蛋白質分離純化的方法及回收裝置製造方法

2023-10-28 17:53:27

蛋白質分離純化的方法及回收裝置製造方法
【專利摘要】本發明屬於蛋白質分離純化領域，具體涉及一種蛋白質分離純化的方法及回收裝置，包括等電聚焦電泳和SDS－聚丙烯醯胺凝膠電泳，在等電聚焦電泳中不使用還原劑，在SDS－聚丙烯醯胺凝膠電泳中凝膠用含有SDS的緩衝液處理，SDS的質量分數為0-1%。蛋白質分離純化的回收裝置包括蛋白質洗脫板和分子半透膜，蛋白質洗脫板底部通過噴膠粘有分子半透膜。本發明能夠有效地分離複雜的蛋白質混合物為單一的蛋白質。本發明提高了蛋白質的分離和純化效率並且保持了蛋白質的功能或酶活性，操作簡便。
【專利說明】蛋白質分離純化的方法及回收裝置

【技術領域】
[0001] 本發明屬於蛋白質分離純化領域，具體涉及一種蛋白質分離純化的方法及回收裝 置。

【背景技術】
[0002] 在蛋白質的生物化學研究中，電泳可以根據不同的電荷差異(在沒有變性的凝膠 電泳中）或者蛋白質的分子量的大小(在十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳）將蛋白混合 物分離而成為不同蛋白條帶。在一維凝膠電泳中，變性凝膠電泳的主要用途是從凝膠中檢 測和定位蛋白質，同時也可以用來從混合物中進一步分離純化蛋白質。一維凝膠電泳中使 用最廣泛的是十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳（SDS-PAGE)。在典型的SDS-PAGE中，樣 品用還原劑β-巰基乙醇或二硫蘇糖醇（DTT)和高濃度的SDS(2%)進行處理。還原劑可以 使由二硫鍵連接起來的蛋白質分解，SDS將結合到蛋白質基團上。經過這些處理，蛋白質將 按照其分子量在電場中移動。同非變性凝膠電泳相比，SDS-PAGE有更高的解析度，更重要的 是提供了一個可靠的方法來判斷蛋白質分子量的大小。雖然SDS-PAGE和非變性凝膠電泳 已經廣泛的應用於生物化學研究，但是它們有幾個不同點。首先，非變性凝膠電泳解析度比 較低，從而限制了它的使用。其次，在收集活性蛋白質和研究蛋白質的催化性能的試驗中， 因為蛋白質都被固定到聚丙烯醯胺凝膠中，所以蛋白質在凝膠中的催化效率不如在溶液狀 態下高。第三，因為許多蛋白質在通常條件下是以聚合體的形式存在，所以在非變性凝膠電 泳中很難評價單個蛋白質的性能。換句話說，SDS-PAGE提供了一個更好的純化蛋白質的方 法，但是如果需要觀察離散的蛋白條帶，電泳過程仍然僅限於部分純化蛋白質的製備。如果 從微生物、植物或動物中製備一種蛋白質，那麼樣品中就有成千上萬種蛋白質，所以幾乎不 可能將如此多的蛋白質通過SDS-PAGE分離成離散的條帶並純化出來。此外，在SDS-PAGE 中蛋白質樣品的處理第一步通常是使蛋白質變性。樣品的處理過程通常是添加高濃度的還 原劑和去汙劑，並在l〇〇°C下水浴5分鐘。大多數蛋白質在這些條件下會變性，這樣會使我 們感興趣的蛋白質的功能鑑定變的非常困難。因此非變性凝膠電泳和SDS-PAGE都不適合 從蛋白質混合物中直接對蛋白質進行純化和功能鑑定。
[0003] 二維凝膠電泳（Two Dimensional Gel Electrophoresis, 2-DE)起源於上世紀 70 年代。在二維凝膠電泳中，蛋白質從兩個維度進行分離。在第一個維度蛋白質按照其等電點 分離。蛋白質混合物在電場中被施加一個pH梯度，蛋白質移動到與它們電荷相符的位置， 此處它們的電荷為零(等電點);在第二個維度，蛋白質按照它們的分子量進行分離。通常的 一維SDS-PAGE的過程與此相似。因為第一維度和第二維度的分離參數彼此不同，二維電泳 相對於一維電泳在分離蛋白質方面有較高的解析度。雖然利用二維電泳技術不能從細胞粗 提液中分離所有蛋白質，但是二維電泳已經是眾所周知的最有效、最簡單的分離技術。經過 多年的改進，二維電泳已經發展成為一個在分析複雜生物系統方面強有力的工具，尤其是 當每個凝膠的二維電泳的解析度超過10000種蛋白質時它的優勢更為明顯。二維電泳另一 個主要的進步是固定化PH梯度凝膠的發明，這個固定化pH梯度凝膠提供了一種高解析度 的分離方法，更重要的是固定化pH梯度凝膠具有高度可重複性。當前二維電泳分離的蛋白 質可以通過微量測序、質譜或者二者結合的方式對蛋白質進行鑑定。二維電泳在生命科學 研究中的重要性表現為以下幾個方面。首先，它提供了一個在確定的生理階段和條件下的 生物體相對完整的生物化學圖像，特別是基因表達相對比較高的蛋白質都能在二維電泳中 進行分析。這在系統生物學研究中非常有用，因為我們知道基因表達和蛋白質表達沒有明 顯的關聯，而蛋白質的表達更能反映生物體內的生物化學狀態。產生這種基因表達和蛋白 質表達沒有明顯關聯現象的原因是複雜的，但其中有許多明顯的原因如mRNA轉錄、個體基 因啟動子的強度和蛋白質合成的相對穩定性等。其次，二維電泳有助於對蛋白質翻譯後修 飾的系統研究。蛋白質的修飾是對生物體基因轉錄調控的補充，而且這些蛋白質是直接參 與保證生物體正確運轉的體內組分。
[0004] "蛋白質組學"這個詞表示對基因組表達的所有蛋白質的系統研究，因此蛋白質組 學是系統研究生物體蛋白質的科學。一個生物體只有一個基因組，但是可能有很多種蛋白 質組，因為基因組在不同條件下表達的蛋白質數量和種類不同。在蛋白質組學的研究中，二 維電泳是一個非常重要的工具。典型的蛋白質組學研究包括從生物樣本中進行蛋白質的提 取，通過二維電泳分離展示蛋白質組，通過質譜、順序測定或二者聯用來對感興趣的蛋白質 進行系統研究。從生物化學的觀點來看，目前應用於蛋白質組學研究的二維電泳技術仍然 不能滿足功能研究的要求，也就是現在的二維電泳技術還不可能監測到構成蛋白質組的每 種蛋白質的生物活性。
[0005] 二維電泳後蛋白質研究的主要挑戰之一是從聚丙烯醯胺凝膠中獲取蛋白質。因為 直接從聚丙烯醯胺凝膠中測定蛋白質催化活性效率很低，所以從聚丙烯醯胺凝膠中獲取蛋 白質特別重要。據記載超聲波法被用於從聚丙烯醯胺凝膠中回收蛋白質。但是沒有報導指 出可以用超聲波法從二維電泳凝膠中直接回收活性蛋白質。
[0006] 從二維電泳凝膠中獲取蛋白質廣泛使用的方法是電洗脫法（Electroelution)。一 種Bio-Rad製造的叫做Rotofor Cell的裝置可以從等電聚焦位置獲得活性蛋白質。這個裝 置使用等電聚焦法將蛋白質分離到不同的位置，然後進行回收。這個裝置的缺點之一是只 能應用於一維電泳凝膠，也就是等電點凝膠，相對於二維電泳凝膠解析度將大大降低。這個 裝置的另一個缺點是用試管來收集洗脫液，因為收集的液體體積比較大，這使裝置的分辨 率變的非常有限。目前市場上電洗脫的第二種裝置是Bio-Rad生產的Whole Gel Eluter。 同樣的，這個裝置只能應用於一維電泳，裝置的解析度也不夠好，所用試管數量也非常有 限。第三種裝置是Biometra公司生產的Blotelutor電洗脫系統。這個系統用半乾法從 二維電泳凝膠中將蛋白質轉移到576孔平板中，該平板用透析膜和6毫米厚的12. 5%的聚 丙烯醯胺凝膠組合在平板的底部，沒有數據來證明這個裝置的回收效率。該平板只有60% 的回收區域是有效的，這意味著在這個回收過程中二維電泳凝膠中40%的蛋白質沒有被回 收。更重要的是在一個樣品中存在成百乃至上千種蛋白質，平板的解析度無法為從粗提液 中獲得純的蛋白質提供足夠的機會，而蛋白質組學研究和蛋白質純化的二維電泳的核心又 是高解析度。這個裝置的另一個問題是透析膜和聚丙烯醯胺凝膠的平板底部的密封，在此 裝置用於蛋白質轉移和回收過程中蛋白質是否擴散不清楚，假如研究需要的是純化的蛋白 質，這些參數就很要緊。這個裝置最後的問題是不能適用於比較複雜的蛋白質混合物，如果 有必要從樣本中分離出幾百種蛋白質並測試樣品中每一種蛋白質的生物活性，得到純化的 蛋白質將非常重要，生產商已經終止了這類裝置的生產。


【發明內容】

[0007] 本發明的目的是提供一種蛋白質分離純化的方法，能在保持蛋白質活性的同時實 現二維凝膠電泳的高解析度；同時提供一種蛋白質分離純化的回收裝置，能將複雜的蛋白 質混合物分離成單一的蛋白質。
[0008] 本發明所述的蛋白質分離純化的方法，包括等電聚焦電泳和SDS -聚丙烯醯胺凝 膠電泳，在等電聚焦電泳中不使用還原劑，在SDS -聚丙烯醯胺凝膠電泳中凝膠用含有SDS 的緩衝液處理，SDS的質量分數為0-1%，優選SDS的質量分數為0. 1%。
[0009] 本發明所述的蛋白質分離純化的方法，具體步驟如下：
[0010] (1)等電聚焦電泳：將蛋白質樣品加到等電聚焦條帶中，等電聚焦過夜，凝膠不使 用還原劑處理；
[0011] (2) SDS -聚丙烯醯胺凝膠電泳：用含有SDS的緩衝液處理步驟（1)所得凝膠，將 處理後的凝膠放在濃縮膠上，蛋白質在濃縮膠上被濃縮後進入分離膠進行分離；
[0012] (3)先將含有分離的蛋白質的凝膠置於蛋白質分離純化的回收裝置上，再將蛋白 質分離純化的回收裝置放在蛋白質轉移裝置裡進行蛋白質的轉移，最後將蛋白質轉移到分 析平板中進行分析。
[0013] 所述的還原劑是β -巰基乙醇或二硫蘇糖醇（DTT)中的一種。
[0014] 所述的含有SDS的緩衝液為每升溶液含有：
[0015] Tris 3. 03 克；
[0016] Glycine 14. 4 克；
[0017] SDS 0-10 克；
[0018] 剩餘雙蒸水補足。
[0019] 所述的含有SDS的緩衝液優選為每升溶液含有：
[0020] Tris 3. 03 克；
[0021] Glycine 14. 4 克；
[0022] SDS 1 克；
[0023] 剩餘雙蒸水補足。
[0024] 所述的濃縮膠中聚丙烯醯胺濃度為6%，配方如下：
[0025]

【權利要求】
1. 一種蛋白質分離純化的方法，包括等電聚焦電泳和SDS -聚丙烯醯胺凝膠電泳，其 特徵在於在等電聚焦電泳中不使用還原劑。
2. 根據權利要求1所述的蛋白質分離純化的方法，其特徵在於在SDS -聚丙烯醯胺凝 膠電泳中凝膠用含有SDS的緩衝液處理，SDS的質量分數為0-1%，優選SDS的質量分數為 0· 1%。
3. -種權利要求1所述的蛋白質分離純化的回收裝置，其特徵在於包括蛋白質洗脫板 和分子半透膜，蛋白質洗脫板底部通過噴膠粘有分子半透膜。
4. 根據權利要求3所述的蛋白質分離純化的回收裝置，其特徵在於所述的蛋白質洗脫 板的長度為50-350毫米，寬度為40-300毫米，厚度為1-8毫米。
5. 根據權利要求4所述的蛋白質分離純化的回收裝置，其特徵在於所述的蛋白質洗脫 板上有96-10000個孔，優選1536個孔。
6. 根據權利要求5所述的蛋白質分離純化的回收裝置，其特徵在於所述的蛋白質洗脫 板由4塊24-2500孔微平板組成，優選由4塊384孔微平板組成。
7. 根據權利要求5所述的蛋白質分離純化的回收裝置，其特徵在於所述的孔為正方形 孔、圓形孔或長方形孔中的一種，優選正方形孔；正方形孔的邊長為2-8毫米，圓形孔的直 徑為2-8毫米，長方形孔的長和寬分別為2-8毫米，孔與孔的間距為0. 2-0. 9毫米。
8. 根據權利要求3所述的蛋白質分離純化的回收裝置，其特徵在於所述的蛋白質洗脫 板的材料為聚丙烯、聚乙烯或聚苯乙烯中的一種。
9. 根據權利要求3所述的蛋白質分離純化的回收裝置的方法，其特徵在於所述的分子 半透膜為聚醯胺半透膜、乙酸纖維素半透膜、聚碸樹脂半透膜或聚醚碸樹脂半透膜中的一 種。
10. 根據權利要求3所述的蛋白質分離純化的回收裝置，其特徵在於所述的噴膠為美 國 3M 公司的 Super77、Super74、Super80 或 Super90 中的一種。
【文檔編號】C07K1/28GK104292296SQ201310296231
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2013年7月15日 優先權日:2013年7月15日
【發明者】王星 申請人:淄博雲橋生物技術有限公司