一種多效唑人工抗原的合成方法與流程
2023-10-28 07:43:10 1
本發明涉及一種多效唑人工抗原的合成方法，屬於生物化工技術領域。
背景技術：
多效唑作為一種抑制類的植物生長調節劑，具有延緩植物生長、抑制莖杆伸長、縮短節間、促進花芽分化、增加植物抗逆性能、提高作物產量等功能，廣泛應用於水稻、麥類、花生、果樹、菸草、油菜、大豆等農作物生產。多效唑在土壤中易被吸收，殘留時間長，可能對非目標物產生危害，許多歐盟國家已經禁用，很多國家對多效唑也作出了嚴格限量，我國在農產品上對多效唑的最嚴限量≤0.2mg/kg。因此，建立快速有效的檢測多效唑含量的方法具有重要意義及市場價值。
酶聯免疫法（ELISA）是一種極為高效、敏感、快速的檢測方法，然而得到高親和力和高特異性的單克隆單體是免疫學檢測的前提，人工抗原的合成是其中重要的一步。
技術實現要素：
本發明的目的是提供一種多效唑人工抗原的合成方法，所製備的產品用於多效唑免疫分析方法研究，為今後人們的研究提供了必需的人工抗原。
本發明的技術方案，一種多效唑人工抗原的合成方法，其由多效唑與4-溴丁酸苄酯、氫氧化鉀、氫氧化鋰反應得到具有羧基的產物，即半抗原PBBA，用碳二亞胺法將半抗原PBBA與載體蛋白偶聯，即得到多效唑人工抗原；步驟為：
（1）半抗原PBBA的合成：
合成路線如下：
稱取化合物Ⅰ多效唑5g（17.06mmol）和4-溴丁酸苄酯 13.16g（51.19mmol） 溶解於二甲亞碸50mL中，加入氫氧化鉀 1.05g（18.77mmol），在90℃下攪拌過夜，然後加水30mL，用乙酸乙酯萃取。有機層用鹽水洗滌，乾燥並濃縮，得到粗產物。粗品通過製備型-HPLC純化，得到化合物Ⅱ800mg；
稱取化合物Ⅱ600mg（1.25mmol）溶解在四氫呋喃3mL和水2mL混合溶液中，加入氫氧化鋰 131.5mg（3.13mmol），並在室溫下攪拌2h。反應溶液用乙酸乙酯萃取。將有機層用鹽水洗滌，乾燥並濃縮，得到粗產物。通過製備型HPLC純化粗產物，得到半抗原PBBA 200mg。
（2）完全抗原的製備：步驟（1）製備的半抗原PBBA，與KLH偶聯得到偶聯物完全抗原PBBA-KLH；或與BSA偶聯得到偶聯物完全抗原PBBA-BSA。
所述完全抗原PBBA-KLH製備方法如下：
a、稱取步驟（1）製備的PBBA 4.3mg，二環己基碳二亞胺3mg，N-羥基琥珀醯亞胺2mg，用300μL無水N,N-二甲基甲醯胺溶解(稱為A液)，室溫攪拌反4-5h。取匙孔血藍蛋白KLH 1.47mL(6.8mg/mL, PBBA與KLH摩爾比為4500︰1)，加入等體積硼酸緩衝溶液（稱為B液），在室溫條件下逐滴將A液加入到B液中，室溫反應過夜，即得偶聯物PBBA-KLH混合液；
b、透析：取10cm的透析袋，於沸水中煮沸5min，再用60℃的去離子水衝洗3min，保存在4℃去離子水中備用；將偶聯物PBBA-KLH混合液放入透析袋於0.01mol/L的PBS中透析3天，每天三次換液，即得完全抗原PBBA-KLH。
所述完全抗原PBBA-BSA製備方法如下：
a、稱取步驟（1）製備的PBBA 2mg，1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽3mg，N-羥基琥珀醯亞胺2mg，用300μL無水N,N-二甲基甲醯胺溶解(稱為A液)，室溫攪拌反應4-5h。稱取10mg 牛血清蛋白BSA（PBBA與BSA摩爾比為30︰1），溶解於2mL碳酸鈉/碳酸氫鈉緩衝溶液中，加入等體積硼酸緩衝溶液（稱為B液），在室溫條件下逐滴將A液加入到B液中，室溫反應過夜，即得偶聯物PBBA-BSA混合液；
b、透析：取10cm的透析袋，於沸水中煮沸5min，再用60℃的去離子水衝洗3min，保存在4℃去離子水中備用；將偶聯物PBBA-BSA混合液放入透析袋於0.01mol/L的PBS中透析3天，每天三次換液，即得完全抗原PBBA-BSA。
多效唑的人工抗原的鑑定
（1）採用核磁共振和液質聯用技術鑑定半抗原。
（2）人工抗原採用紫外法鑑定其偶聯結果，利用偶聯物中小分子與蛋白的濃度，計算其偶聯比。
偶聯比測定：估算偶聯物中被偶聯的兩種分子的比率（偶聯比率）的方法，雖然測定方法種類很多，但都是依據檢測偶聯物中被偶聯的兩種分子含量（或相對含量）的原理建立起來的。紫外法是依據合成的人工抗原中的小分子濃度與蛋白濃度的比確定偶聯比的。
偶聯物蛋白濃度測定：將反應前蛋白的質量除以透析後偶聯物的體積即得到偶聯物中蛋白的含量。
偶聯物中小分子濃度的測定：濃度為Xμg/mL的小分子在特徵峰處的吸光值A1，偶聯物在特徵峰處的吸光值A2，小分子的分子量為M，所以，偶聯物中小分子的濃度= ( A2×X)/ A1
偶聯比=（( A2×X)/ A1/M）/（蛋白濃度/蛋白分子量）×（稀釋倍數）
本發明的有益效果：本發明成功合成了多效唑的人工抗原，合成步驟簡潔，有效，完全可用於免疫分析中，為以後人們的研究提供了方便的途徑。
附圖說明
圖1半抗原PBBA的NMR鑑定圖。
圖2半抗原PBBA的LC-MS鑑定圖。
圖3 PBBA-KLH人工抗原的免疫原紫外鑑定圖。
圖4 PBBA-BSA人工抗原的免疫原紫外鑑定圖。
具體實施方式
實施例1 半抗原PBBA的合成
稱取化合物Ⅰ多效唑5g，17.06mmol和4-溴丁酸苄酯 13.16g，51.19mmol 溶解於二甲亞碸50mL中，加入氫氧化鉀 1.05g，18.77mmol，在90℃下攪拌過夜，然後加水30mL，用乙酸乙酯萃取。有機層用鹽水洗滌，乾燥並濃縮，得到粗產物。粗品通過製備型-HPLC純化，得到化合物Ⅱ800mg；
稱取化合物Ⅱ600mg，1.25mmol 溶解在四氫呋喃3mL和水2mL混合溶液中，加入氫氧化鋰 131.5mg，3.13mmol，並在室溫下攪拌2h。反應溶液用乙酸乙酯萃取。將有機層用鹽水洗滌，乾燥並濃縮，得到粗產物。通過製備型HPLC純化粗產物，得到半抗原PBBA 200mg。
（2）完全抗原的製備：步驟（1）製備的半抗原PBBA，與KLH偶聯得到偶聯物完全抗原PBBA-KLH；或與BSA偶聯得到偶聯物完全抗原PBBA-BSA。
實施例2所述完全抗原PBBA-KLH製備方法如下：
a、稱取實施例1步驟（1）製備的PBBA 4.3mg，二環己基碳二亞胺3mg，N-羥基琥珀醯亞胺2mg，用300μL無水N,N-二甲基甲醯胺溶解(稱為A液)，室溫攪拌反應4-5h。取匙孔血藍蛋白KLH 1.47mL(6.8mg/mL, PBBA與KLH摩爾比為4500︰1)，加入等體積硼酸緩衝溶液（稱為B液），在室溫條件下逐滴將A液加入到B液中，室溫反應過夜，即得偶聯物PBBA-KLH混合液；
b、透析：取10cm的透析袋，於沸水中煮沸5min，再用60℃的去離子水衝洗3min，保存在4℃去離子水中備用；將偶聯物PBBA-KLH混合液放入透析袋於0.01mol/L的PBS中透析3天，每天三次換液，即得完全抗原PBBA-KLH。
實施例3完全抗原PBBA-BSA製備方法如下：
a、稱取實施例1步驟（1）製備的PBBA 2mg，1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽3mg，N-羥基琥珀醯亞胺2mg，用300μL無水N,N-二甲基甲醯胺溶解(稱為A液)，室溫攪拌反應4-5h。稱取10mg 牛血清蛋白BSA（PBBA與BSA摩爾比為30︰1），溶解於2mL碳酸鈉/碳酸氫鈉緩衝溶液中,加入等體積硼酸緩衝溶液（稱為B液），在室溫條件下逐滴將A液加入到B液中，室溫反應過夜，即得偶聯物PBBA-BSA混合液；
b、透析：取10cm的透析袋，於沸水中煮沸5min，再用60℃的去離子水衝洗3min，保存在4℃去離子水中備用；將偶聯物PBBA-BSA混合液放入透析袋於0.01mol/L的PBS中透析3天，每天三次換液，即得完全抗原PBBA-BSA。
實施例4 多效唑人工抗原的鑑定
（1）採用核磁共振和液質聯用技術鑑定半抗原。
（2）人工抗原採用紫外法鑑定其偶聯結果，利用偶聯物中小分子與蛋白的濃度，計算其偶聯比。
偶聯比測定：估算偶聯物中被偶聯的兩種分子的比率（偶聯比率）的方法，雖然測定方法種類很多，但都是依據檢測偶聯物中被偶聯的兩種分子含量（或相對含量）的原理建立起來的。紫外法是依據合成的人工抗原中的小分子濃度與蛋白濃度的比確定偶聯比的。
偶聯物蛋白濃度測定：將反應前蛋白的質量除以透析後偶聯物的體積即可得到偶聯中蛋白的含量。
實施例2中PBBA-KLH免疫原的紫外鑑定圖如圖3所示；
實施例3中PBBA-BSA免疫原的紫外鑑定圖如圖4所示；
PBBA-BSA免疫原偶聯物中小分子濃度的測定：濃度為10μg/mL的小分子在特徵峰269nm處的吸光值A1= 0.30771，偶聯物在269nm處的吸光值A2=0.28649，小分子的分子量為380.2g/mol，所以，偶聯物中小分子的濃度 =(0.28649×10μg/mL)/ 0.30771=9.31039μg/mL；BSA濃度2mg/mL，BSA分子量67000。
偶聯比=（9.31039μg/mL/380.2）/（2mg/mL /67000）×12（稀釋倍數）=9.8。