一種宮頸脫落細胞保存液的製作方法

2023-10-28 16:07:07 1

專利名稱：：一種宮頸脫落細胞保存液的製作方法
技術領域：
：本發明涉及細胞保存液，尤其涉及一種宮頸脫落細胞保存液。
背景技術：
：作為宮頸病變的篩査方法，傳統的巴氏塗片過程中涉及到的取材、塗片質量、細胞分離等諸多因素都會嚴重降低細胞的陽性率。細胞工程專家推出了一種製片新技術——液基薄層細胞學技術(TCT)，它主要通過技術處理丟掉非診斷雜質，製成觀察清晰的薄層細胞片，使閱片者更易觀察，診斷準確性明顯提高。液基薄層細胞學技術(TCT)改變了以往巴氏塗片的操作方法，標本取出後立即洗入細胞保存液中，避免了常規巴氏塗片過程中遺留在取材器上的細胞隨取材器一起被拋棄和細胞過度乾燥的現象。保存液中的細胞經程序化處理，隨機取樣製成均勻的薄層塗片，在薄片中的不正常細胞容易被觀察，並且溼固定的細胞核結構清晰，易於鑑別，可以檢測出較多的低級病變和一些更嚴重的病變，是目前國際上比較推行的新技術。採用液基薄層細胞學技術對異常細胞的診斷率提高了13%，對低度鱗狀上皮以上病變的檢出率提高了65%，具有傳統塗片無法比擬的優點。TCT技術中最為關鍵的試劑是細胞保存液。目前，市場上常用40-50%醇類作為保存液，在運輸和微觀玻片貯存中用來支持細胞，大於50%可以固定流動性高的蛋白質，但隨即蛋白質就形成沉積物，不能轉化成玻片，這給細胞學檢査帶來困難，同時會導致細胞表面變形。若小於20%細胞不能長時間固定保存，易導致細胞退化。TCT技術已成為篩査宮頸癌最好的推薦方法之一，為宮頸癌的早期診斷和治療提供了非常明確的診斷依據，尤其在現代文明技術高速發展的今天廣泛的推廣應用就顯得尤為迫切和重要，因此開發出合適的宮頸脫落細胞保存液已迫在眉睫。
發明內容本發明的目的就是為了克服上述現有技術存在的缺陷而提供一種細胞固定良好、成本較低、提高篩査靈敏度和特異度的宮頸脫落細胞保存液。本發明的目的可以通過以下技術方案來實現一種宮頸脫落細胞保存液，其特徵在於，該保存液包括以下組分及含量(重量):醇類20%-50%;抗聚集試劑15%-50%;緩衝液5%-10%;離子強度維持試劑1%-20%;抗微生物試劑0.01%-0.5%;粘液溶解試劑0.1-5%;清潔劑0-0.5%。所述的醇類包括甲醇、乙醇、異丙醇；所述的抗聚集試劑包括乙二胺四乙酸、乙二胺四乙酸鹽、肝激酶、鏈激酶。所述的乙二胺四乙酸鹽首選乙二胺四乙酸二鈉。所述的緩衝液包括醋酸-醋酸鹽緩衝液、N-(2-乙醯氨基)-2-氨基乙磺酸(ACES)、N-(2-乙醯胺)亞氨基二乙酸(ADA)、雙(2-羥乙基)-三羥甲基氨基甲烷(BIS-TRIS)、2-(N-嗎啡啉)乙磺酸(MES)、哌臻-N，N，-雙(2-乙磺酸)(PIPES);所述的離子強度維持試劑包括氯化鉀。所述的醋酸鹽選自醋酸鈉、醋酸鎂、醋酸鈣中的一種或幾種。所述的抗微生物試劑包括抗生素；所述的粘液溶解試劑包括二硫鍵打開試劑。所述的抗生素包括青黴素、鏈黴素、四環素或氨苄青黴素。所述的二硫鍵打開試劑包括甲基半胱氨酸、N-乙醯基-L-半胱氨酸、二硫蘇糖醇或二羥基二硫蘇糖醇。所述的清潔劑包括非離子型、陽離子型、陰離子型或雙性離子型表面活性劑。所述的非離子型表面活性劑包括聚乙烯吡咯垸酮K30、聚氧乙烯醚辛垸基酚、吐溫-20或吐溫-80，所述的陽離子型表面活性劑包括十六烷基二甲基氯化銨、十八烷基三甲基氯化銨、陽離子瓜爾膠、陽離子泛醇、陽離子矽油或十二烷基二甲基氧化胺，所述的陰離子型表面活性劑包括直鏈烷基苯磺酸鈉、a-烯基磺酸鈉、脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸鈉或十二烷基硫酸鈉，所述的雙性離子型表面活性劑包括十二垸基二甲基甜菜鹼或羧酸鹽型咪唑啉。本發明中的第一個成分醇類可以維持細胞DNA和蛋白質完整性，首選甲醇，也可選用乙醇、異丙醇，比例為20-50%;第二個成分是抗聚集試劑，選用可以溶解在甲醇或其他醇類中的抗聚集試劑，包括鰲合試劑""EDTA，首選碳酸氫二鈉合成的EDTA，也可選用肝激酶、鏈激酶等，濃度大約是15%-50%;第三種成分是緩衝液，用來調節pH值，適應標本中細胞釋放自溶副產物所導致的pH變化，以維持細胞形態特徵，首選醋酸鹽緩衝液，如醋酸鈉、醋酸鎂、醋酸鈣或聯合，也可選用其他如N-(2-乙醯氨基)-2-氨基乙磺酸(ACES)、N-(2-乙醯胺)亞氨基二乙酸(ADA)、雙(2-羥乙基)-三羥甲基氨基甲烷(BIS-TRIS)、2-(N-嗎啡啉)乙磺酸(MES)、哌臻-N,N，-雙(2-乙磺酸)(PIPES)，濃度大約為5%-10%;第四種成分是為了維持離子強度、防止細胞變型，不僅要溶解在保存液中還不能產生抗凝試劑(EDTA)沉澱，選用氯化鉀，濃度大約為1%-20%，維持離子強度的物質要在先前溶液中額外加入，或另外兼容於緩衝液中；第五種成分是抗微生物試劑，用以抑制待測樣本的保存液中的微生物白色念球菌、麴黴菌、大腸桿菌、假單胞菌和葡萄球菌，考慮隨收集、運輸、分析時間而降解的因素選取抗生素，包括青黴素、鏈黴素、四環素或氨苄青黴素等，抗生素的含量大約是0.01%-0.5%;第六種成分是粘液溶解試劑，包括甲基半胱氨酸、N-乙醯基-L-半胱氨酸、二硫蘇糖醇(DTT，一種蛋白質變性劑)、二羥基二硫蘇糖醇或是其他可以打破二硫鍵的試劑，濃度為0.1%-5%;此外，本發明保存液中還含有清潔劑，包括非離子型、陽離子型、陰離子型或雙性離子型表面活性劑。與現有技術相比，本發明的保存液不但能夠使細胞在體外液體懸浮液環境中可以保持形態，最小化蛋白沉澱，溶解較大的蛋白物質如血液、粘液，減少細胞聚集，而且還能夠選擇性消除或減少紅細胞，有效殺滅微生物，阻止逆轉錄酶活性，保留核酸和蛋白完整以便以後分析；此外，本發明大大降低TCT檢測的耗材成本，提高了宮頸癌篩査的靈敏度和特異度，加速了TCT技術在醫療系統的推廣和普及。圖1為採用本發明製作的病理標本的示意圖2為採用第一種現有保存液製作的病理標本的示意圖；圖3為採用第二種現有保存液製作的病理標本的示意圖。具體實施例方式下面對照附圖及具體實施例對本發明作進一步說明。實施例1一種宮頸脫落細胞保存液，該保存液包括以下組分及含jtableseeoriginaldocumentpage7tableseeoriginaldocumentpage8將上述組分按照含量要求均勻混合得到一種宮頸脫落細胞保存液。實施例6一種宮頸脫落細胞保存液，該保存液包括以下組分及含量(重量)組分含量(Kg)醇類甲醇50抗聚集試劑鏈激酶19.5緩衝液雙哌臻-N,N，-雙(2-乙磺酸)(PIPES)10離子強度維持試劑氯化鉀15抗微生物試劑氨苄青黴素0.5粘液溶解試劑二硫蘇糖醇5將上述組分按照含量要求均勻混合得到一種宮頸脫落細胞保存液。實施例7一種宮頸脫落細胞保存液，該保存液包括以下組分及含量(重量)tableseeoriginaldocumentpage9將上述組分按照含量要求均勻混合得到一種宮頸脫落細胞保存液。實施例8一種宮頸脫落細胞保存液，該保存液包括以下組分及含量(重量)tableseeoriginaldocumentpage9tableseeoriginaldocumentpage10將上述組分按照含量要求均勻混合得到一種宮頸脫落細胞保存液。通過設計雙盲實驗對本發明進行質量評估，具體如下在同一時間段隨機收集近期使用本產品和目前三級醫院普遍使用的其它兩種細胞保存液(下文中分別用B液和C液代替)製作的病理標本。所有片子由艾迪康臨床檢驗中心病理室製作，共收集300張病理片，包括本產品A液100張，B液105張，C液95張。專利申請人邀請浙江省最有經驗的TCT診斷專家在不知道廠家品牌的前提下對三組不同標號的TCT保存液進行評估，以達到公正客觀的目的，評估結果如下評估指標總背景、總體細胞量、細胞形態和保存質量對診斷的影響。評估結果A組(本發明)如圖1所示，總體細胞量尚可，細胞保存良好，淋巴細胞存在保存不佳，觀察滴蟲、皰疹等病變較費勁，應用於臨床在一定程度上會影響診斷的陽性率和準確率，但三者的比較中屬於較好的一種；B組(注B液)如圖2所示，細胞量相對前一種要少些，保存良好，優於前一種，但背景較亂，細胞退變情況也較常見，一定程度上會影響診斷的陽性率和準確率，總體與前者(即本發明)相差不大；C組(注C液)如圖3所示，三者比較中此組保存效果最差，細胞腫脹明顯，影響診斷的片子量很多，不建議應用於實驗室。本發明可包裝為20毫升/瓶，用於宮頸脫落細胞的保存，採用液基薄層細胞學技術制宮頸脫落細胞片子，供病理醫師進行細胞學診斷。液基薄層細胞學檢測系統(ThinprepCytologicTest,TCT)主要方法是將宮頸脫落細胞放入裝有保存液的小瓶中，再通過離心沉澱技術製片，按TBS法作出診斷報告，該法比傳統塗片方法準確率高。本發明宮頸脫落細胞保存液可以起到固定細胞，防止細胞聚集，分散粘液，去除紅細胞，維持pH值和離子強度，防止細胞變形，常溫保存等作用。使用本發明的取樣保存方法為第1步將掃把樣宮頸刷插入子宮頸內管並輕壓，刷毛吻合子宮頸外口而傾斜；第2步維持壓力，拇指和食指握住柄，順時針旋轉毛刷5-8次；第3步子宮頸刷置入液基瓶內，攪拌約10次，強力旋轉刷毛，最後丟棄刷第4步擰緊保存液瓶的蓋子；第5步於瓶身上註明病人姓名、病歷信息等隨申請單送檢。權利要求1.一種宮頸脫落細胞保存液，其特徵在於，該保存液包括以下組分及含量(重量)醇類20％-50％；抗聚集試劑15％-50％；緩衝液5％-10％；離子強度維持試劑1％-20％；抗微生物試劑0.01％-0.5％；粘液溶解試劑0.1-5％；清潔劑0-0.5％。2.根據權利要求1所述的宮頸脫落細胞保存液，其特徵在於，所述的醇類包括甲醇、乙醇、異丙醇；所述的抗聚集試劑包括乙二胺四乙酸、乙二胺四乙酸鹽、肝激酶、鏈激酶。3.根據權利要求2所述的宮頸脫落細胞保存液，其特徵在於，所述的乙二胺四乙酸鹽首選乙二胺四乙酸二鈉。4.根據權利要求1所述的宮頸脫落細胞保存液，其特徵在於，所述的緩衝液包括醋酸-醋酸鹽緩衝液、N-(2-乙醯氨基)-2-氨基乙磺酸(ACES)、N-(2-乙醯胺)亞氨基二乙酸(ADA)、雙(2-羥乙基)-三羥甲基氨基甲烷(BIS-TRIS)、2-(N-嗎啡啉)乙磺酸(MES)、哌臻-N，N，-雙(2-乙磺酸)(PIPES);所述的離子強度維持試劑包括氯化鉀。5.根據權利要求4所述的宮頸脫落細胞保存液，其特徵在於，所述的醋酸鹽選自醋酸鈉、醋酸鎂、醋酸鈣中的一種或幾種。6.根據權利要求1所述的宮頸脫落細胞保存液，其特徵在於，所述的抗微生物試劑包括抗生素；所述的粘液溶解試劑包括二硫鍵打開試劑。7.根據權利要求6所述的宮頸脫落細胞保存液，其特徵在於，所述的抗生素包括青黴素、鏈黴素、四環素或氨苄青黴素。8.根據權利要求6所述的宮頸脫落細胞保存液，其特徵在於，所述的二硫鍵打開試劑包括甲基半胱氨酸、N-乙醯基-L-半胱氨酸、二硫蘇糖醇或二羥基二硫蘇糖醇。9.根據權利要求1所述的宮頸脫落細胞保存液，其特徵在於，所述的清潔劑包括非離子型、陽離子型、陰離子型或雙性離子型表面活性劑。10.根據權利要求9所述的宮頸脫落細胞保存液，其特徵在於，所述的非離子型表面活性劑包括聚乙烯吡咯烷酮K30、聚氧乙烯醚辛烷基酚、吐溫-20或吐溫-80，所述的陽離子型表面活性劑包括十六烷基二甲基氯化銨、十八烷基三甲基氯化銨、陽離子瓜爾膠、陽離子泛醇、陽離子矽油或十二烷基二甲基氧化胺，所述的陰離子型表面活性劑包括直鏈烷基苯磺酸鈉、a-烯基磺酸鈉、脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸鈉或十二烷基硫酸鈉，所述的雙性離子型表面活性劑包括十二垸基二甲基甜菜鹼或羧酸鹽型咪唑啉。全文摘要本發明涉及一種宮頸脫落細胞保存液，該保存液包括以下組分及含量(重量)醇類20％-50％；抗聚集試劑15％-50％；緩衝液5％-10％；離子強度維持試劑1％-20％；抗微生物試劑0.01％-0.5％；粘液溶解試劑0.1-5％；清潔劑0-0.5％。與現有技術相比，本發明保存液不但能夠使細胞在體外液體懸浮液環境中可以保持形態，最小化蛋白沉澱，溶解較大的蛋白物質如血液、粘液，減少細胞聚集，而且還能夠選擇性消除或減少紅細胞，有效殺滅微生物，阻止逆轉錄酶活性，保留核酸和蛋白完整以便以後分析；此外，本發明大大降低TCT檢測的耗材成本，提高宮頸癌篩查的靈敏度和特異度，加速TCT技術在醫療系統的推廣和普及。文檔編號C12N5/08GK101363011SQ200810200008公開日2009年2月11日申請日期2008年9月17日優先權日2008年9月17日發明者孫翠蓮,方國偉,堯郭,婕陳申請人:上海艾迪康臨床檢驗中心有限公司