一種刺槐的離體培養和植株再生的方法

2023-10-28 22:59:32

專利名稱：一種刺槐的離體培養和植株再生的方法
技術領域：
本發明涉及一種植物組織培養的方法，特別涉及刺槐離體培養和植株再生的方法，屬於刺槐的組織培養領域。
背景技術：
刺槐(Robinia pseudoacacia L.)又稱洋槐，屬於豆科(Leguminosae)蝶形花亞科刺槐屬(Robinia L.)，落葉喬木，原產於美國，天然分布於美國東部阿柏拉契山脈 (Appalachian. Mt.)和奧薩克山脈(Ozank. Mt. ),20世紀初期引入我國，引進後得到迅速擴大栽植，是黃河中下遊、淮河流域、海河流域、長江下遊諸省的主要用材林、薪炭林、水土保持林、海提及河提防護林，僅在河北、河南、山東和山西等6省市就有40億株。它生長速度快，是重要的速生用材樹種，其木材材質堅硬、抗壓強度大、具較強的耐旱性、防腐力強。刺槐根系長有大量根瘤，可以通過生物固氮增加土壤肥力，在維持生態平衡、提高林分質量等方面發揮重要作用。刺槐的葉片含有粗蛋白，是優質廉價的家畜飼料資源。刺槐花營養豐富，雖花期較短但花量可觀，除直接使用外，還可生產花蜜、提取香料等。中國對刺槐的育種研究始於20世紀70年代，至今已取得很多成就，但仍不能滿足林業生產的需要。體細胞胚再生途徑是對樹木進行繁育和遺傳改良的重要平臺，也是實現基因轉化的常用再生體系。體胚發生技術具有繁殖數量多、速度快、不受親緣關係限制、一旦形成結構完整的體細胞胚一般都可直接萌發形成小植株等特點，是穩定高效的植物再生體系。此外，體細胞胚胎由單細胞起源，發育程序與合子胚相似，可作為胚胎學研究的模式系統，對細胞全能性表達過程和細胞分化機理等理論問題的研究也具有重要意義。Laine E 和Dumet D成功將加勒比松和油棕胚性愈傷組織在超低溫下保存並保持了體胚發生潛力， 解凍後仍能繼續培養形成植株，這為挽救瀕危植物提供了可能。刺槐的離體培養研究從20 世紀50年代末開始，80年代以後達到高潮。到目前為止，刺槐通過形成層培養、莖培養、葉片培養、未授粉子房的培養等已獲得了完整的植株，但這些研究都集中在器官發生途徑，通過體細胞胚發生途徑的研究還很少。例如，紅豔以刺槐成熟種子的子葉為外植體，對刺槐體胚培養和誘導不定芽進行了研究，但體細胞胚發生率最高也僅有36. 7 %。大量研究表明，外植體的發育時期是影響體細胞胚發生的關鍵因素，未成熟合子胚因其細胞全能性高、脫分化容易，在誘導體細胞胚發生時具有顯著優勢。大多數植物離體培養普遍採用未成熟合子胚外植體，但過於幼嫩或過度成熟的合子胚的體胚誘導率並不理想。在整個合子胚的發育過程中，只有一個較短的階段具有很強的體胚發生潛能。目前，研究合子胚發育階段對體細胞胚誘導影響的研究很多，但就刺槐而言，由於刺槐的體細胞胚培養比較困難，表現為體胚誘導率低、畸形胚數量多、體胚質量不高等，制約了其遺傳改良的程度，也阻礙了優良無性系的高效繁殖和快速推廣。迄今為止，國內外對刺槐的體細胞胚培養的研究相對較少，國內尚未見相關報導，國外僅Merkle et al.和Arrillaga et al.發表了這方面的研究結果。其中，Merkle等人從開花後第1周開始，每隔一周從3棵刺槐樹上選取未成熟合子胚為外植體，以MS培養基為基本培養基，研究了外植體胚齡對體胚誘導的影響，僅從開花後4周的一粒未成熟合子胚上觀察到體細胞胚發生，其體細胞胚的誘導率低；Arrillaga等人在Merkle的研究基礎上提高了體細胞胚的誘導率，以FM培養基為基本培養基，採用開花後1-4周的未成熟合子胚為外植體，進行體細胞胚誘導培養，試驗結果表明開花後2-3周的外植體體胚誘導率最高，僅達到12%。上述研究均是以開花後1-4天的未成熟合子胚為外植體進行誘導培養，其誘導率低，最高誘導率僅為12%，難以滿足刺槐繁殖和育種的需要，因此，建立刺槐高效體胚發生體系勢在必行。

發明內容
本發明的首要目的是針對上述現有技術存在的問題提供一種刺槐體細胞胚誘導率高、萌發率高及穩定的刺槐離體培養再生體系的建立方法。該方法可以在較短時間內形成大量優良的刺槐試管壯苗，可進行規模化、工廠化生產，可用於刺槐轉化體系研究，也可以用於分子育種研究。為實現上述目的，本發明一方面提供一種刺槐繁殖方法，包括如下順序進行的步驟1)採集刺槐莢果；2)將刺槐莢果進行表面滅菌處理後取出其合子胚，獲得無菌合子胚；3)將無菌的合子胚接種到體細胞胚誘導培養基中進行體細胞胚誘導培養，誘導生成原胚；4)將原胚接種於體細胞胚成熟培養基中進行體細胞胚的成熟培養，獲得成熟的體細胞胚；5)將成熟的體細胞胚接種於萌發培養基上進行萌發培養，獲得體胚苗；6)將體胚苗接種於壯苗培養基上進行壯苗培養，促進體胚苗的生長，獲得試管壯苗；7)將試管壯苗進行煉苗、移栽，即得。刺槐的外植體胚齡對愈傷組織的誘導率影響顯著，過嫩或過熟的幼胚均不能得到理想的體細胞胚(即原胚)誘導結果。本發明通過大量的實驗發現，處於開花後第25天至第75天這一時間段內的刺槐莢果作為外植體，其體細胞胚誘導效果相比於其它時間段內的莢果有明顯的提高；進一步的實驗發現，採集處於刺槐開花後第45天至第65天這一時間段內的莢果作為外植體的繁殖效果有進一步的提高，採用處於刺槐開花後第55天至第65 天這一時間段內的莢果作為外植體的繁殖效果得到了更進一步的提高，採用處於開花後第 55天的刺槐莢果作為外植體取得了最好的繁殖效果採集刺槐開花後第55天的莢果中的未成熟合子胚在所述誘導培養基上的體細胞胚(原胚)誘導率均高於其它時期的外植體， 其體細胞胚誘導率為92.4%，體胚萌發率為82. 48-100%，均明顯高於其它時段的外植體， 所以本發明最優選採集處於開花後第陽天的刺槐莢果作為外植體。其中，步驟2)中所述滅菌處理包括如下順序進行的步驟A)將採集的刺槐莢果用無菌水洗淨後，用酒精浸泡莢果後，用無菌水衝洗乾淨；B)用HgCl2溶液浸泡莢果，用無菌水衝洗乾淨；C)吸乾莢果表面水分後從莢果中取出合子胚，即得。
特別是，步驟A)中所述的酒精的體積百分比濃度為75%;浸泡時間為30s ；無菌水衝洗3-5次。特別是，步驟B)中所述HgCl2溶液的質量百分比濃度為0. ；浸泡時間為 3-7min，優選為5min ；無菌水衝洗5_6次。其中，步驟3)中所述體細胞胚誘導培養基是MS基本培養基+2-(N-嗎啡啉)乙磺酸(MEQ 500mg/L+穀氨醯胺250mg/L+水解酪蛋白500mg/L+萘乙酸0. 1-1. Omg/L+6-苄氨基腺嘌呤0-1. Omg/L+蔗糖30g/L+瓊脂6g/L，pH值為5. 8。特別是，體細胞胚誘導培養基優選為MS基本培養基+MES 500mg/L+穀氨醯胺 250mg/L+水解酪蛋白500mg/L+萘乙酸0. 1-1. Omg/L+6-苄氨基腺嘌呤0. 1-1. Omg/L+蔗糖30g/L+瓊脂6g/L，pH值為5. 8 ；進一步優選為MS基本培養基+MES 500mg/L+穀氨醯胺 250mg/L+水解酪蛋白500mg/L+萘乙酸0. 5mg/L+6-苄氨基腺嘌呤0. 5mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂 6g/L，pH 值為 5.8。特別是，將從開花後第4-11周的莢果中獲得的未成熟合子胚整體接種到所述體細胞胚誘導培養基中進行所述的體細胞胚誘導培養。特別是，步驟幻中所述體細胞胚誘導培養在以下條件下進行黑暗條件，培養溫度為 26士2°C。尤其是，體細胞胚誘導培養過程中相對溼度為70-75%。其中，步驟4)中所述的體細胞胚成熟培養基為MS基本培養基+水解酪蛋白 500mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂6g/L，pH值為5. 8 ；步驟5)中所述的萌發培養基為MS基本培養基+蔗糖30g/L+瓊脂6g/L，pH值為5. 8 ；步驟6)中所述的壯苗培養基為MS基本培養基 +IBA 0. 2mg/L+ 蔗糖 30g/L+ 瓊脂 6g/L，pH 值為 5. 8。特別是，步驟4)中所述體細胞胚成熟培養在以下條件下進行培養溫度為 ^±2°C，光照強度為1500-20001UX，光照周期為14-16小時光照/8-10小時黑暗。尤其是，體細胞胚成熟培養過程中相對溼度為70-75%。特別是，步驟幻中所述萌發培養在以下條件下進行培養溫度為^±2°C，光照強度為1500-20001UX，光照周期為14-16小時光照/8-10小時黑暗。尤其是，萌發培養過程中相對溼度為70-75%。特別是，步驟6)中所述壯苗培養在以下條件下進行培養溫度為^±2°C，光照強度為1500-20001UX，光照周期為14-16小時光照/8-10小時黑暗。尤其是，壯苗培養過程中相對溼度為70-75%。其中，步驟7)中所述的煉苗、移栽包括如下順序進行的步驟打開培養瓶的瓶蓋， 在移栽室中煉苗1天；然後將試管壯苗取出，用自來水洗淨試管壯苗根部殘留的瓊脂培養基，移栽到刺槐無土栽培基質中進行移栽培養。特別是，還包括將移栽培養5-6周後植株再定植於大田。特別是，還包括將試管壯苗放置於遮光50%的自然光光照強度下培養5-10天後再打開培養瓶瓶蓋。特別是，所述刺槐無土栽培基質由珍珠巖、蛭石組成，其中珍珠巖與蛭石的體積之比為1 1。特別是，移栽培養是自然光光照條件下，培養5-6周
尤其是，移栽培養溫度為25士5°C、相對溼度為56-90%。本發明的刺槐的繁殖方法具有以下優點1、本發明利用刺槐未成熟合子胚進行離體快速繁殖，每個培養階段所採用的基本培養基的都是MS基本培養基，具有無機鹽濃度高，特別是硝酸鹽、鉀和銨的含量高，可以為組織生長提供所需礦質營養和促進體細胞胚誘導、成熟和萌發生長。2、本發明的繁殖方法中刺槐繁殖效率高，培養基中添加植物生長調節劑利於體細胞胚直接從外植體上進行誘導、增殖，成熟和萌發，本發明中使用的刺槐培養基中營養物質組成合理，用量和配比適宜，培育結果重複性高，再生體系穩定，體細胞胚的誘導率 63. 10-92. 40%，每個外植體平均體細胞胚數達到5. 4-10. 8個。3、本發明方法培育的刺槐再生植株生長健壯、繁殖係數高，體細胞胚萌發率高，達到72-100%;移栽成活率高，達到100%，是工廠化大規模生產刺槐植株的簡便、快捷的技術體系。


圖1是刺槐未成熟合子胚的體細胞胚誘導培養獲得的原胚；圖2是刺槐原胚成熟培養得到的成熟體細胞胚；圖3是刺槐成熟體細胞胚薄層切片的顯微鏡觀測照片；圖4是刺槐成熟體細胞胚萌發培養得到的體胚苗；圖5是刺槐體胚苗壯苗培養得到的試管壯苗；圖6是移栽於容器的刺槐幼苗。
具體實施例方式下面結合具體實施例來進一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是範例性的，並不對本發明的範圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發明的精神和範圍下可以對本發明技術方案的細節和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發明的保護範圍內。實施例1一、試驗材料1、本發明以北京市延慶米家堡苗圃生長良好的二倍體刺槐實生苗群體為取材資源，選取10棵生長良好、幹型較直、結實率高的母樹(各株之間的間隔大於50米)，在2010 年6月到9月間，採集開花後第4-12周的刺槐不同發育階段的合子胚作為外植體試驗材料，每間隔10天採集一次，每次採集500個莢果，即採集開花後25、35、45、55、65、75天的莢果，每次採集500個莢果，將當天採集的莢果在冰盒中低溫保存帶回實驗室，之後放在4°C 的冰箱裡冷藏備用。2、植物生長調節劑本發明中所使用的植物生長調節物質採用國產萘乙酸(NAA)、6_苄氨基腺嘌呤 (6-BA)。3、培養基的配製(1) "MS基本培養基」的組成或配製方法；
表 IMS 培養基(Murashige and Skoog, 1962)
權利要求
1.一種刺槐的離體培養和植株再生的方法，包括如下順序進行的步驟1)採集刺槐莢果；2)將刺槐莢果進行表面滅菌後取出其合子胚，獲得無菌合子胚；3)將無菌合子胚接種到體細胞胚誘導培養基中進行體細胞胚誘導培養，誘導生成原胚；4)將原胚接種於體細胞胚成熟培養基中進行體細胞胚的成熟培養，獲得成熟體細胞胚；5)將成熟的體細胞胚接種於萌發培養基上進行萌發培養，獲得體胚苗；6)將體胚苗接種於壯苗培養基上進行壯苗培養，促進體胚苗的生長，獲得試管壯苗；7)將試管壯苗進行煉苗、移栽，即得。
2.如權利要求1所述的方法，其特徵是所述的刺槐莢果是處於刺槐開花後第25天至第 75天這一時間段內的刺槐莢果，優選為處於刺槐開花後第45天至第65天這一時間段內的刺槐莢果，更優選為處於刺槐開花後第55天至第65天這一時間段內的刺槐莢果，最優選為處於刺槐開花後第陽天的刺槐莢果。
3.如權利要求1所述的方法，其特徵是步驟⑴中所述體細胞胚誘導培養基是MS基本培養基+2- (N-嗎啡啉)乙磺酸500mg/L+穀氨醯胺250mg/L+水解酪蛋白500mg/L+萘乙酸 0. 1-1. Omg/L+6-苄氨基腺嘌呤 0-1. Omg/L+ 蔗糖 30g/L+ 瓊脂 6g/L，pH 值為 5. 8。
4.如權利要求1所述的方法，其特徵是步驟幻中所述體細胞胚誘導培養在以下條件下進行黑暗條件下，培養溫度為26士2°C。
5.如權利要求1所述的方法，其特徵是步驟4)中所述的體細胞胚成熟培養基為MS基本培養基+水解酪蛋白500mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂6g/L，pH值為5. 8。
6.如權利要求1所述的方法，其特徵是步驟4)中所述體細胞胚成熟培養在以下條件下進行培養溫度為26士 2°C，光照強度為1500-20001uX，光照周期為14-16小時光照/8-10 小時黑暗。
7.如權利要求1所述的方法，其特徵是步驟幻中所述的萌發培養基為MS基本培養基 +蔗糖30g/L+瓊脂6g/L，pH值為5. 8。
8.如權利要求1所述的方法，其特徵是步驟幻中所述萌發培養在以下條件下進行培養溫度為^±2°C，光照強度為1500-20001UX，光照周期為14-16小時光照/8-10小時黑暗。
9.如權利要求1所述的方法，其特徵是步驟6)中所述的壯苗培養基為MS基本培養基 +IBAO. 2mg/L+ 蔗糖 30g/L+ 瓊脂 6g/L，pH 值為 5. 8。
10.如權利要求1所述的方法，其特徵是步驟幻中所述滅菌處理包括如下順序進行的步驟A)將採集的刺槐莢果用無菌水洗淨後，用酒精浸泡莢果後，用無菌水衝洗乾淨；B)用HgCl2溶液浸泡莢果，用無菌水衝洗乾淨；C)吸乾莢果表面水分後從莢果中取出未成熟的種子，即得；步驟7)中所述的煉苗移栽包括如下順序進行的步驟打開培養瓶的瓶蓋，在移栽室中煉苗1天；然後將試管壯苗取出，用自來水洗淨試管壯苗根部殘留的瓊脂培養基，移栽到刺槐無土栽培基質中進行移栽培養。
全文摘要
本發明公開了一種刺槐的離體培養和植株再生的方法，以不同胚齡的合子胚為外植體，以MS基本培養基+MES 500mg/L+穀氨醯胺250mg/L+水解酪蛋白500mg/L+萘乙酸0.1-1.0mg/L+6-苄氨基腺嘌呤0-1.0mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂6g/L為體細胞胚誘導培養基，直接誘導獲得刺槐體細胞原胚，然後進行體細胞胚的成熟、萌發、壯苗培養獲得再生植株。本發明方法中體細胞胚的誘導率高，每個外植體平均體細胞胚數達到5.4-10.8個；體細胞胚萌發率、移栽成活率高，可以在短期內形成大量優良的刺槐再生植株，是工廠化大規模生產刺槐植株的簡便、快捷的技術體系。
文檔編號A01H4/00GK102499087SQ20111034049
公開日2012年6月20日 申請日期2011年11月1日 優先權日2011年11月1日
發明者習洋, 孫宇涵, 孫鵬, 戴麗, 李雲, 李允菲, 王歡, 胡瑞陽, 袁存權 申請人:北京林業大學