、61、107、113或133位點上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成IL-3變體，培養裝有編碼此變體DNA適宜載體宿主細胞的方法和把它從培養基分離出來的方法。(15)野生型IL-4胺基酸序列(SEQ ID NO. :15)的33、45、55、73、82或112位點上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成IL-4變體，培養裝有編碼此變體DNA適宜載體宿主細胞的方法和把它從培養基分離出來的方法。(16)野生型IL-5胺基酸序列(SEQ ID NO. :16) 的49、69、96或103位點上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成IL-5變體，培養裝有編碼此變體DNA適宜載體宿主細胞的方法和把它從培養基分離出來的方法。(17)野生型IL-6胺基酸序列(SEQ ID NO. 17)的73、77、93、104、124、169或172位點上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成IL-6變體，培養裝有編碼此變體DNA適宜載體宿主細胞的方法和把它從培養基分離出來的方法。(18)野生型IL-12p35胺基酸序列(SEQ ID NO. :18)的13、39、82、96、116、 132、150、166或180位點上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成IL_12p35變體，培養裝有編碼此變體DNA適宜載體宿主細胞的方法和把它從培養基分離出來的方法。(19)野生型LPT胺基酸序列(SEQ ID N0. 19)的41或92位點上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成LPT變體， 培養裝有編碼此變體DNA適宜載體宿主細胞的方法和把它從培養基分離出來的方法。00) 野生型LIF胺基酸序列(SEQ ID NO. :20)的41、52、67、70、156或180位點上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成LIF變體，培養裝有編碼此變體DNA適宜載體宿主細胞的方法和把它從培養基分離出來的方法。(21)野生型M-CSF胺基酸序列(SEQ ID NO. :21)的35、37、54、 67、91、106、121、135、143、229、255、311、439、466或485位點上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成M-CSF變體，培養裝有編碼此變體DNA適宜載體宿主細胞的方法和把它從培養基分離出來的方法。(22)野生型OSM胺基酸序列(SEQ ID NO. :22)的56、70、160、169、176或184 位點上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成OSM變體，培養裝有編碼此變體DNA適宜載體宿主細胞的方法和把它從培養基分離出來的方法。03)野生型PL胺基酸序列(SEQ ID N0. 23)的10、31、44、52、討、92、97、146、166、176或191位點上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成 PL變體，培養裝有編碼此變體DNA適宜載體宿主細胞的方法和把它從培養基分離出來的方法。(24)野生型 SCF 胺基酸序列(SEQ ID NO. :24)的 63、102、110、115、116、119、126、129、 158、199、205、207或M5位點上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成SCF變體，培養裝有編碼此變體DNA適宜載體宿主細胞的方法和把它從培養基分離出來的方法。0 野生型TPO胺基酸序列(SEQ ID N0. 25)的46、1沘、131、141、186、204、240或286位點上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成TPO變體，培養裝有編碼此變體DNA適宜載體宿主細胞的方法和把它從培養基分離出來的方法。 再進一步說，本發明提供以下藥物配比(1)野生型CNTF胺基酸序列(SEQ IDN0. 1)的3、83、98、105、119、152或178位點上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成CNTF變體，包含此變體的藥物配比和製藥學可接受載體。( 野生型EPO胺基酸序列(SEQ ID N0. 2)的 48、138、142或148位點上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成EPO變體，包含此變體的藥物配比和製藥學可接受載體。⑶野生型Flt3L胺基酸序列(SEQ ID N0. 3)的6、15、81、87、96或IM位點上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成Flt3L變體，包含此變體的藥物配比和製藥學可接受載體。(4)野生型G-CSF胺基酸序列(SEQ ID NO. 4)的13、83、113、140、144 或160位點上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成G-CSF變體，包含此變體的藥物配比和製藥學可接受載體。(5)野生型GM-CSF胺基酸序列(SEQ ID NO. 5)的47、103、106、113或11 位點上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成GM-CSF變體，包含此變體的藥物配比和製藥學可接受載體。(6)野生型 GH 胺基酸序列(SEQ ID NO. 6)的 1、10、25、31、44、54、92、97、139、 146、166、176或191位點上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成GH變體，包含此變體的藥物配比和製藥學可接受載體。(7)野生型IFN-α 2A胺基酸序列(SEQ ID NO. 7)的27、36、38、 43、47、64、67、84、123或151位點上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成IFN-α 2A變體，包含此變體的藥物配比和製藥學可接受載體。(8)野生型IFN-a2B胺基酸序列(SEQ ID NO. 8) 的27、36、38、43、47、64、67、84、123或151位點上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成IFN_a2B 變體，包含此變體的藥物配比和製藥學可接受載體。(9)野生型IFN-β胺基酸序列(SEQ ID N0. 9)的8、38、50、67、70、111或巧4位點上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成IFN-β 變體，包含此變體的藥物配比和製藥學可接受載體。(10)野生型IFN-γ胺基酸序列(SEQ ID Ν0. 10)的18、32、55、57、60、63、84、85、95或139位點上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成IFN-Y變體，包含此變體的藥物配比和製藥學可接受載體。(11)野生型IFN-ω胺基酸序列(SEQ ID N0. 11)的27、36、38、65、68、1M或153位點上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成IFN-ω變體，包含此變體的藥物配比和製藥學可接受載體。(1 野生型IFN- τ胺基酸序列(SEQ IDN0. 12)的 8、39、68、71、88、127、156、157、159 或 183 位點上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成IFN-τ變體，包含此變體的藥物配比和製藥學可接受載體。(1 野生型IL-2胺基酸序列(SEQ ID NO. :13)的42、44，、78、103、117或124位點上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成IL-2變體，包含此變體的藥物配比和製藥學可接受載體。(14)野生型 IL-3胺基酸序列(SEQ ID NO. :14)的37、61、107、113或133位點上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成IL-3變體，包含此變體的藥物配比和製藥學可接受載體。(1 野生型IL-4胺基酸序列(SEQ ID N0. 15)的33、45、55、73、82或112位點上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成IL-4變體，包含此變體的藥物配比和製藥學可接受載體。(16)野生型IL-5胺基酸序列 (SEQ ID NO. :16)的49、69、96或103位點上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成IL-5變體， 包含此變體的藥物配比和製藥學可接受載體。(17)野生型IL-6胺基酸序列(SEQ ID N0. 17)的73、77、93、104、1對、169或172位點上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成IL-6變體， 包含此變體的藥物配比和製藥學可接受載體。(18)野生型IL-12p35胺基酸序列(SEQ ID N0. 18)的13、39、82、96、116、132、150、166或180位點上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成 IL-12p35變體，包含此變體的藥物配比和製藥學可接受載體。(19)野生型LPT胺基酸序列 (SEQ ID NO. :19)的41或92位點上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成LPT變體，包含此變體的藥物配比和製藥學可接受載體。00)野生型LIF胺基酸序列(SEQ ID NO. :20)的41、 52、67、70、156或180位點上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成LIF變體，包含此變體的藥物配比和製藥學可接受載體。(21)野生型M-CSF胺基酸序列(SEQ ID NO. :21)的35、37、54、 67、91、106、121、135、143、229、255、311、439、466或485位點上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成M-CSF變體，包含此變體的藥物配比和製藥學可接受載體。0 野生型OSM胺基酸序列(SEQ ID N0. 22)的56、70、160、169、176或184位點上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成OSM變體，包含此變體的藥物配比和製藥學可接受載體。野生型PL胺基酸序列(SEQ ID NO. 23)的10、31、44、52、M、92、97、146、166、176或191位點上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成PL變體，包含此變體的藥物配比和製藥學可接受載體。04)野生型SCF胺基酸序列(SEQ ID NO. 24)的 63、102、110、115、116、119、126、129、158、199、205、207 或 245 位點上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成SCF變體，包含此變體的藥物配比和製藥學可接受載體。(2 野生型 TPO 胺基酸序歹Ij (SEQ ID NO. :25)的 46、128、131、141、186、204、240 或沘6 位點上苯丙氨酸殘基被纈氨酸取代生成TPO變體，包含此變體的藥物配比和製藥學可接受載體。 現以ΤΡΟ、EPO、G-CSF和GH為例來說明本發明改造蛋白變體如何提高化學反應調節功能。很顯然對於技術領域人士，本發明可以通過這些例子來闡釋，但不僅限於適用於這些例子。編碼 TP0/EP0/G-CSF/GH 野生型 DNA 結構A.編碼TPO野生型DNA結構骨髓組織中添加750 μ 1 TRIzol (MRC.，USA)放入微試管離心機室溫培養5分鐘。 往試管中添加200 μ 1氯仿，振蕩15秒鐘，室溫培養2至3分鐘，4°C下15，000r/m離心15 分鐘。取上清液，轉入1.5ml試管，添加500 μ 1異丙醇。取樣-70°C培養30分鐘，4°C下 15，000r/m離心15分鐘。棄去表面懸浮物，用75% DEPC-乙醇溶液渦流衝洗RNA球狀小體， 4°C下15，000r/m離心15分鐘。棄去表面懸浮物，RNA球狀小體室溫乾燥5分鐘，之後溶於 50 μ 1 DEPC處理過的3°蒸餾水。2μ g mRNA 淨化提純方法如上，混合 1μ 1 寡dT30 引物(10 μ M，Promega，USA) 70°C 加熱2分鐘，立即冰凍降溫2分鐘。之後，反應混合物中加入200U M-MLV逆轉錄酶 (Promega, USA)，10 μ 1 5Χ 反應緩衝劑 Q50mM Tris-HCl, pH 8. 3,375mM KCI，15mM MgCl2, 50nM DTT)，1 μ 1 dNTP(10mM dATP, IOmM dTTP, IOmM dGTP, IOmM dCTP)和DEPC處理過的 3° 水使總量達到50 μ 1。輕輕混合均勻，42 °C培養60分鐘。為了放大cDNA編碼野生型TPO活性，選用第一條cDNA作模板，往含有2UpfuDNA 聚合酶(Stratagene，USA)、10 μ 1 10Χ 反應緩衝液、Triton X-100、lmg/mlBSA、3 μ 1 引 *1(10μΜ)、3μ13|*2(10μΜ)、2μ1 of dNTP(10mM dATP、IOmM dTTP、IOmM dGTP、IOmM dCTP)的PCR試管中添加引物1和引物2(表1)，再加入蒸餾水使總量達到10μ1。PCR反應所需條件如下95°C每次3分鐘，1輪接著95°C每次30秒，52C每次1分鐘，72C每次1. 5 分鐘，30輪，最後72°C每次10分鐘，1輪直至反應徹底結束。將得到的PCR反應產品分離，放入0.8%瓊脂培養基(BMA，USA)，用Qiaex 11凝膠提取法(Qiagen，USA)提純。分離出的DNA與15U EcoRI混合後，加入10U NotI、3y 1 10X 反應緩衝液和3°蒸餾水使總量達到30μ1，37 培養DNA2小時。將PCR反應產品分離，放入0. 8%瓊脂培養基，用Qiaex II凝膠提取法淨化。將5yg pBluescript KS II (+)載體與 15U EcoRIUOU NotI、3yl 10X 反應緩衝液混合，加入3°蒸餾水使總量達到30μ 1，37°C培養DNA2小時。將限制性pBluescript KS II (+)載體分離，放入0. 8%瓊脂培養基，用Qiaex II凝膠提取法淨化。將IOOng消化的pBluescript KS II (+)載體與20ng經同樣酶消化的PCR產品混合。將混合物置於16°C水浴16小時，這樣就製成了含有編碼野生型TPO cDNA的重組載體。接著，把它轉入經過氯化銣處理的ToplO大腸桿菌anvitrogen，USA)。轉化後的細菌置於包含50μ 1/ml氨比西林(Sigma，USA)的LB瓊脂板培養。隔夜培養，將菌簇置於含有 50 μ 1/ml氨比西林的:3ml LB介質，37°C培養16小時。用鹼溶解法從培養細菌中分離出質粒，用EcoRI/NotI限制檢測質粒克隆基因的內容物。B.克隆編碼野生型EPO DNA的方法基本同克隆編碼野生型TPO DNA的方法。取第一條cDNA鏈作模板，取引物11和引物12來放大(見表幻做編碼野生型 EPO DNA在PCR反應中的表現。用EcoRI和BamHI核酸內切酶消化PCR產物、克隆載體和pBluescript KS II (+)。將消化的PCR產物和克隆載體結合轉入活性大的大腸桿菌 ToplO(lnvitrogen, USA)。用鹼溶解法從培養細菌中分離出質粒，用EcoRI/BamHI限制檢測質粒克隆基因的內容物C.克隆DNA編碼野生型G-CSF的方法與克隆DNA編碼野生型TPO的方法類似。選用健康人的白細胞進行mRNA提取，取引物21和引物22來放大(見表幻編碼野生型G-CSF cDNA在PCR反應中的表現。用EcoRI和SmaI核酸內切酶消化PCR產物、克隆載體和pBluescript KS II (+)。將消化的PCR產物和克隆載體結合轉入活性大的大腸桿菌E. coli ToplO (lnvitrogen, USA)。用鹼溶解法從培養細菌中分離出質粒，用Smal/EcoRI 限制檢測質粒克隆基因是否存在。D.編碼野生型GH的DNA結構。編碼野生型GH的DNA購自ATCC (ATCC No. 67097)。 在PCR法中採用引物35和引物36 (見表4)在cDNA的N末端添加先導序列。再次用PCR法中採用引物37和引物38(見表4)保證全部編碼野生型GH的cDNA都能與先導序列結合。 用EcoRI和HindiIII核酸內切酶消化PCR產物、克隆載體和pBluescript KS II (+)。用鹼溶解法從培養細菌中分離出質粒，用EcoRI/Hindilll限制檢測質粒克隆基因是否存在。例2 編碼 TP0/EP0/G-CSF/GH 突變蛋白 cDNA 結構A.編碼TPO突變蛋白cDNA結構在ΤΡ0、TPO-[F46V]、TPO-[FU8V]、TPO-[F131V]和 TP0_[F141V]的各自位點用纈氨酸取代苯丙氨酸可以得到四種突變蛋白。表1構建編碼野生型TPO以及突變蛋白的cDNA所用引物
20
權利要求
1.一種TPO變體，其中，所述TPO是通過纈氨酸取代SEQ ID NO. :25所示的胺基酸序列的第131或141位的苯丙氨酸殘基而被改變。
2.—種DNA，其中，該DNA編碼權利要求1所述的TPO變體。
3.重組表達載體，根據2，DNA可實際與之連接的重組表達載體。
4.根據3，DNA可實際與之連接的重組表達載體，該載體存取號為KCCM-10500、 KCCM-10501 或 KCCM-10571。
5.根據3或4，宿主細胞的重組表達載體被轉移或轉染。
6.根據5，該方法為製備蛋白變體的方法，含培養宿主細胞和從培養基中分離蛋白變體的方法。
7.—種藥物組合物，其中，該藥物組合物含有權利要求1所述的TPO變體以及藥學上可接受載體。
全文摘要
揭示一種蛋白變體，該蛋白變體是位於通過與相應受體、配體或底物結合有生物反應調節功能蛋白結合區的苯丙氨酸被纈氨酸所取代生成的。同時，本發明揭示編碼該蛋白變體的DNA，結合DNA的重組表達載體，轉移或轉染重組表達載體的宿主細胞，製備蛋白變體的方法，含培養宿主細胞和從培養基中分離蛋白變體的方法。進一步說，本發明揭示一種含蛋白變體的藥物配比和藥物學可接受載體。
文檔編號C07K14/52GK102286090SQ20111017635
公開日2011年12月21日 申請日期2004年5月27日 優先權日2003年7月26日
發明者李基完, 李學燮, 許閏華, 鄭用勳, 金哉潤 申請人:魅德秀專有限公司