一種高效生物膠封閉劑及其應用的製作方法

2023-10-04 06:09:44 1

專利名稱：一種高效生物膠封閉劑及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種高效生物膠封閉劑，屬生物醫藥領域；具體的說是涉及一種 能迅速形成高效生物膠薄膜，具有高度止血、粘合和封閉創面作用的生物膠藥物 組合物，是一種生物止血材料。
背景技術：
控制出血(流血)是手術、急救和野外創傷護理的關鍵環節。不幸的是，來自 各種原因的出血(流血)是非常見的，日常生活和工作中的意外受傷出血(流血)、 外科手術中的創傷出血(流血)、來自戰爭的受傷出血(流血)等，如不能控制及時 處理，則將有可能造成巨大損失甚至死亡。實事表明，通過使用簡單的和有效的 出血控制方法，可以實現給手術、急救和野外創傷護理帶來極大的方便。在第二次世界大戰的最後一年血纖蛋白原和凝血酶被廣泛使用。不過後來受 到了禁止，因為它會傳播肝炎。自美國紅十字會以及其他機構開發出了血漿蛋白 純化方法，而且這些方法能消除肝炎的危險以後，單一供體血纖蛋白密封劑被廣 泛地在臨床上使用，不僅用於出血控制，而且用於各種手術場合的手術室輔助物。 上世紀80年代以後國外的主要製造商有奧地利的Baxter-Imrnuno AG (商品名 Tissuccol)、德國的Aventis Behring(商品名Beriplast P)、加拿大的 Haemacure(商品名Hemaseel APR)、 日本的Kaketsuken Pharmaceutical (商品 名Bolheal)、法國的LFB-Lille (商品名Biocol)、美國的VI Technologies (商品名VIGuard F. S.)等。纖維蛋白封閉劑是模擬血凝的最後階段反應由血 漿蛋白成份組成的一種複合製劑，它可以通過凝血酶從纖維蛋白原釋放纖維蛋白 肽形成具有一定強度的纖維蛋白凝塊，應用於臨床可起到封閉創面，止血和傷口 癒合的作用。工業化製造的纖維蛋白封閉劑己在許多外科手術中顯示出特有的價 值，備受外科醫生推崇，迄今還未發現明顯的毒性和不良反應。中國專利CN1246047C公開了含纖維蛋白原、凝血酶和醇的懸浮液及其塗敷 載體的方法，該專利中的纖維蛋白原、凝血酶是採用人或牛的纖維蛋白原、凝血 酶，國外纖維蛋白封閉劑的纖維蛋白也多原來源於人血，凝血酶也大部分從人血 提取，部分採用牛血為原料；採用人血作為纖維蛋白封閉劑製備原料有傳播HBV、 HIV等病毒的潛在危險，而牛血製品有傳播狂牛症和感染其他人畜共患病的可能性，且可引起人凝血因子V缺乏；另外，採用人血為原料易導致產品成本高，價 格昂貴，在發展中國家廣泛應用受到一定的限制。乾燥的血纖蛋白原一凝血酶敷 料，這種敷料目前的配方中使用了牛凝血酶。儘管這種血纖蛋白原一凝血酶敷料 不需要預先混合，並且便於使用，但由於它需要在4'C下保存，並且在應用於傷 口上之前需要用鹽溶液預先溼潤，使它的應用也受到了限制。中國專利CN1214446C公開了一種高凝固性纖維蛋白原膠,其纖維蛋白原為人血纖維蛋白 原、牛血纖維蛋白原或豬血纖維蛋白原，原料中也使用了人血或牛血；而且在制 作工藝中使用了丙酮、乙醚等有機溶劑，不但增加了生產成本，而且在生產中易 帶來安全隱患。發明內容本發明的目的是為了提供一種更加高效、安全、穩定和使用方便的高效生物 膠封閉劑，其以豬血為主原料，既降低了成本，又減少了血源性疾病的傳播機會， 同時所得產品可縮短封閉凝固時間，為臨床病人的搶救爭取更大的機會。本發明的目的是這樣實現的 一種高效生物膠封閉劑，它由主體膠凍乾粉、 催化劑凍乾粉、主體膠溶解液和催化劑溶解液四個組分構成，其特徵在於按重 量百分比計算，主體膠凍乾粉含纖維蛋白原和XIII因子33.3%—71.0%,氯化鈉 2. 0—5. 6%，枸椽酸鈉2. 0—5. 6%，蔗糖20. 2%_27. 8%,組氨酸0. 2%—5. 6%,精氨 酸0. 2% _5. 6%，聚山梨酯0. 2%—2. 8%,白蛋白4. 2 — 14. 0%;催化劑凍乾粉含凝 血酶450 IU/ml — 650 IU/ml，甘氨酸20mg/ml — 80mg/ml，白蛋白5mg/ml — 30mg/ml;主體膠溶解液含醋酸鈉lmg/ml_15mg/ml，氯化鈉lmg/ml — 15mg/ml; 催化劑溶解液含三羥甲基氨基甲垸3mg/ml—20mg/ml，鹽酸3mg/ml—20mg/ml， 氯化鈣5mg/ml — 30mg/ml 。上述的高效生物膠封閉劑，其中，所述的主體膠凍乾粉的製備方法包括如下步驟(1).以豬血液為原料，將豬血液於2。C一10。C低溫庫中靜置，讓其分層，用 虹吸法吸取上層血漿液，下層紅細胞棄去；上層血槳液用3000轉/分鐘一 10000 轉/分鐘的高速冷凍離心機離心30分鐘_60分鐘，收集血漿，用0. 22Mm濾膜過 濾；取濾過血漿，每升加入甘氨酸lg—30g，使其溶解，將血漿降溫至0 4"C， 每升加入醋酸鈉50g—250g，使其溶解，攪拌30分鐘。用3000轉/分鐘一IOOOO 轉/分鐘的高速冷凍離心機離心，收集沉澱。(2) .取步驟(l)收集沉澱攪碎，加入由枸櫞酸鈉與三羥甲基氨基甲烷製成的 pH值6.0 — 10.0的緩衝溶液，攪拌至完全溶解，過濾，測蛋白含量和溶解液體 積；加入重量比為總蛋白量的0.1 — 12倍量的6—氨基己酸或組氨酸，攪拌至完 全溶解，再用1. OMm與0. 22Mm的濾芯依次進行過濾，收集濾液並移入攪拌罐中， 再加入由枸櫞酸鈉與三羥甲基氨基甲烷製成的緩衝溶液，調節pH值至5.0—9.0, 每升加入聚山梨酯-80為10. 13g與磷酸三丁酯3. 04g，攪拌均勻，25。C保溫攪拌 6小時。每升加入甘氨酸lg—30g，使其溶解，將血漿降溫至0 4t:，每升加入 醋酸鈉50g—250g，使其溶解，攪拌30分鐘。用3000轉/分鐘一 10000轉/分 鐘的高速冷凍離心機離心，收集沉澱，得主體膠第一次純化物。(3) .取步驟(2)收集沉澱攪碎，加入由枸櫞酸鈉與三羥甲基氨基甲垸製成的 pH值7.0—10.0的緩衝溶液，攪拌至完全溶解，過濾，測蛋白含量和溶解液體 積；加入重量比為總蛋白量的O. 1 — 12倍量的6—氨基已酸或組氨酸，攪拌至完 全溶解，再每升加入甘氨酸lg—30g，使其溶解，將溶液降溫至0 4t:，每升加 入醋酸鈉50g—250g，使其溶解，攪拌30min。用3000轉/分鐘一 10000轉/分 鐘的高速冷凍離心機離心，收集沉澱。用濃度為0.1°/。三羥甲基氨基甲垸以鹽酸 調pH值3.0 7.0的溶液，分次加入沉澱中，進行攪拌洗滌3-5次，收集沉澱， 得主體膠第二次純化物。(4) .取步驟(3)最後收集沉澱350g—600g，加注射用水8000ml在37'C水浴下 溶解，過濾除去雜質，並檢測蛋白含量，得主體膠原液；另取組氨酸lg—100g、 枸櫞酸鈉10g—100g、蔗糖100g—500g、氯化鈉10g—100g、聚山梨酯80: 0. lg 一50g、精氨酸O. lg—100g加入到約1800ml注射用水中，攪拌使其完全溶解， 再加入到主體膠原液中，攪拌均勻，然後再另加入200ral含2g—25g白蛋白的溶 液，攪拌均勻，加注射用水調整至10000ml,加鹽酸調節pH至5. 0— 8 . 0用0. 22Mm 濾膜過濾，灌裝，冷凍乾燥，10(TC乾熱法病毒滅活30分鐘，檢驗，包裝，得主體 膠凍乾粉。2—8'C低溫庫保存。上述的高效生物膠封閉劑，其中，所述的催化劑凍乾粉的製備方法包括如下 步驟(1).以豬血液為原料，將豬血液於4。C一15。C低溫庫中靜置，讓其分層，用 虹吸法吸取上層血漿液，下層紅細胞棄去；上層血漿液用3000轉/分鐘一10000 轉/分鐘的高速冷凍離心機離心30分鐘一60分鐘，收集血漿,用0. 22Mm濾膜過 濾；取濾過血漿，每升依次加入聚山梨酯-80: 10.13g、磷酸三丁酯3.04g到血漿中，攪拌罐中25'C攪拌6小時，再每升加入硫酸鋇5g—30g，攪拌吸附2小時; 用3000轉/分鐘一 10000轉/分鐘的高速冷凍離心機離心，收集沉澱。(2) .取步驟(l)收集沉澱，加入1_5倍量的9%—15%的氯化鈉水溶液攪拌， 用轉速為2000轉/分鐘一5000轉/分鐘的離心機離心30min、離心溫度為4'C， 棄上清液，得沉澱。重複2—4次。取沉澱加入1_5倍量的10%—20%的枸櫞酸 鈉水溶液，攪拌30分鐘，以2000轉/分鐘一5000轉/分鐘的離心機離心30分 鍾、離心溫度為4。C，收集上清液。重複3—5次，合併上清液。(3) .取步驟(2)上清液，用0.22Mm濾膜過濾。取濾液，分別加入的氯化鈣溶 液和甘氨酸溶液，使最後的溶液中氯化鈣含量為1.8%、甘氨酸含量為1%，攪拌 均勻，調pH值至4.5—8.0，以0.22Mm濾膜過濾。濾液密封室溫放置8小時， 後轉入2 8"低溫庫中繼續放置2—3天。超濾、脫鹽、濃縮，將濃縮液離心， 以2000轉/分鐘一5000轉/分鐘的離心機離心30分鐘、離心溫度為4°C，收集 上清液，測量體積，攪拌均勻，檢測凝血酶效價。(4) .取步驟(3)最後的上清液，加入甘氨酸與白蛋白溶液，加入注射用水調整 最後溶液的體積，使得最後溶液的凝血酶效價為450_650IU/ml、甘氨酸含量 20mg/ml_80mg/ml、白蛋白含量5mg/ml_30mg/ml，在無菌條件下，用0. 22Mm 濾膜過濾，灌裝，冷凍乾燥，IO(TC乾熱法病毒滅活30分鐘，檢驗，包裝，得催 化劑凍乾粉。2—8'C低溫庫保存。上述的高效生物膠封閉劑，其中，主體膠溶解液的製備方法包括如下步驟 稱取醋酸鈉lg—15g和氯化鈉lg—15g，加入到1000ml注射用水中，攪拌至完 全溶解，用醋酸調pH值至3.5 7.0,攪拌均勻，在無菌條件下，用0.22Wii濾膜 過濾，灌裝，軋蓋，滅菌，檢驗，包裝，得主體膠溶解液。2—8。C低溫庫保存。上述的高效生物膠封閉劑，其中，催化劑溶解液的製備方法包括如下步驟 稱三羥甲基氨基甲烷3g—20g和氯化鈣5g—30g,加入到1000ml注射用水中， 攪拌至完全溶解，用鹽酸調pH值至5. 0—8. 0，攪拌均勻，在無菌條件下，用0. 22陶 濾膜過濾，灌裝，軋蓋，滅茵，檢驗，包裝，得催化劑溶解液。2—8'C低溫庫保 存。上述的高效生物膠封閉劑的應用，將主體膠凍乾粉溶於主體膠溶解液製成組 份A，催化劑凍乾粉溶於催化劑溶解液製成組份B，使用時分別吸入組份A與組 份B到組合式推液支架(本申請人的專利產品，公告號CN2553815Y)的雙腔推 液器的無菌注射器內，通過雙腔推液器的錐頭均勻混合二種溶液，同時呈霧狀或細滴噴塗到手術或出血創面即可形成一層半透明乳白色薄膜。上述的高效生物膠封閉劑的應用，其中，所述的組份A和組份B為液體，使 用時二種溶液通過組合式推液支架(本申請人的專利產品，公告號CN2553815Y) 的錐頭均勻混合，呈霧狀或細滴噴塗到手術或出血創面，形成一層纖維蛋白膜， 起到封閉創面或止血止滲的作用，可以用於普通外科、骨科、心胸外科、神經外 科、婦產科的組織止血、組織封口和組織粘合。本發明通過對豬纖維蛋白原及XIII因子凝固活性調解因素的研究，以最佳的 組合配方和製備工藝，發明了上述高效生物膠封閉劑，具有如下特點1. 本發明是一種生物膠組合物，組方合理，製備工藝簡單，生產易實現自動 化控制。2. 本發明利用豬血作為主原料進行纖維蛋白原與XIII因子以及凝血酶的提 純。由於豬的基因序列同人的基因序列極為相似，而攜帶人類的傳染性疾病傳播 風險極小，既降低了成本，又避免了人類血源性疾病的傳播機會。3. 本發明產品以豬血作為原料，以獨特的工藝和配方製備生物膠主體膠凍 乾粉和催化劑凍乾粉，在製備工藝中包括了去免疫原性、S/D法病毒滅活等工藝 方法，使產品具有更高的可靠性與安全性。4. 本發明的最終產品配合本申請人的專利(公告號CN2553815Y)產品組合 式推液支架使用，具有極佳的封閉、止血效果，其封閉凝固時間為3 — 5秒，較 目前同類產品明顯縮短(目前同類中封閉凝固時間最快的產品(如中國專利 CN1214446C)的凝固時間約為9_12秒)，為臨床病人的搶救爭取了更大的機會。5. 本發明生產安全環保。製備工藝的全過程中徹底摒棄了以往的有機溶劑使 用，操作過程中對人員和周圍環境不產生危害，符合國家的環保要求。


圖1是本發明高效生物膠封閉劑形成生物膠薄膜的流程圖。
具體實施方式
本發明是一種高效生物膠封閉劑，它由主體膠凍乾粉、催化劑凍乾粉、主體 膠溶解液和催化劑溶解液四個組分構成。其中按重量百分比計算，主體膠凍幹 粉含纖維蛋白原和Xin因子33.3% —71.0%,氯化鈉2.0—5.6%，枸椽酸鈉2.0 —5. 6%，蔗糖20. 2%—27. 8%，組氨酸0. 2%—5. 6%，精氨酸0. 2% —5. 6%,聚山梨酯0. 2%—2. 8%,白蛋白4. 2 — 14. 0%;催化劑凍乾粉含凝血酶450 IU/ml—650 IU/ml， 甘氨酸20mg/ml—80mg/ml，白蛋白5mg/ral — 30mg/ml;主體膠溶解液含醋酸鈉 lmg/ml_15mg/ml,氯化鈉lmg/ml — 15mg/ml;催化劑溶解液含三羥甲基氨基甲 烷3mg/ml—20mg/ml ，鹽酸3mg/ml—20mg/ml ，氯化鈣5mg/ml — 30mg/ml 。以下通過具體的實施例子對本發明各組分的含量、製備以及應用等做進一步 的闡述，但本發明並不限於此特定例子。實施例1主體膠凍乾粉製備一採集豬血液55000ml，加入含0. 147mol / L枸櫞酸鈉與0. 154mol / L氯化鈉 的抗凝劑6000ml，於4。C低溫庫中靜置6小時，讓其分層，用虹吸法吸取上層血 漿液，下層紅細胞棄去；上層血漿液用高速冷凍離心機在l(TC以3200轉/分鐘 的轉速離心40分鐘，收集血漿，用0. 22Wn濾膜過濾；取濾過血漿20000ml，加 入甘氨酸73.5g，使其溶解，將血漿降溫至4。C，加入醋酸鈉2605.4g，使其溶 解，攪拌30分鐘，高速冷凍離心機IO"C用3500轉/分鐘的轉速離心40分鐘， 收集沉澱，得沉澱2520.8g。將收集沉澱攪碎，加入33升由枸櫞酸鈉與三羥甲 基氨基甲垸製成的pH值7.5的緩衝溶液，攪拌至完全溶解，過濾，測得蛋白含 量為14mg/ml，得溶解液體積約35升；加入甘氨酸152.3g，攪拌至完全溶解， 再用1.0Mm與0.22m的濾芯依次進行過濾，收集濾液並移入攪拌罐中，再加入 由枸櫞酸鈉與三羥甲基氨基甲垸製成的的緩衝溶液，調節pH值至7. 3，加入聚山 梨酯80為354. 55g與磷酸三丁酯106. 4g，攪拌均勻，25'C保溫攪拌6小時；加 入甘氨酸249.5g，使其溶解，將血漿降溫至0 4'C，加入醋酸鈉8023.8g，使 其溶解，攪拌30分鐘。以4000轉/分鐘的轉速3。C冷凍離心，收集沉澱，得主 體膠第一次純化物2488. 6g。取主體膠第一次純化物，加入33升由枸櫞酸鈉與 三羥甲基氨基甲垸製成的pH值10.0的緩衝溶液，攪拌至完全溶解，過濾，甘氨 酸104.2g，攪拌至完全溶解，將溶液降溫至3'C，加入醋酸鈉4800g，使其溶解， 攪拌30分鐘。用4000轉/分鐘的轉速3'C冷凍離心，收集沉澱。沉澱用濃度為 0.ly。三羥甲基氨基甲烷以鹽酸調pH值7.0的溶液，分次加入沉澱中，進行攪拌 洗滌4次，收集沉澱，得主體膠第二次純化物2378. 5g。取主體膠第二次純化物 600g，加注射用水8000ml在37'C水浴下溶解，過濾除去雜質，得主體膠原液； 另取組氨酸70g、枸櫞酸鈉90g、蔗糖150g、氯化鈉20g、聚山梨酯80: 5.0g、 精氨酸1. 8g加入到約1800ml注射用水中，攪拌使其完全溶解，再加入到主體膠原液中，攪拌均勻，然後再另加入200ml含5g白蛋白的溶液，攪拌均勻，加注 射用水調整至10000ml,加鹽酸調節pH至7. 2用0. 22Mrn濾膜過濾，灌裝，冷凍幹 燥，10(TC乾熱法病毒滅活30分鐘，檢驗，包裝，得主體膠凍乾粉。2—8'C低溫 庫保存。實施例2主體膠凍乾粉製備二採集豬血液50000ml，加入含0. 151mol / L枸櫞酸鈉與0. 148mol / L氯化鈉 的抗凝劑5700ml，於4'C低溫庫中靜置8小時，讓其分層，用虹吸法吸取上層血 漿液，下層紅細胞棄去；上層血漿液用高速冷凍離心機在l(TC以5000轉/分鐘 的轉速離心30分鐘，收集血漿，用0. 22Mm濾膜過濾；取濾過血漿18000ral，加 入甘氨酸86.5g，使其溶解，將血漿降溫至2。C，加入醋酸鈉3024.8g，使其溶 解，攪拌30分鐘，高速冷凍離心機IO'C用4000轉/分鐘的轉速離心30分鐘， 收集沉澱，得沉澱2490.8g。將收集沉澱攪碎，加入32升由枸櫞酸鈉與三羥甲 基氨基甲烷製成的pH值6.5的緩衝溶液，攪拌至完全溶解，過濾，測得蛋白含 量為16mg/ml，得溶解液體積約33升；加入6—氨基己酸254. 9g，攪拌至完全 溶解，再用1.0陶與0.22Mm的濾芯依次進行過濾，收集濾液並移入攪拌罐中， 再加入由枸櫞酸鈉與三羥甲基氨基甲烷製成的的緩衝溶液，調節pH值至7. 2，加 入聚山梨酯80為334. 3g與磷酸三丁酯100. 2g，攪拌均勻，25。C保溫攪拌6小時； 加入甘氨酸312.7g，使其溶解，將血漿降溫至2。C，加入醋酸鈉6817.2g，使其 溶解，攪拌30分鐘。以5000轉/分鐘的轉速2"冷凍離心，收集沉澱，得主體 膠第一次純化物2416. 6g。取主體膠第一次純化物，加入32升由枸櫞酸鈉與三 羥甲基氨基甲垸製成的pH值9.0的緩衝溶液，攪拌至完全溶解，過濾，6_氨基 已酸100.2g，攪拌至完全溶解，再加入甘氨酸320. lg，使其溶解，將溶液降溫 至2。C，加入醋酸鈉5200g，使其溶解，攪拌30分鐘。用8000轉/分鐘的轉速 2t冷凍離心，收集沉澱。沉澱用濃度為0. 1%三羥甲基氨基甲垸以鹽酸調pH值 6.8的溶液，分次加入沉澱中，進行攪拌洗滌3次，收集沉澱，得主體膠第二次 純化物2392. 5g;取主體膠第二次純化物580g，加注射用水8000ml在37'C水浴 下溶解，過濾除去雜質，得主體膠原液；另取組氨酸40g、枸櫞酸鈉30g、蔗糖 200g、氯化鈉60g、聚山梨酯80: 10g、精氨酸6g加入到約1800注射用水中， 攪拌使其完全溶解，再加入到主體膠原液中，攪拌均勻，然後再另加入200ml 含10g白蛋白的溶液，攪拌均勻，加注射用水調整至10000ml,加鹽酸調節pH至7. 0,用0. 22Mrn濾膜過濾，灌裝，冷凍乾燥，100'C乾熱法病毒滅活30分鐘，檢驗， 包裝，得主體膠凍乾粉。2—8'C低溫庫保存。實施例3主體膠凍乾粉製備三採集豬血液60000ml，加入含0. 145mol / L枸櫞酸鈉與0. 151mol / L氯化鈉 的抗凝劑6000ml，於5"低溫庫中靜置6小時，讓其分層，用虹吸法吸取上層血 漿液，下層紅細胞棄去；上層血漿液用高速冷凍離心機在l(TC以5000轉/分鐘 的轉速離心60分鐘，收集血漿，用0. 22Mm濾膜過濾；取濾過血漿22000ml，加 入甘氨酸95.8g，使其溶解，將血漿降溫至3。C，加入醋酸鈉2931.8g，使其溶 解，攪拌30分鐘，高速冷凍離心機l(TC用6000轉/分鐘的轉速離心30分鐘， 收集沉澱，得沉澱2685.8g。將收集沉澱攪碎，加入35升由枸櫞酸鈉與三羥甲 基氨基甲烷製成的pH值7.8的緩衝溶液，攪拌至完全溶解，過濾，測得蛋白含 量為18mg/ml,得溶解液體積約36. 5升；加入甘氨酸190. 5g，攪拌至完全溶解， 再用l. Own與0. 22陶的濾芯依次進行過濾，收集濾液並移入攪拌罐中，再加入 由枸櫞酸鈉與三羥甲基氨基甲烷製成的的緩衝溶液，調節pH值至7. 3，加入聚山 梨酯-80為371.2g與磷酸三丁酯110.9g,攪拌均勻，25'C保溫攪拌6小時;加入 甘氨酸298.5g，使其溶解，將血漿降溫至3。C，加入醋酸鈉7865. 8g，使其溶解， 攪拌30分鐘。以6000轉/分鐘的轉速3。C冷凍離心，收集沉澱，得主體膠第一 次純化物2688.6g。取主體膠第一次純化物，加入35升由枸櫞酸鈉與三羥甲基 氨基甲垸製成的pH值8. 5的緩衝溶液，攪拌至完全溶解，過濾，組氨酸112. 2g， 攪拌至完全溶解，再加入甘氨酸280.4g，使其溶解，將溶液降溫至3'C，加入醋 酸鈉5800g，使其溶解，攪拌30分鐘。用6000轉/分鐘的轉速3。C冷凍離心， 收集沉澱。沉澱用濃度為0.1。/。三羥甲基氨基甲烷以鹽酸調pH值7.0的溶液，分 次加入沉澱中，進行攪拌洗滌5次，收集沉澱，得主體膠第二次純化物2540. 4g。 取主體膠第二次純化物520g，加注射用水8000ml在37'C水浴下溶解，過濾除去 雜質，得主體膠原液；另取組氨酸30g、枸櫞酸鈉20g、蔗糖280g、氯化鈉90g、 聚山梨酯80: 3. 0g、精氨酸7. 8g加入到約1800注射用水中，攪拌使其完全溶 解，再加入到主體膠原液中，攪拌均勻，然後再另加入200ml含20g白蛋白的溶 液，攪拌均勻，加注射用水調整至10000ml,加鹽酸調節pH至6. 8用0. 22m濾 膜過濾，灌裝冷凍乾燥瓶中，冷凍乾燥，10(TC乾熱法病毒滅活30分鐘，檢驗，包 裝，得主體膠凍乾粉。2—8TM氏溫庫保存。實施例4催化劑凍乾粉製備一採集豬血液50000ml，加入含O. 151mol/L枸櫞酸鈉、0. 148mol / L氯化鈉 與0. 138mol / L草酸鉀的抗凝劑5000ml，於5'C低溫庫中靜置8小時，讓其分層， 用虹吸法吸取上層血漿液，下層紅細胞棄去；上層血漿液用3500轉/分鐘的轉 速l(TC冷凍離心50分鐘，收集血漿，用0. 22Mm濾膜過濾；取濾過血漿24000ml， 依次加入聚山梨酯-80: 243. lg、磷酸三丁酯73.0g到血漿中，攪拌罐中25。C攪 拌6小時，再加入硫酸鋇480g，攪拌吸附2小時；用5000轉/分鐘的轉速10 'C冷凍離心40分鐘，收集沉澱，得沉澱590g;取沉澱，加入1200ml的9%的氯 化鈉水溶液攪拌，用轉速為3200轉/分鐘的離心機離心30min、離心溫度為4 'C，棄上清液，得沉澱。重複2次。取沉澱加入1200ml的10%的枸櫞酸鈉水溶 液，攪拌30分鐘，以3500轉/分鐘的離心機離心30分鐘、離心溫度為4i:， 收集上清液。重複3次，合併上清液；取上清液，用0.22陶濾膜過濾；取濾液， 分別加入200ml的36%氯化鈣溶液和200ml的20%甘氨酸溶液，攪拌均勻，調pH 值至7.0，以0.22Mm濾膜過濾，濾液密封室溫放置8小時，後轉入2'C低溫庫中 繼續放置2天。超濾、脫鹽、濃縮，得濃縮液500ml,將濃縮液離心，以4000轉 /分鐘的離心機離心30分鐘、離心溫度為4°C，收集上清液，測量體積為480ml， 攪拌均勻，檢測凝血酶效價為2600IU/ml;取上清液，加入甘氨酸120g與6%的 白蛋白溶液1000ml，加入注射用水調整溶液的體積至4000ml，檢測凝血酶效價 為650IU/ml,在無菌條件下，用0.22Wn濾膜過濾，灌裝,冷凍乾燥，IO(TC乾熱 法病毒滅活30分鐘，檢驗，包裝，得催化劑凍乾粉。2—8。C低溫庫保存。實施例5催化劑凍乾粉製備二採集豬血液60000ml,加入含O. 151mol/L枸櫞酸鈉、0.148mol / L氯化鈉 與O. 138mol/L草酸鉀的抗凝劑6000ml，於14。C低溫庫中靜置6小時，讓其分 層，用虹吸法吸取上層血槳液，下層紅細胞棄去；上層血漿液用5000轉/分鐘 的轉速l(TC冷凍離心40分鐘，收集血漿，用0.22Wn濾膜過濾；取濾過血漿 26000ml，依次加入聚山梨酯-80: 264. 4g、磷酸三丁酯79. lg到血漿中，攪拌罐 中25'C攪拌6小時，再加入硫酸鋇540g，攪拌吸附2小時；用6000轉/分鐘的 轉速1(TC冷凍離心30分鐘，收集沉澱，得沉澱650g;取沉澱，加入1200ml的 15%的氯化鈉水溶液攪拌，用轉速為5000轉/分鐘的離心機離心30min、離心溫度為4'C，棄上清液，得沉澱。重複4次。取沉澱加入1500ml的20%的枸櫞酸鈉 水溶液，攪拌30分鐘，以5000轉/分鐘的離心機離心30分鐘、離心溫度為4 。C，收集上清液。重複5次，合併上清液；取上清液，用0.22陶濾膜過濾；取 濾液，分別加入400ml的36%氯化鈣溶液和400ml的20%甘氮酸溶液，攪拌均勻， 調pH值至7. 0，以0. 22Mm濾膜過濾,濾液密封室溫放置8小時，後轉入4'C低溫 庫中繼續放置3天。超濾、脫鹽、濃縮，得濃縮液2000ml，將濃縮液離心，以5000 轉/分鐘的離心機離心30分鐘、離心溫度為4°C，收集上清液，測量體積為 1950ml，攪拌均勻，檢測凝血酶效價為1800IU/ml;取上清液，加入甘氨酸250g 與6y。的白蛋白溶液1500ml，加入注射用水調整溶液的體積至6000ml，檢測凝血 酶效價為580IU/ml，在無菌條件下，用0.22Mm濾膜過濾，灌裝，冷凍乾燥，100 "C乾熱法病毒滅活30分鐘，檢驗，包裝，得催化劑凍乾粉。2—8"C低溫庫保存。實施例6催化劑凍乾粉製備三採集豬血液55000ml，加入含O. 147mol/L枸櫞酸鈉、0.146mol / L氯化鈉 與O. 135mol/L草酸鉀的抗凝劑5500ml，於12。C低溫庫中靜置8小時，讓其分 層，用虹吸法吸取上層血漿液，下層紅細胞棄去；上層血漿液用4000轉/分鐘 的轉速10。C冷凍離心50分鐘，收集血漿，用0.22Mffl濾膜過濾；取濾過血漿 25000ml，依次加入聚山梨酯-80: 254. 3g、磷酸三丁酯76. 0g到血漿中，攪拌罐 中25"C攪拌6小時，再加入硫酸鋇600g，攪拌吸附2小時；用5000轉/分鐘的 轉速1(TC冷凍離心40分鐘，收集沉澱，得沉澱700g;取沉澱，加入1500ml的 10%的氯化鈉水溶液攪拌，用轉速為4000轉/分鐘的離心機離心30min、離心溫 度為4。C,棄上清液，得沉澱。重複3次。取沉澱加入1500ml的15%的枸櫞酸鈉 水溶液，攪拌30分鐘，以4000轉/分鐘的離心機離心30分鐘、離心溫度為4 。C，收集上清液。重複4次，合併上清液；取上清液，用0.22to濾膜過濾；取 濾液，分別加入300ml的36%氯化鈣溶液和300ml的20%甘氨酸溶液，攪拌均勻， 調pH值至7. 0，以0. 22Mm濾膜過濾，濾液密封室溫放置8小時，後轉入4'C低溫 庫中繼續放置2天。超濾、脫鹽、濃縮，得濃縮液1200ml，將濃縮液離心，以4500 轉/分鐘的離心機離心30分鐘、離心溫度為4'C，收集上清液，測量體積為 1280ml，攪拌均勻，檢測凝血酶效價為2200IU/ml;取上清液，加入甘氨酸180g 與6。/。的白蛋白溶液1500ml，加入注射用水調整溶液的體積至6000ml，檢測凝血 酶效價為450IU/ml，在無菌條件下，用0. 22Mm濾膜過濾，灌裝，冷凍乾燥，100"乾熱法病毒滅活30分鐘，檢驗，包裝，得催化劑凍乾粉。2—8'C低溫庫保存。實施例7主體膠溶解液與催化劑溶解液的製備一稱取醋酸鈉40. 8g和氯化鈉64. 3g，加入到10000ml注射用水中，攪拌至完 全溶解，用醋酸調pH值至6.5，攪拌均勻，在無菌條件下，用0.22Wn濾膜過濾， 灌裝,軋蓋，滅茵，檢驗，包裝，得主體膠溶解液。2 — 8XM氏溫庫保存。稱取三羥甲基氨基甲烷61g和氯化鈣66g，加入到10000ml注射用水中，攪 拌至完全溶解，用鹽酸調pH值至7. 0，攪拌均勻，在無菌條件下，用0. 22陶濾 膜過濾，灌乾軋蓋，滅茵，檢驗，包裝，得催化劑溶解液。2—8'C低溫庫保存。實施例8主體膠溶解液與催化劑溶解液的製備二稱取醋酸鈉20. 2g和氯化鈉84. 9g，加入到10000ml注射用水中，攪拌至完 全溶解，用醋酸調pH值至7.0，攪拌均勻,在無菌條件下，用0.22陶濾膜過濾， 灌裝，軋蓋，滅茵，檢驗，包裝，得主體膠溶解液。2—8'C低溫庫保存。稱取三羥甲基氨基甲垸42g和氯化鈣85g，加入到10000ml注射用水中，攪 拌至完全溶解，用鹽酸調pH值至7. 0，攪拌均勻，在無菌條件下，用0. 22Mm濾 膜過濾，灌裝，軋蓋，滅茵，檢驗，包裝，得催化劑溶解液。2—8'C低溫庫保存。實施例9主體膠溶解液與催化劑溶解液的製備三稱取醋酸鈉62.5g和氯化鈉48.3g，加入到10000ml注射用水中，攪拌至完 全溶解，用醋酸調pH值至6.5，攪拌均勻，在無菌條件下，用0.22m濾膜過濾， 灌裝，軋蓋，滅茵，檢驗，包裝，得主體膠溶解液。2—8'C低溫庫保存。稱取三羥甲基氨基甲烷72g和氯化鈣57g，加入到10000ml注射用水中，攪 拌至完全溶解，用鹽酸調pH值至6. 5,攪拌均勻,在無菌條件下，用0. 22Mm濾 膜過濾，灌裝，軋蓋，滅茵，檢驗，包裝，得催化劑溶解液。2—8'C低溫庫保存。實施例10組合生物膠的塗層製備業已發現，採用一種含纖維蛋白原與凝血酶的生物膠的成功塗敷，取決於所 形成生物膠的質地、凝固時間等。因此，人們希望能夠提供一種用於製備具有一 定質地、凝固時間短的生物膠與塗敷方法，特別是對於製備適合於含纖維蛋白原 與凝血酶塗敷的生物膠，從而得到一種用於治療和密封傷口的醫用止血材料。所形成的生物膠的作用與過程模擬血液凝固過程的最後一階段，凝血酶斷裂纖維蛋 白原的(ocA、pB)2鏈而釋放酸性多肽A和B，使纖維蛋白原轉化為纖維蛋白單體， 各單體自發聚集成無橋鍵相連的多聚體；同時凝血酶激活XIII因子，激活的XIII 因子在Ca2+的作用下催化各纖維蛋白單體間兩條Y鏈的穀氨醯氨殘基和賴氨酸的 s-氨基形成共價鍵，最終形成穩定的纖維蛋白多聚體。其呈一種十字交叉、多層、 均勻的網狀結構，能夠網羅住紅細胞及有形成份，同時為成纖維細胞及毛細血管 的爬行及生長提供生物支架。因此，所述生物膠的塗層製備的方法，可包括以下步驟 實施例1的主體膠凍乾粉溶於實施例7主體膠溶解液製成組份Al,實施例4 的催化劑凍乾粉溶於實施例7催化劑溶解液製成組份Bl，製成組份Al和組份Bl 二種液體溶液,使用時分別吸入組份A1與組份B1到組合式推液支架(本公司的 專利CN2553815Y產品)雙腔推液器的無菌注射器內，通過雙腔推液器的錐頭均 勻混合二種溶液，同時通過錐頭的噴口噴塗到手術或出血創面，即形成一層半透 明乳白色生物膠薄膜,起到封閉創面或止血止滲的作用，可以用於普通外科、骨 科、心胸外科、神經外科、婦產科的組織止血、組織封口和組織粘合。生物膠薄 膜的形成如圖l所示。實施例ll本發明實施產品的物理效果效果檢驗1. 實施例1、實施例4與實施例7的物理效果測試(1) .溶解時間測定將實施例1的主體膠凍乾粉溶解於實施例7主體膠溶解 液製成組份Al，實施例4的催化劑凍乾粉溶解於實施例7催化劑溶解液製成組份 Bl，溶解時間3分鐘。(2) .凝固時間測定，取組份A1與組份B1分別吸入到組合式推液支架(本申 請人的專利產品，公告號CN2553815Y)雙腔推液器的無菌注射器內，通過雙腔 推液器的錐頭均勻混合二種溶液，同時噴塗到玻璃板面上，用秒表計時，凝固時 間3-5秒。(3) .強度測定在直徑5.0cm，高0.5cm(表面積為19.6cm2)的無菌器皿內， 加入組份Al和組份Bl的溶液各2. 5ml， 36. 5'C條件下，放置10分鐘，將膜從 皿中完整取出，形狀為膠膜狀，有彈性。繞屈180'無發生斷裂現象。2. 實施例2、實施例5與實施例8的物理效果測試(1).溶解時間測定將實施例2的主體膠凍乾粉溶解於實施例8主體膠溶解液製成組份A2,實施例5的催化劑凍乾粉溶解於實施例8催化劑溶解液製成組份 B2，溶解時間2分鐘。(2) .凝固時間測定，取組份A2與組份B2分別吸入到組合式推液支架(本申 請人的專利產品，公告號CN2553815Y)雙腔推液器的無菌注射器內，通過雙腔 推液器的錐頭均勻混合二種溶液，同時噴塗到玻璃板面上，用秒表計時，凝固時 間2-4秒。(3) .強度測定在直徑5.0cm，高0.5cm(表面積為19.6cm2)的無菌器皿內， 加入組份A2和組份B2的溶液各2. 5ml， 36. 5"C條件下，放置10分鐘，將膜從 皿中完整取出，形狀為膠膜狀，有彈性。繞屈180'無發生斷裂現象。3.實施例3、實施例6與實施例9的物理效果測試(1) .溶解時間測定將實施例3的主體膠凍乾粉溶解於實施例9主體膠溶解 液製成組份A3，實施例6的催化劑凍乾粉溶解於實施例9催化劑溶解液製成組份 B3，溶解時間4分鐘。(2) .凝固時間測定，取組份A3與組份B3分別吸入到組合式推液支架(本申 請人的專利產品，公告號CN2553815Y)雙腔推液器的無菌注射器內，通過雙腔 推液器的錐頭均勻混合二種溶液，同時噴塗到玻璃板面上，用秒表計時，凝固時 間3-5秒。(3) .強度測定在直徑5. Ocm，高0. 5cm(表面積為19. 6cm2)的無菌器皿內， 加入組份A3和組份B3的溶液各2. 5ml， 36. 5'C條件下，放置10分鐘，將膜從 皿中完整取出，形狀為膠膜狀，有彈性。繞屈18(T無發生斷裂現象。
權利要求
1.一種高效生物膠封閉劑，由主體膠凍乾粉、催化劑凍乾粉、主體膠溶解液和催化劑溶解液四個組分構成，其特徵在於按重量百分比計算，所述的主體膠凍乾粉含纖維蛋白原和XIII因子33.3％-71.0％，氯化鈉2.0-5.6％，枸椽酸鈉2.0-5.6％，蔗糖20.2％-27.8％，組氨酸0.2％-5.6％，精氨酸0.2％-5.6％，聚山梨酯0.2％-2.8％，白蛋白4.2-14.0％；所述的催化劑凍乾粉含凝血酶450IU/ml-650IU/ml，甘氨酸20mg/ml-80mg/ml，白蛋白5mg/ml-30mg/ml；所述的主體膠溶解液含醋酸鈉1mg/ml-15mg/ml，氯化鈉1mg/ml-15mg/ml；所述的催化劑溶解液含三羥甲基氨基甲烷3mg/ml-20mg/ml，鹽酸3mg/ml-20mg/ml，氯化鈣5mg/ml-30mg/ml。
2. 根據權利要求1所述的高效生物膠封閉劑，其特徵在於所述的主體膠 凍乾粉、催化劑凍乾粉是以豬血作為原材料製備的。
3. 根據權利要求1所述的高效生物膠封閉劑，其特徵在於所述主體膠凍幹 粉的製備方法包括如下步驟(1) .以豬血液為原料，將豬血液於2'C — 1(TC低溫庫中靜置，讓其分層，用 虹吸法吸取上層血漿液，下層紅細胞棄去；上層血漿液用3000轉/分鐘一10000 轉/分鐘的高速冷凍離心機離心30分鐘_60分鐘，收集血漿，用0. 22Wn濾膜過 濾；取濾過血漿，每升加入甘氨酸lg—30g，使其溶解，將血漿降溫至0 4t:， 每升加入醋酸鈉50g—250g，使其溶解，攪拌30分鐘；用3000轉/分鐘一 10000 轉/分鐘的高速冷凍離心機離心，收集沉澱；(2) .取步驟(l)收集沉澱攪碎，加入由枸櫞酸鈉與三羥甲基氨基甲烷製成的 pH值6.0—10.0的緩衝溶液，攪拌至完全溶解，過濾，測蛋白含量和溶解液體 積；加入重量比為總蛋白量的0.1 — 12倍量的6 —氨基已酸或組氨酸，攪拌至完 全溶解，再用1.0Mm與0.22Wn的濾芯依次進行過濾，收集濾液並移入攪拌罐中， 再加入由枸櫞酸鈉與三羥甲基氨基甲烷製成的緩衝溶液，調節pH值至5.0—9.0， 每升加入聚山梨酯80為10. 13g與磷酸三丁酯3. 04g，攪拌均勻，25。C保溫攪拌 6小時；每升加入甘氨酸lg—30g，使其溶解，將血漿降溫至0 4。C，每升加入 醋酸鈉50g—250g，使其溶解，攪拌30分鐘；用3000轉/分鐘一10000轉/分 鐘的高速冷凍離心機離心，收集沉澱，得主體膠第一次純化物；(3) .取步驟(2)收集沉澱攪碎，加入由枸櫞酸鈉與三羥甲基氨基甲垸製成的pH值7.0—10.0的緩衝溶液，攪拌至完全溶解，過濾，測蛋白含量和溶解液體 積；加入重量比為總蛋白量的0.1 — 12倍量的6—氨基已酸或組氨酸，攪拌至完 全溶解，再每升加入甘氨酸lg—30g，使其溶解，將溶液降溫至0 4'C，每升加 入醋酸鈉50g—250g，使其溶解，攪拌30分鐘；用3000轉/分鐘一10000轉/ 分鐘的高速冷凍離心機離心，收集沉澱；用濃度為0.1%三羥甲基氨基甲垸以鹽 酸調pH值3. 0 7. 0的溶液，分次加入沉澱中，進行攪拌洗漆3-5次，收集沉澱， 得主體膠第二次純化物；(4).取步驟(3)最後收集沉澱350g—600g，加注射用水8000ml在37'C水浴下 溶解，過濾除去雜質，並檢測蛋白含量，得主體膠原液；另取組氨酸lg—100g、 枸櫞酸鈉10g—100g、蔗糖100g—500g、氯化鈉10g—100g、聚山梨酯80: 0. lg 一50g、精氨酸0. lg—100g加入到約1800ml注射用水中，攪拌使其完全溶解， 再加入到主體膠原液中，攪拌均勻，然後再另加入200ml含2g—25g白蛋白的溶 液，攪拌均勻，加注射用水調整至10000ml,加鹽酸調節pH至5. 0— 8 . 0用0. 22Wn 濾膜過濾,灌裝，冷凍乾燥，10(TC乾熱法病毒滅活30分鐘，檢驗，包裝，得主體 膠凍乾粉。2—8'C低溫庫保存。
4.根據權利要求1所述的高效生物膠封閉劑，其特徵在於所述催化劑凍幹 粉的製備方法包括如下步驟-(1) .以豬血液為原料，將豬血液於4。C一15'C低溫庫中靜置，讓其分層，用 虹吸法吸取上層血漿液，下層紅細胞棄去；上層血漿液用3000轉/分鐘一10000 轉/分鐘的高速冷凍離心機離心30分鐘一60分鐘，收集血漿，用0. 22Mni濾膜過 濾；取濾過血漿，每升依次加入聚山梨酯-80: 10.13g、磷酸三丁酯3.04g到血 漿中，攪拌罐中25'C攪拌6小時，再每升加入硫酸鋇5g—30g，攪拌吸附2小時； 用3000轉/分鐘一IOOOO轉/分鐘的高速冷凍離心機離心，收集沉澱；(2) .取步驟(l)收集沉澱，加入l一5倍量的9%—15%的氯化鈉水溶液攪拌， 用轉速為2000轉/分鐘一5000轉/分鐘的離心機離心30min、離心溫度為4°C， 棄上清液，得沉澱；重複2—4次；取沉澱加入l一5倍量的10%—20%的枸櫞酸 鈉水溶液，攪拌30分鐘，以2000轉/分鐘一5000轉/分鐘的離心機離心30分 鍾、離心溫度為4。C，收集上清液；重複3 — 5次，合併上清液；(3) .取步驟(2)上清液，用0.22Mm濾膜過濾；取濾液，分別加入氯化鈣溶液 和甘氨酸溶液，使最後的溶液中氯化鈣含量為l.鄉、甘氨酸含量為1%，攪拌均 勻，調pH值至4.5—8.0，以0.22m濾膜過濾；濾液密封室溫放置8h，後轉入2 8。C低溫庫中繼續放置2 —3天；超濾、脫鹽、濃縮，將濃縮液離心，以2000 轉/分鐘一5000轉/分鐘的離心機離心30分鐘、離心溫度為4°C,收集上清液， 測量體積，攪拌均勻，檢測凝血酶效價；(4).取步驟(3)最後的上清液，加入甘氨酸與白蛋白溶液，加入注射用水調整 最後溶液的體積，使得最後溶液的凝血酶效價為450_650IU/ml、甘氨酸含量 20mg/ml — 80mg/ml、白蛋白含量5mg/ml — 30mg/ml，在無菌條件下，用0. 22Mm 濾膜過濾，灌裝,冷凍乾燥，IO(TC乾熱法病毒滅活30分鐘，檢驗，包裝，得催 化劑凍乾粉；2 — 8'C低溫庫保存。
5. 根據權利要求1所述的高效生物膠封閉劑，其特徵在於所述主體膠溶解 液的製備方法包括稱取醋酸鈉lg—15g和氯化鈉lg—15g，加入到1000ml注 射用水中，攪拌至完全溶解，用醋酸調pH值至3. 5 7. 0，攪拌均勻，在無菌條 件下，用0.22Wn濾膜過濾，灌裝，軋蓋，滅茵，檢驗，包裝，得主體膠溶解液； 2—8'C低溫庫保存。
6. 根據權利要求l所述的高效生物膠封閉劑，其特徵在於所述催化劑溶解 液的製備方法包括稱三羥甲基氨基甲垸3g—20g和氯化鈣5g—30g，加入到 1000ml注射用水中，攪拌至完全溶解，用鹽酸調pH值至5.0—8.0，攪拌均勻， 在無菌條件下，用0.22Wn濾膜過濾，灌裝,軋蓋，滅茵，檢驗，包裝，得催化劑 溶解液；2—8'C低溫庫保存。
7. 權利要求l所述的高效生物膠封閉劑的應用，其中所述的主體膠凍乾粉 溶於主體膠溶解液製成組份A，催化劑凍千粉溶於催化劑溶解液製成組份B，使 用時分別吸入組份A與組份B到雙腔推液器的無菌注射器內，通過雙腔推液器的 錐頭均勻混合二種溶液，同時噴塗到手術或出血創面，形成一層半透明乳白色薄 膜。
8. 根據權利要求6所述的高效生物膠封閉劑的應用，其中所述的組份A和 組份B為液體，使用時二種溶液均勻混合，應用於普通外科、骨科、心胸外科、 神經外科、婦產科的組織止血、組織封口和組織粘合。
全文摘要
本發明涉及一種高效生物膠封閉劑及其應用，它由主體膠凍乾粉、催化劑凍乾粉、主體膠溶解液和催化劑溶解液四個組分組成；使用時以主體膠溶解液將主體膠凍乾粉溶解，催化劑溶解液將催化劑凍乾粉溶解，然後分別吸入到雙腔推液器的無菌注射器內，通過雙腔推液器的錐頭均勻混合二種溶液，噴塗到手術或出血創面即可形成一層半透明乳白色薄膜；本發明還公開了上述高效生物膠封閉劑各組分的製備方法，包括以豬血作為原材料製備主體膠凍乾粉、催化劑凍乾粉等；本發明產品為即可使用的可吸收生物膠組合物，用於組織止血、組織封口和組織粘合，可廣泛應用於外科領域如普外科、骨科、心胸外科、神經外科、婦產科等。
文檔編號A61L24/00GK101214391SQ20071003290
公開日2008年7月9日 申請日期2007年12月27日 優先權日2007年12月27日
發明者李吉來, 江彩霞, 潘小寧, 肖尚志, 陳彥文, 星 黃 申請人:廣州倍繡生物技術有限公司