利用igfbp片段確定心血管事件的風險的方法

2023-10-28 09:28:07 2

利用igfbp片段確定心血管事件的風險的方法【專利摘要】本發明描述了一種用於確定未來的嚴重不良心血管事件的風險的方法，包括檢測患者血液中IGFBP-4或IGFBP-5(胰島素樣生長因子結合蛋白4或胰島素樣生長因子結合蛋白5)的蛋白水解片段。本發明提供適合於特異性測量IGFBPs的蛋白水解片段的抗體和免疫測定法。在本發明中，提出將IGFBP片段作為嚴重不良心血管事件(MACE)的風險預測的血液生物標誌物。【專利說明】利用IGFBP片段確定心血管事件的風險的方法發明領域[0001]本發明描述了確定未來的嚴重不良心血管事件的風險的方法，包括檢測患者血液中的IGFBP-4或IGFBP-5(胰島素樣生長因子結合蛋白4或胰島素樣生長因子結合蛋白5)的蛋白水解片段。本發明提供適用於IGFBP的蛋白水解片段的特異性測量的抗體和免疫測定法。在本發明中，提出使用IGFBP片段作為嚴重不良心血管事件(MACE)的風險預測的血液生物標誌物。[0002]發明背景[0003]雖然心血管疾病的治療已經獲得了長足進步，但這種疾病仍然是發達國家中導致死亡的主要原因。經典的心血管風險因子一包括高血壓、糖尿病和吸菸一的評估歷來在疾病預防中扮演核心角色。然而，許多患有冠心病(心臟供血血管的狹窄化)的個體只有一種，或者沒有經典風險因子。因此，需要新的生物標誌物來強化從傳統指示物獲得的信息和揭示疾病機理。[0004]對於現代體外診斷學而言，尋找用於未來MACE風險評估的可靠的生物標誌物似乎是一項意義顯著的任務。MACE包括急性冠狀動脈症候群(acutecoronarysyndrome(ACS))、不穩定型心絞痛(unstableanginapectoris)、心肌梗死(myocardialinfarction(MI))包括ST抬高MI和非ST抬高MI(ST-elevationMIandnon-ST-elevatedMI)、以及某些其他事件。雖然文獻中描述了範圍廣泛的一系列供用於MACE風險評估的候選者，但它們之中沒有一個像心臟肌鈣蛋白I(cTnl)之於心肌梗死或ΝΤ-ρι.οΒΝΡ之於心力衰竭診斷那樣成為金標準生物標誌物。臨床實踐中使用的MACE風險評估生物標誌物的主要不足之處在於心血管特異性不足，被分析物的血液水平與逼近的心血管併發症之間的關係不明顯，以及，由此導致的預後價值有限。迫切需要能夠在急救部門中用於對具有急性胸痛而沒有急性心肌梗死的明顯徵象(肌鈣蛋白測試陰性，心電圖上沒有ST抬高)的患者進行MACE風險評估的生物標誌物。這樣的生物標誌物也可以開啟對具有經典心血管風險因子的患者群進行篩查，以鑑定具有短期心臟事件的高風險的亞群的子群體的可能性。[0005]對動脈粥樣硬化斑塊失穩(atheroscleroticplaquesdestabilization)相關的炎症性生物標誌物的研究已經開創了MACE風險評估的新方向。在過去十年，人們對一大群候選生物標誌物(高敏感性C反應蛋白(hsCRP)、脂蛋白相關的磷脂酶A2(Lp-PLA2)、基質金屬蛋白酶-9，單核細胞趨化蛋白-1，可溶性CD40L、髓過氧化物酶，等等)業已進行了廣泛的研究。已經積累了足夠的出版物證據支持其中兩種——hsCRP和Lp-PLA2在臨床實踐中的應用。[0006]在本發明中，提出將IGFBP-4和IGFBP-5的片段作為MACE預測的生物學標誌物。特異性蛋白水解是IGFBP-4和IGFBP-5功能的一種重要的調節機制。妊娠相關血漿蛋白-A(PAPP-A)在文獻中被描述為一種酶，其負責IGFBP-4和IGFBP-5蛋白水解和隨後的活性IGF的釋放。雖然沒有證明動脈粥樣硬化斑塊內的PAPP-A的蛋白水解活性，但人們推測在動脈粥樣硬化斑塊內，由活化的平滑肌細胞表達的PAPP-A可增加IGF的生物利用度。我們提議使用IGFBP-4和IGFBP-5的蛋白水解片段作為獨立的血液生物標誌物，可以使用它們預測MACE。【
發明內容】[0007]本發明描述一種確定未來的嚴重不良心血管事件的風險的方法，其包括檢測患者血液中IGFBP-4或IGFBP-5(胰島素樣生長因子結合蛋白4或5)的蛋白水解片段。利用該方法能夠根據測得的IGFBP-4N端片段或IGFBP-4C端片段，以及IGFBP-5N端片段或IGFBP-5C端片段的值來將個體分類為不同的風險組。在該方法中，將IGFBP-4N端片段或IGFBP-4C端片段，及IGFBP-5N端片段或IGFBP-5C端片段的增加與嚴重不良心血管事件的增高的風險關聯。本發明提供適用於特異性測量IGFBP-4的蛋白水解片段的抗體和免疫測定法，以及適用於特異性測量IGFBP-5的N末端片段的抗體和免疫測定法。對在IGFBP-4或IGFBP-5的蛋白水解切割過程中產生的新蛋白水解表位(蛋白水解性新表位)特異性的抗體適用於對於人血液中IGFBP-4的N端和C端片段、以及IGFBP-5的N端片段的精確免疫檢測，與全長IGFBP-4和IGFBP-5分子的存在無關。本發明還提供一種基於分別測量全長IGFBP-4、以及全長IGFBP-4和IGFBP-4片段的總量，來區別檢測IGFBP-4的方法。進一步計算總IGFBP-4與全長IGFBP-4的差作為IGFBP-4片段的濃度。[0008]附圖簡述[0009]圖1.對所獲得的用於小鼠免疫和測試的合成肽和抗原的描述。[0010]免疫原:1.在NSO細胞中產生的全長IGFBP-4.[0011]2.1GFBP-4-肽#1，與BSA綴合。[0012]2.1GFBP肽#2，與BSA綴合。[0013]圖2.選定的單克隆抗體的特異性的圖示。[0014]圖3A和3B.對NT-1GFBP-4蛋白水解片段(A.免疫測定法IBP3-1BP144)和CT-1GFBP-4蛋白水解片段(B.免疫測定法IBP182-1BP163)特異性的夾心免疫測定法的校正曲線，以及它們與全長IGFBP-4的交叉反應。[0015]圖4A和4B.對全長IGFBP-4特異性的夾心免疫測定法(A,IBP185-1BP180和B,IBP185-1BP154)的校正曲線，以及它們與IGFBP-4片段的交叉反應。[0016]圖5A和5B.對總IGFBP-4特異性的夾心免疫測定法(其識別IGFBP-4的蛋白水解片段和全長IGFBP-4)的校正曲線。這些測定法對(A)IGFBP-4的C端區域(IBP185-1BP190)和(B)IGFBP-4的N端區域(IBP17-1BP180)特異性；Ags—抗原。[0017]圖6.1GFBP-4的蛋白水解片段的Western印跡檢測，其展現PAPP-A蛋白酶活性。家兔抗IGFBP-4多克隆抗體用於免疫染色。[0018]IGFBP-4(200ng每條泳道)用下述處理:[0019]泳道1，重組PAPP-A;[0020]泳道2，動脈粥樣硬化組織PAPP-A;[0021]泳道3，無PAPP-A;[0022]泳道4，分子量標準品；顯示的是kDa值。[0023]圖7.使用夾心免疫測定法NT-1GFBP-4和CT-1GFBP-4(分別為IBP3-1BP144和IBP182-1BP163)測量健康供體和確診的AMI患者的血漿樣品中IGFBP-4片段的測量。IGFBP-4片段在ACS(急性心肌梗死)患者血漿中的水平(平均值土SD)比健康供體血漿中高5.I倍(就NT-1GFBP-4而言(ρ〈0.0OOl))或高2.7倍(就CT-1GFBP-4而言(p〈0.0001))。[0024]圖8Α和8Β.分別用夾心免疫測定法ΙΒΡ3-ΙΒΡ144和ΒΡ182-ΙΒΡ163測定的NT-1GFBP-4和CT-1GFBP-4的ROC曲線。A—MACE預測，B—MACEACD預測。[0025]圖9Α和9Β.A-通過差別免疫測定法(通過ΙΒΡ17-ΙΒΡ180測得的總IGFBP-4與通過ΙΒΡ185-ΙΒΡ154測得的全長IGFBP-4之間的差異)測得的NT-1GFBP-4蛋白水解片段的ROC曲線，B-通過差別免疫測定法(通過ΙΒΡ185-ΙΒΡ190測得的總IGFBP-4與通過ΙΒΡ185-ΙΒΡ154測得的全長IGFBP-4之間的差異)測得的CT-1GFBP-4蛋白水解片段的ROC曲線。[0026]圖10.通過十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳和考馬斯藍R-250染色測定的PAPP-A依賴的IGFBP-5切割。[0027]泳道I，沒有PAPP-A的IGFBP-5(Iyg每泳道);[0028]泳道2，用重組PAPP-A特異性切割後的IGFBP-5；[0029]泳道3，重組NT-1GFBP-5(Iμg)；[0030]泳道4，重組CT-1GFBP-5(Iμg)；[0031]泳道5,分子量標準；以kDa顯示。[0032]圖1lA和11B.對NT_IGFBP_5蛋白水解片段特異性的夾心免疫測定法的校正曲線(A,IBPF15-1BPF72；B,IBPF16-1BPF72)，以及它們與全長IGFBP-5的交叉反應。lpmol/ml的抗原濃度對應於16.lng/ml的NT-1GFBP-5或28.6ng/ml的全長IGFBP-5。[0033]圖12.藍線-通過夾心免疫測定法IBPF15-1BPF72測得的NT-1GFBP-5蛋白水解片段的ROC曲線，綠線-通過夾心免疫測定法IBPF16-1BPF72測得的NT-1GFBP-5蛋白水解片段的ROC曲線。[0034]發明詳述[0035]在為本發明進行的實驗中，NT-1GFBP-4和CT_IGFBP_4片段在急性心肌梗死患者的血漿中的水平分別比在健康供體血漿中高5.1倍和2.7倍。該初步臨床研究的結果為探索IGFBP-4片段用於MACE評估的價值開闢了可能。[0036]在前瞻性跟蹤臨床研究中評估了IGFBP-4蛋白水解片段和IGFBP-5N端片段的預後價值。將因急性胸痛和呼吸緊迫而收治到急救部門的連續(consecutive)患者包含到研究中。測量患者血漿中的IGFBP-4片段和IGFBP-5C端片段。在6個月的追蹤過程中觀察MACE的發生。結果，患者樣品中IGFBP-4的N端和C端片段、以及IGFBP-5的N端片段的提高的水平被與MACE風險的顯著增加關聯起來。[0037]IGFBP-4片段能夠滿足人們似乎尚未得到滿足的對能夠預測MACE短期風險的血液測定法的需求。[0038]在本發明中，所開發的夾心免疫測定方法的檢測抗體被用穩定的Eu3+螯合物標記。在各種其他實施方案中，可以用不同類型的標記物來標記檢測抗體，這些標記物能夠生成不同類型的信號，可以用多種多樣的標準程序，例如發光、化學發光、螢光、光吸收、放射性的檢測，或者通過顯微術、成像等，來可視化或者檢測這些信號。免疫測定法可以包括免疫組化、酶聯免疫吸附測定(ELISA)、Western印跡、濁度法、比濁法、免疫放射測定、切向流、免疫組織化學/免疫細胞化學、以及本領域技術人員知道的其他方法。[0039]在本發明中，顯示了PAPP-A的動脈粥樣硬化形式可以以與重組PAPP-A相同的效率切割IGFBP-4(實施例6)。因此，首次顯示了在人類斑塊中表達的PAPP-A的動脈粥樣硬化形式是能夠切割IGFBP-4的活性蛋白酶。[0040]免疫測定法可以用來確定樣品中某種生物標誌物的有無，以及樣品中某種生物標誌物的量。樣品中IGFBP-4蛋白水解片段的量可以通過與參照物或者標準物，例如完整的IGFBP-4或者已知在樣品中存在的另一種不同多肽，相比較(或者作為相對於參照物或者標準物的比例)來加以確定。樣品中IGFBP-4蛋白水解片段的量還可以通過與參照物或標準物，例如參照樣品或對照樣品中內源的、或重組或合成的IGFBP-4片段的量，進行比較來加以確定。因此，樣品中生物標誌物的量並不需要以絕對量定量，而是可以按照相對於參照或對照的相對量來量度。[0041]該發明的各種實施方案包括檢測患者血漿樣品中IGFBP-4的N端或C端片段，或者同時檢測N端和C端片段，用以評估發生ACS的風險。[0042]可以使用免疫測定法來確定樣品中生物標誌物的有無，以及樣品中生物標誌物的量。樣品中IGFBP-4蛋白水解片段的量可以通過對IGFBP-4蛋白水解片段，例如總IGFBP-4(全長IGFBP-4和IGFBP-4片段)的量與全長IGFBP-4的量的差，特異性的夾心免疫測定法來測定。本研究顯示了利用這種計算來定量測量NT-和CT-1GFBP-4片段的可能性(實施例9)。[0043]實驗[0044]實施例1.對IGFBP-4的新的蛋白水解表位特異性的小鼠單克隆抗體的產生。[0045]獲得用於小鼠免疫的合成肽:[0046]IGFBP-4肽-1:CHFAKIRDRSTSGGKM;[0047]IGFBP-4肽_2:KVNGAPREDARPVPQC。[0048]使用固相Fmoc化學合成了IGFBP-4肽-1和IGFBP-4肽_2(圖1)。在對烷氧基苯甲醇樹脂上製備肽。從樹脂上切割下來後，將粗製肽製備物通過反相高壓液相色譜純化。[0049]對C18製備柱施加0.1%三氟乙酸水溶液和0.1%三氟乙酸乙腈溶液的梯度。通過分析型C18高壓液相色譜和質譜(基質輔助雷射解吸/離子化質譜，準確度±0.5道爾頓)測定了純度(>95%)。[0050]IGFBP-4肽-1含有與IGFBP-4片段122-135相同的胺基酸序列，在N端有一個額外的半胱氨酸殘基。IGFBP-4肽-2含有與IGFBP-4片段136-150相同的胺基酸序列，在C端有一個額外的半胱氨酸殘基。利用這些額外的半胱氨酸殘基的巰基來製備肽與載體蛋白的綴合物。[0051]所述肽與載體蛋白的綴合物的製備利用從Pierce(Rockford,IL)獲得的磺基-SMCC按照製造商的說明來進行。為了綴合，將2.5mg載體蛋白——牛血清白蛋白(BSA)或卵清蛋白(都獲自SigmaChemicals,St.Louise,M0.)溶解在IOmMKHPO4,150mMNaCl,pH7.4(PBS)中至濃度10mg/ml。將溶於0.1ml二甲基亞碸的2毫克磺基-SMCC加入該蛋白溶液中。載體蛋白活化反應在室溫進行2小時。過量的磺基-SMCC使用ΝΑΡ-5柱(從GEHealthcareLifeSciences,Piscataway,NJ獲得)進行凝膠過濾加以去除。NAP-5柱用IOmMKH2PO4,150mMNaCl,pH7.2預平衡。然後將2mg的合成肽-1或肽_2加入蛋白溶液以起始綴合。該反應在冰上持續震蕩條件下進行2小時。利用以PBS預平衡的凝膠過濾NAP-5柱將未反應的肽級分與蛋白-肽綴合物分離。以使用十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳顯示分子量增加了3-5kDa，從而確認了肽與合適的載體蛋白的綴合。將綴合物分為等份並在_20°C儲存直到使用。[0052]用肽-(載體蛋白)綴合物免疫小鼠[0053]將五隻一組的BALB/c小鼠用肽-蛋白綴合物免疫五次。[0054]第I組:第一次免疫:用0.2ml含10μgBSA-肽-1的PBS與60%弗氏完全佐劑腹膜內免疫；第二次免疫:在第30日，用0.2ml含5ygBSA-肽-1的PBS與60%弗氏不完全佐劑腹膜內免疫；第三次免疫:在第60日，用0.2ml含2.5μgBSA-肽-1的PBS腹膜內免疫。[0055]第2組:第一次免疫:用0.2ml含10μgBSA-肽_2的PBS與60%弗氏完全佐劑腹膜內免疫；第二次免疫:在第30日，用0.2ml含5μgBSA-肽-2的PBS與60%弗氏不完全佐劑腹膜內免疫；第三次免疫:在第60日，用0.2ml含2.5ygBSA-肽-2的PBS腹膜內免疫。[0056]在第三次免疫後20日，選擇具有最高效價的肽特異性抗體的小鼠來進行最後一次免疫和雜交。對第I組小鼠，用0.2ml含?ομgBSA-肽-1的PBS靜脈內注射，對第2組小鼠，用0.2ml含IOygBSA-肽-2的PBS靜脈內注射。在次日，用相同的規程重複進行靜脈內注射(第5次免疫)。然後在第5次免疫之後2日，無菌分離經免疫的小鼠的脾臟，然後如前人所述(KohlerandMilstein,1975,1976;Kollleretal.,1976;Hammerlingetal.，1981)將經勻漿的組織與小鼠骨髓瘤細胞系sp2/0融合。[0057]對於生長的雜交瘤的條件化培養基，通過酶聯免疫吸附測定(ELISA)篩選抗體。通過分別使用卵清蛋白-肽-1或卵清蛋白-肽-2作為預吸附抗原的ELISA，選擇了產生對肽-1或肽2特異性的抗體的雜交瘤。也使用在NSO細胞系(獲自SigmaChemicals,St.Louise，M0.)中表達的人重組IGFBP-4作為預吸附抗原來進行額外的測試。為了進行該測定法，將50ng/0.1mlPBS每孔的卵清蛋白-肽-1，或卵清蛋白-肽-2，或人重組IGFBP-4吸附到免疫測定聚苯乙烯平板(獲自Corning,Cambridge,MA)上。在40min抗原吸附之後，用含有去汙劑TWeen20，0.1%的PBS(PBST)將平板洗滌兩次並封閉lOmin。然後將平板與0.05ml從生長的雜交瘤收集的條件化培養基溫育30min，用PBST洗滌兩次。通過與每孔0.1ml的第二抗體溫育30min來顯現結合於預吸附抗原的小鼠抗體，第二抗體為在PBST中稀釋1:1000的綴合有HRP的抗小鼠IgG多克隆抗體。第二抗體來自SigmaChemicals,St.Louise，Mo。與第二抗體溫育後，用PBST洗滌平板六次，加入含有0.03%過氧化氫的3，3』，5，5』-四甲基聯苯胺(TMB)過氧化氫酶底物。溫育15分鐘後，加入0.1ml0.5M磷酸終止反應，在450nm測量孔中的光吸收。光吸收的測量用LabsystemsMultiscan酶標儀(Labsystems,Finland)進行。[0058]選擇產生如下所述的抗體的雜交瘤進行下一步工作:對與卵清蛋白綴合的合適的肽具有特異性(在如上所述的條件下的450nm光吸收>背景之上0.5)，且同時不與人重組IGFBP-4反應(450nm光吸收〈背景之上0.025)。將這樣的雜交瘤通過有限稀釋克隆。將分泌感興趣的單克隆抗體的雜交瘤克隆在含0.1%胎牛血清(HyCloneLaboratories,Logan,UT)的Dulbecco氏改良的Eagle氏培養基(DMEM)中培育。[0059]抗體的親和純化[0060]在腹膜內注射選定的雜交瘤抗體之後，在小鼠腹水中產生了單克隆抗體。利用蛋白A親和色譜將抗體從腹水中純化出來。樹脂來自GEHealthcareLifeSciences(Piscataway,NJ),純化按照生產商的說明進行。將純化後的抗體作為50%硫酸銨中的懸液保存在4°C。[0061]為了驗證選定的單克隆抗體的特異性，獲取了IGFBP-4蛋白水解片段。按照先前描述(Overgaardetal.,2000)的進行PAPP-A依賴性蛋白水解反應。將2yg人重組IGFBP-4在2mMCaCl2,1.8μgIGF-1I(獲自SigmaChemicals,St.Louise,Mo)，40ng的人重組PAPP-A(HyTest，Turku,Finland),和2微升蛋白酶抑制劑雞尾酒(獲自SigmaChemicals,St.Louise,Mo)的存在下在0.23ml的50mMTris-HCl,ρΗ7.5中溫育。反應在37°C進行15小時，並通過將樣品冷凍在_20°C終止反應。使用獲自Abeam(Cambridge,MA)的Iμg/ml特異性家兔多克隆抗體進行Western印跡來確定IGFBP-4的PAPP-A依賴性切割的程度(圖6)。在間接ELISA中利用親和純化的抗體進行針對選定的抗IGFBP-4蛋白水解片段的單克隆抗體的特異性研究。將IOng的全長重組IGFBP-4或通過PAPP-A依賴性切割產生的IGFBP-4片段(如上所述製備)吸附到聚苯乙烯平板上。在溫育40min後，用含有去汙劑TWeen20，0.1%的PBS(PBST)洗滌平板兩次並封閉lOmin。然後將選定的單抗(10μg/ml)在室溫震蕩下溫育30min，然後用PBST洗滌兩次。用抗小鼠IgG多克隆抗體(綴合有HRP，PBST中1:1000稀釋，0.1ml/孔)檢測特異性結合的抗體。第二抗體來自SigmaChemicals,St.Louise,Mo。與第二抗體溫育之後,用PBST洗漆平板六次,並加入補充有0.03%過氧化氫的含有3，3』，5，5』-四甲基聯苯胺(TMB)的過氧化物酶底物。溫育15分鐘後通過添加0.1ml的0.5M磷酸終止反應,在450nm測量光吸收。最終選擇了下面一組單克隆抗體，它們對由PAPP-A依賴性切割產生的IGFBP-4蛋白水解片段具有特異性，對完整IGFBP-4的交叉反應性小於5%:IBP28,IBP27,IBP12,IBP3,IBP4,IBP7,IBP13,IBP18,IBP19，IBP20,IBP30,IBP167,IBP174,IBP160,IBP161,IBP164,IBP171,IBP163,IBP162(Fig.2)。所有單克隆抗體均為IgG同種型，除了IBP30是IgM同種型之外。[0062]實施例2.對完整IGFBP-4特異性的單克隆抗體的產生[0063]小鼠的免疫[0064]將5隻BALB/c用哺乳動物NSO細胞系中表達的人重組IGFBP-4免疫五次。蛋白獲自SigmaChemicals,St.Louise,Mo。第一次免疫:用0.2ml含5μgIGFBP-4的PBS與60%弗氏完全佐劑腹膜內免疫；第二次免疫:在第30日，用0.2ml含2μgIGFBP-4的PBS與60%弗氏不完全佐劑腹膜內免疫；第三次免疫:在第60日，用0.2ml含2μgIGFBP-4的PBS腹膜內免疫。[0065]在第三次免疫後20日，選擇具有最高效價的蛋白特異性抗體的小鼠來進行下述免疫和雜交。用含2ygIGFBP-4的0.2mlPBS對小鼠進行第四次靜脈內注射。然後在次日按照相同的規程進行最後一次靜脈內注射(第5次免疫)。2日後，無菌分離經免疫的小鼠的脾臟，然後如前人所述(KohlerandMilstein,1975，1976;Kohleretal.，1976;Hammerlingetal.，1981)將經勻漿的組織與小鼠骨髓瘤細胞系sp2/0融合。對於生長的雜交瘤的條件化培養基，通過ELISA法篩選IGFBP-4特異性抗體。通過間接ELISA選擇產生對完整IGFBP-4特異性的抗體的雜交瘤。為了進行測定法，將50ng/0.1mlPBS每孔全長人重組IGFBP-4吸附到免疫測定聚苯乙烯平板上。在40min溫育之後，用含有去汙劑Tween20,0.1%的PBS(PBST)將平板洗滌兩次並封閉lOmin。然後將平板與0.05ml從含有生長的雜交瘤的孔收集的條件化培養基溫育30min。溫育之後用PBST洗滌平板兩次。洗滌之後將平板與每孔0.1ml的第二抗體溫育30min來顯現結合於預吸附抗原的小鼠抗體，第二抗體為綴合有HRP的抗小鼠IgG多克隆抗體(在PBST中1:1000稀釋)。與第二抗體溫育後，用PBST洗滌平板六次，加入含有TMB和0.03%過氧化氫的過氧化氫酶底物。溫育15分鐘後，加入0.1ml0.5M磷酸終止反應，在450nm測量孔中的光吸收。將產生對全長IGFBP-4特異性的抗體(在上文所述條件下於450nm的光吸收>背景之上0.5)通過有限稀釋法克隆。將分泌感興趣的單克隆抗體的雜交瘤克隆在含有10%胎牛血清的DMEM中培養。[0066]抗體的親和純化[0067]在腹膜內注射選定的雜交瘤克隆之後，在小鼠腹水中產生了對全長IGFBP-4特異性的單克隆抗體。利用蛋白A親和色譜將抗體從腹水中純化出來。樹脂來自GEHealthcareLifeSciences(Piscataway,NJ),純化按照生產商的說明進行。將純化後的單克隆抗體作為50%硫酸銨中的懸液保存在4°C。最終選擇了下組對完整(全長)IGFBP-4特異性的單克隆抗體:IBP17,IBP180,IBP181,IBP153,IBP154,IBP152,IBP156,IBP144,IBP190,IBP182,IBP185,IBP186,IBP187(圖2)。[0068]實施例3用於定量IGFBP-4片段的夾心免疫測定的設計[0069]還在夾心免疫測定法中檢查了經親和純化的單克隆抗體的特異性(圖3)。在夾心免疫測定法中檢驗了幾組特異性抗體，以找到具有需要的性質的組合。用對完整(全長)IGFBP-4特異性的單克隆抗體來檢驗對蛋白水解性新表位特異性的單克隆抗體，以開發用於特異性測定IGFBP-4蛋白水解片段而無需考慮完整(全長)IGFBP-4的存在的夾心免疫測定法。開發了幾種夾心測定法，它們使用一種對IGFBP-4的蛋白水解片段(N端或C端，在間接ELISA中與全長分子的交叉反應低於5%)特異性的單克隆抗體，和另一種識別完整IGFBP-4的任何表位的單抗。在實施例2中描述了對完整IGFBP-4特異性的小鼠單克隆抗體的生成。為了進行夾心螢光免疫測定法,如Hyytidetal.，2010所述使用標記有穩定的Eu3+螯合物的檢測單抗。該測定法中的捕捉抗體是對完整IGFBP-4特異性的，而檢測抗體是對IGFBP-4的蛋白水解性新表位特異性的。將捕捉抗體(IBP3，IBP18,IBP185,IBP182)，每孔2μg溶於100μL磷酸鹽緩衝鹽水中，在96孔免疫測定平板中室溫恆定震蕩下溫育30min。將平板用加有0.15MNaCl,0.025%Tween20和0.5g/LNaN3的緩衝液(緩衝液A)洗滌。在洗滌後，向平板中加入含有100ng/ml全長人重組IGFBP-4或重組IGFBP-4片段的測定緩衝液(50mMTris-HCl緩衝液，ρΗ7.7，9g/LNaCl,0.01%Tween40,0.5%BSA和0.5g/LNaN3)。將平板在室溫恆定震蕩下溫育30min。在用緩衝液A洗滌之後，加入0.1ml檢測抗體(IBP144，IBP180,IBP177,IBP163和IBP162)在測定緩衝液中的溶液。將平板在室溫恆定震蕩下溫育30min。用緩衝液A洗滌之後，每個孔加入0.2ml增強溶液(1.75MNaSCN,IMNaCl,5%甘油，20%1_丙醇，5mMNa2CO3,50mM甘氨酸-NaOH,ρΗΙΟ.0)，並在輕柔震蕩下室溫溫育3min。在Victorl420多標記計數器(Wallac-PerkinElmer)上測量Eu3+的螢光。螢光表示為每秒的計數(CPS)。研發的夾心免疫測定能夠只檢出由PAPP-A依賴性切割產生的IGFBP-4片段，而與全長IGFBP-4無交叉反應(或少於1%)。對NT-1GFBP-4特異性的最好的配對是IBP3-1BP144(圖3A)，而對CT-1GFBP-4特異性的最好的配對是IBP182-1BP163(圖3B)。為了進行對NT-1GFBP-4特異性的夾心免疫測定法，將對IGFBP-4的蛋白水解片段特異性的單克隆抗體用作捕捉抗體，而對完整IGFBP-4特異性的單克隆抗體用作檢測抗體，而在CT-1GFBP-4免疫測定法中，則使用相反的構成。[0070]實施例4.用於完整(全長)IGFBP-4的定量的夾心免疫測定法的設計[0071]在IGFBP-4片段的存在下對全長IGFBP-4的定量可以利用特異性的夾心免疫測定法來實現，該測定法利用一種對蛋白的N端結構域特異性的單克隆抗體，和識別完整IGFBP-4的C端結構域上的表位的另一種單抗。對全長IGFBP-4的小鼠單克隆抗體的產生在實施例2中描述。為了進行夾心螢光免疫測定法，使用實施例3中描述的方法。該測定法中的捕捉抗體是對完整IGFBP-4的C端區域特異性的(IBP182,IBP186,IBP185,IBP187)。該測定法中的檢測抗體則是對全長IGFBP-4的N端區域特異性的(IBP154，IBP180,IBP181,IBP153和IBP156)。研發出的夾心免疫測定法能夠僅檢出全長IGFBP-4而與由PAPP-A依賴性切割產生的片段沒有交叉反應(或少於1%)。最好的配對是IBP185-1BP180和IBP185-1BP154(圖4)。[0072]實施例5.用於定量總IGFBP-4的夾心免疫測定法的設計[0073]使用對兩種IGFBP-4形式(全長和片段)特異性的單克隆抗體來開發用於檢測IGFBP-4的總量的免疫測定法。為了這種免疫測定法，重要的是對兩種形式一完整和蛋白水解切割的一的蛋白質具有同等特異性(圖5)。可以設計兩種這樣的夾心免疫測定法:(I)用於檢測完整大小的IGFBP-4與CT-1GFBP-4片段二者(利用兩種識別IGFBP-4的C端區域中的表位的單克隆抗體)的和(2)用於測量完整大小IGFBP-4與NT-1GFBP-4片段二者(利用識別IGFBP-4的N端區域中的表位的兩種單克隆抗體)的。對完整IGFBP-4特異性的小鼠單克隆抗體的產生在實施例2中描述。為了進行夾心螢光免疫測定法，我們使用了實施例3中描述的方法。該測定法中的捕捉抗體是對完整IGFBP-4的C端區域特異性的(IBP182,IBP186,IBP185,IBP187和IBP190)。該測定法中的檢測抗體則是對完整IGFBP-4的N端區域特異性的(IBP154,IBP180,IBP181,IBP153,IBP156和IBP17)。研發出的夾心免疫測定法能夠檢測全長IGFBP-4，並且在由PAPP-A依賴性切割產生的片段和完整IGFBP-4之間沒有區別(或者區別很小——小於10%)。最好的配對是IBP185-1BP190和IBP17-1BP180(分別為5A和5B)。[0074]實施例6.PAPP-A的動脈粥樣硬化形式的蛋白水解活性[0075]將人動脈粥樣硬化冠狀血管樣品保存於_70°C直至使用。在組織勻漿之後從動脈粥樣硬化冠狀動脈提取PAPP-A。將提取的PAPP-A通過親和色譜純化。PAPP-A純化用的親和基質是用PAPP-A特異性的單克隆抗體4G11(獲自HyTest，Turku,Finland)製備的。為了確證純化的蛋白與PAPP-A的同一性，使用了採用幾種PAPP-A特異性單克隆抗體的Western印跡分析，以及液相色譜/串聯質譜分析。[0076]為了進行動脈粥樣硬化PAPP-A的蛋白水解活性分析，將2μg的人重組IGFBP-4在0.23ml的50mMTris-HCl,pH7.5中，在2mMCaCl2,1.8μglGF-1I(獲自SigmaChemicals,St.Louise,M0.)，40ng的動脈粥樣硬化PAPP-A，和2微升蛋白酶抑制劑雞尾酒(獲自SigmaChemicals,St.Louise,Mo)的存在下溫育。反應在37°C進行15小時，並通過將樣品冷凍於-20°C終止反應。利用IGFBP-4特異性家兔多克隆抗體(獲自Abeam,Cambridge,MA)進行Western印跡來確定IGFBP-4的PAPP-A依賴性切割的程度(圖6)。[0077]實施例7.健康供體中和確診的AMI患者的血漿樣品中IGFBP-4片段的測量[0078]ACS的血漿樣品中IGFBP-4的蛋白水解片段的檢測利用對蛋白水解片段特異性的夾心免疫測定法來進行。將43名ACS患者(心電圖上有ST區段抬高)的血液以及來自54名健康供體的血漿樣品利用片段特異性夾心免疫測定法IBP3-1BP144(對N片段特異)和IBP182-1BP163(對C片段特異)來加以檢驗。所有血漿樣品均在有EDTA存在下從患者收集，並在測量之前保存於_70°C。[0079]為了夾心免疫測定法，將捕捉抗體IBP3和IBP182，每孔2μg於Iml磷酸鹽緩衝鹽水中，在96孔免疫測定平板中室溫恆定震蕩下溫育30min。用緩衝液A洗滌後，將0.1ml用測定緩衝液1:5稀釋過的患者血漿樣品加入平板中。將平板在恆定震蕩下室溫溫育30min。用緩衝液A洗滌後，加入0.1ml與穩定的Eu3+螯合物綴合的檢測抗體IBP144或IBP163(溶於測定緩衝液中)。將平板在室溫恆定震蕩下溫育30min。用緩衝液A洗滌後，每孔加入0.2ml增強溶液，在室溫輕柔震蕩下溫育3min。使用VictOrl420多標記計數器(ffallac-PerkinElmer)測量Eu3+的螢光。IGFBP-4片段在ACS患者的血漿中的水平比健康的供體血漿中的水平高5.1和2.7倍(二者均p〈0.0005)(圖7)。圖中顯示了平均值土標準偏差。螢光以每秒計數(CPS)表示。利用IBP3-1BP144和IBP182-1BP163夾心配對揭示了片段的顯著增加(圖7)。[0080]實施例8.利用對IGFBP-4蛋白水解片段特異性的夾心免疫測定法為預測嚴重不良心臟事件對IGFBP-4片段進行的跟蹤研究[0081]為了這項研究,在患者因胸痛/胸悶(chesttightness)被收治到急救部門時從患者獲取樣品。[0082]患者如果具有缺血的症狀(主要表現為由有經驗的心臟病醫師歸類的心臟病類型的特有胸痛)，則有資格納入研究。該研究納入了166名患者。從患者採取靜脈血至含K3EDTA的非可替真空米血管中(Vacuettetubes)(GreinerBio-One),4°C3000g離心15min。血漿樣品保存在_70°C。所有患者自進入研究之日(此時對他們進行所有基線評估)起前瞻性地追蹤6個月或者至死亡為止。記錄在案的主要終點包括嚴重不良心臟事件(MACE),包括如下在內:非致死性心肌梗死、心臟死亡(cardiacdeath)。聯合終點(combinedendpoints)包括MACE和所有原因的死亡(MACEACD)。總共166名患者完成了追蹤(100%)。有17例MACE和31例MACEACD)。[0083]進行了ROC曲線分析來研究NT-、CT-1GFBP-4、全長IGFBP-4以及它們的比例的預測價值。6個月時的MACE終點(MACEendpointsat6months)為感興趣的事件。NT-和CT-1GFBP-4在預測MACE和MACEACD預測中的最佳截止值(cut-off)是從接受者操作曲線(R0C曲線)求出的，且被定義為給出最佳的靈敏度和特異性組合的值。[0084]在本發明中，對急性胸痛患者的血漿樣品中的IGFBP-4蛋白水解片段的檢測是使用對蛋白水解片段特異性的夾心免疫測定法進行的。通過片段特異性夾心免疫測定法IBP3-1BP144(對NT-1GFBP-4)和IBP182-1BP163(對CT-1GFBP-4)測試了166名患者的血液。[0085]為了進行夾心免疫測定法測量，將捕捉抗體IBP3和IBP182(每孔2μg，在0.1ml磷酸鹽緩衝鹽水中)在室溫恆定震蕩下在96孔免疫測定平板中溫育30min。用緩衝液A洗滌後，向平板中加入0.1ml用測定緩衝液1:5稀釋過的患者血清樣品。將平板在室溫恆定震蕩下溫育30min。用緩衝液A洗滌之後，加入含檢測抗體IBP144和IBP163的0.1ml測定緩衝液。將平板在室溫恆定震蕩下溫育30min。用緩衝液A洗滌後，加入每孔0.2ml的增強溶液，並在輕柔震蕩下室溫溫育3min。使用Victorl420多標記計數器(Wallac-PerkinElmer)測量Eu3+的螢光。[0086]NT-和CT-1GFBP-4濃度範圍分別為7-2553和12-564μg/L。通過ROC分析研究7NT-和CT-1GFBP-4及它們的比例預測6個月時的MACE(MACEat6months)的能力(圖8)。NT-和CT-1GFBP-4測定法的ROC曲線下面積(ROCAUC)結果分別為0.861(Ρ〈0.001)和0.800(Ρ〈0.001)，分別顯示NT和CT-1GFBP-4是MACE的強預測子(圖8Α)。同樣，NT-和CT-1GFBP-4是MACEACD的強預測子:R0CAUC分別為0.814(P背景之上0.5)，且同時不與人重組IGFBP-5反應(450nm光吸收〈背景之上0.025)。將這樣的雜交瘤通過有限稀釋克隆。將分泌感興趣的單克隆抗體的雜交瘤克隆在含0.1%胎牛血清(HyCloneLaboratories,Logan,UT)的Dulbecco氏改良的Eagle氏培養基(DMEM)中培育。[0103]抗體的產生和親和純化如上所述進行。[0104]單克隆抗體的特異性的研究[0105]為了驗證選定的單克隆抗體的特異性，獲取了IGFBP-5蛋白水解片段。按照下述條件進行PAPP-A依賴性蛋白水解反應。將12μg的人IGFBP-5在0.12ml的2mMCaCl2,120ng的人重組PAPP-A(HyTest,Turku,Finland)，和0.5微升蛋白酶抑制劑雞尾酒(獲自SigmaChemicals,St.Louise,Mo)的存在下在0.12ml的50mMTris-HCl,pH7.5中溫育。反應在37°C進行40分鐘，並通過將樣品冷凍在-70°C終止反應。通過十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳隨後進行考馬斯藍R-250染色來確定IGFBP-5的PAPP-A依賴性切割的程度(圖10)。在間接ELISA中利用親和純化的抗體進行針對選定的抗IGFBP-5蛋白水解片段的單克隆抗體的特異性研究。將IOng的全長重組IGFBP-5或通過PAPP-A依賴性切割產生的IGFBP-5片段(如上所述製備)吸附到聚苯乙烯平板上。在溫育40min後，用含有去汙劑Tween20，0.1%的PBS(PBST)洗滌平板兩次並封閉lOmin。將選定的單抗(10μg/ml)在室溫震蕩下溫育30min，然後用PBST洗滌兩次。用抗小鼠IgG多克隆抗體(綴合有HRP，PBST中1:1000稀釋,0.1ml/孔)檢測特異性結合的抗體。第二抗體來自SigmaChemicals,St.Louise，Mo。與第二抗體溫育之後，用PBST洗滌平板六次，並加入補充有0.03%過氧化氫的含有3，3』，5，5』-四甲基聯苯胺(TMB)的過氧化物酶底物。溫育15分鐘後通過添加0.1ml的0.5M磷酸終止反應，在450nm測量光吸收。最終選擇了如下所述的一種單克隆抗體，其對由PAPP-A依賴性切割產生的IGFBP-5蛋白水解片段具有特異性，對完整IGFBP-5的交叉反應性小於5%:IBPF72(圖2)。IBPF72為IgG同種型。[0106]實施例11.對完整IGFBP-5特異性的單克隆抗體的產生[0107]獲取的用於小鼠免疫的合成肽:[0108]IGFBP-5肽_2:CLNEKSYREQVKIERDSREHE[0109]如上所述利用固相Fmoc化學合成了IGFBP-5肽_2。IGFBP-5肽_2含有與IGFBP-5片段80-100相同的胺基酸序列。利用如上所述的磺基-SMCC進行了該肽與載體蛋白(BSA)的綴合物的製備。[0110]用肽_(載體蛋白)綴合物免疫小鼠。將12隻BALB/c小鼠用肽-蛋白質綴合物免疫五次。第一次免疫:用0.2ml含10μgBSA-1GFBP-5-肽-2的PBS與60%弗氏完全佐劑腹膜內免疫；第二次免疫:在第30日，用0.2ml含5μgBSA-1GFBP-5-肽-2的PBS與60%弗氏不完全佐劑腹膜內免疫；第三次免疫:在第60日，用0.2ml含2.5μgBSA-1GFBP-5-肽-2的PBS腹膜內免疫。[0111]在第三次免疫後20日，選擇具有最高效價的肽特異性抗體的小鼠來進行最後的免疫和雜交。用含?ομgBSA-1GFBP-5-肽-2的0.2mlPBS對小鼠進行第四次靜脈內注射。在次日按照相同的規程重複進行靜脈內注射(第5次免疫)。然後在第5次免疫2日後，無菌分離經免疫的小鼠的脾臟，然後如前人所述(KdhlerandMilstein,1975，1976;Kohleretal.,1976;Hammerlingetal.,1981)將經勻眾的組織與小鼠骨髓瘤細胞系sp2/0融合。[0112]對於生長的雜交瘤的條件化培養基，通過ELISA法篩選IGFBP-5特異性抗體。通過間接ELISA選擇產生對完整IGFBP-5特異性的抗體的雜交瘤。為了進行測定法，將50ng/0.1mlPBS每孔全長人重組IGFBP-5吸附到免疫測定聚苯乙烯平板上。在40min溫育之後，用含有去汙劑Tween20，0.1%的PBS(PBST)將平板洗滌兩次並封閉lOmin。然後將平板與0.05ml從含有生長的雜交瘤的孔收集的條件化培養基溫育30min。溫育之後用PBST洗滌平板兩次。洗滌之後將平板與每孔0.1ml的第二抗體溫育30min，第二抗體為綴合有HRP的抗小鼠IgG多克隆抗體(在PBST中1:1000稀釋)。與第二抗體溫育後，用PBST洗滌平板六次，加入含有TMB和0.03%過氧化氫的過氧化氫酶底物。溫育15分鐘後，加入0.1ml0.5M磷酸終止反應，在450nm測量孔中的光吸收。將產生對全長IGFBP-5特異性的抗體(在上文所述條件下於450nm的光吸收>背景之上0.5)通過有限稀釋法克隆。將分泌感興趣的單克隆抗體的雜交瘤克隆在含有10%胎牛血清的DMEM中培養。[0113]抗體的產生和親和純化如上所述地進行。[0114]最終選擇了一組對完整IGFBP-5特異性的單克隆抗體:IBPF15，IBPF16。[0115]實施例12.用於定量IGFBP-5片段的夾心免疫測定法的設計[0116]還在夾心免疫測定法中檢查了親和純化的單克隆抗體IBPF72的特異性(圖11)。用對完整(全長)IGFBP-5特異性的單克隆抗體對IBPF72進行測試，以建立特異性檢測NT-1GFBP-5而無需考慮全長IGFBP-5的存在的夾心免疫測定法。建立了兩種利用對IGFBP-5的N端蛋白水解片段特異性(在間接ELISA中與全長分子的交叉反應低於5%)的IBPF72單克隆抗體和另一種識別完整IGFBP-5的單抗的測定法。為了進行夾心螢光免疫測定法，我們使用了如Hyytiiietal.，2010所述的用穩定Eu3+螯合物標記的檢測單抗。該測定法中的捕捉抗體對完整IGFBP-5特異性，而檢測抗體對IGFBP-5的蛋白水解性新表位特異性。捕捉抗體(IBPF15或IBPF16)，每孔Uyg於IOOyL磷酸鹽緩衝鹽水中，在室溫恆定震蕩下在96孔免疫測定平板中溫育30min。將平板用補充有0.15MNaCl,0.025%Tween20和0.5g/LNaN3的IOmMTris-HCl(pH7.8)(緩衝液A)洗滌。洗滌後加入0.05ml含有不同濃度的全長人重組IGFBP-5或重組NT-1GFBP-5片段的測定緩衝液(50mMTris-HCl緩衝液，ρΗ7.7，9g/LNaCl，0.01%Tween40,0.5%BSA和0.5g/LNaN3)，和0.05ml檢測抗體(IBPF72)在測定緩衝液中的溶液(4mg/L)。將平板在室溫恆定震蕩下溫育30min。用緩衝液A洗滌之後，加入每孔0.2ml增強溶液(1.75MNaSCN,IMNaCl,5%甘油，20%1_丙醇，5mMNa2CO3,50mM甘氨酸-NaOH,ρΗΙΟ.0)，並在輕柔震蕩下室溫溫育3min。在Victorl420多標記計數器(Wallac-PerkinElmer)上測量Eu3+的螢光。螢光用每秒計數(CPS)表示。建立的夾心免疫測定法能夠僅檢測由PAPP-A依賴性切割產生的N-1GFBP-5(或重組IGFBP-4的N端片段)，而與全長IGFBP-5無交叉反應(或少於5%)。對NT-1GFBP-5特異性的兩個配對為IBPF15-1BPF72和IBPF16-1BPF72(分別為圖1IA和圖11B)。[0117]實施例13.利用對NT-1GFBP-5特異性的夾心免疫測定法對NT-1GFBP-5用於預測嚴重不良心臟事件的追蹤研究[0118]將由於胸痛/胸悶而收治到急救部門的患者納入此研究。還納入了已確診有不穩定型心絞痛或缺血性心臟病的患者。[0119]該研究中納入了276名患者。從患者採取靜脈血至含K3EDTA的非可替真空採血管中(Vacuettetubes)(GreinerBio-One),4°C3000g離心15min。血眾樣品保存在-70°C。對所有患者自進入研究之日(此時對他們進行所有基線評估)起前瞻性地追蹤6個月或者至死亡為止。記錄在案的主要終點包括嚴重不良心臟事件(MACE)，包括如下在內:非致死性心肌梗死、心臟死亡(cardiacdeath)。僅將具備追蹤信息的患者納入該研究中。追蹤過程中有24個MACE終點。[0120]對於具有MACE事件的患者以及24名從沒有MACE事件的患者組中隨機選取的患者，通過IBPF15-1BPF72和IBPF16-1BPF72測量他們的所有樣品中NT-1GFBP-5的濃度。進行了ROC曲線分析來研究NT-1GFBP-5的預測價值。[0121]為了進行夾心免疫測定法測量，將捕捉抗體IBP15和IBP16(每孔Uyg，在0.1ml磷酸鹽緩衝鹽水中)在室溫恆定震蕩下在96孔免疫測定平板中溫育45min。用緩衝液A洗滌後，向平板中加入0.05ml用測定緩衝液1:2稀釋過的患者血清樣品和0.05ml含檢測抗體IBPF72的測定緩衝液。將平板在室溫恆定震蕩下溫育30min。用緩衝液A洗滌之後，加入含檢測抗體IBP144和IBP163的0.1ml測定緩衝液。將平板在室溫恆定震蕩下溫育30min。用緩衝液A洗滌後，加入每孔0.2ml的增強溶液，並在輕柔震蕩下室溫溫育3min。使用Victorl420多標記計數器(Wallac-PerkinElmer)測量Eu3+焚光。[0122]NT-1GFBP-5濃度範圍為15.4-83.3μg/L。通過ROC分析(圖12)研究了NT-1GFBP-5預測6個月時的MACE的能力。NT-1GFBP-5測定的ROC曲線下面積(ROCAUC):就IBPF15-1BPF72為0.68(P=0.034)，IBPF16-1BPF72為0.67(P=0.039)，顯示NT-1GFBP-5是MACE的強預測子(圖12)。[0123]因此，在6個月的追蹤中，NT-1GFBP-5似乎是急性胸痛、不穩定型心絞痛或缺血性心臟病患者中MACE的預測子。[0124]參考文獻:[0125]Hammerling,G.J.，HammerIing,U.，andKearney,J.F.eds.，MonoclonalAntibodiesandT-CellHybridomasjpublishedbyElsevier,North-HollandjNewYork,1981;pp.563-587.[0126]HyytiaH，RistiniemiNjAirasLjPetterssonK，HeilmanJjDevelopmentofanimmunoassayforthedetectionofcystatinCdimers.JImmunolMethods2010;355(1-2):14-20.[0127]KohlerG，MilsteinC.,Continuousculturesoffusedcellssecretingantibodyofpredefinedspecificity.Nature.1975;256(5517):495-7.[0128]KohlerGjMilsteinC.,Derivationofspecificantibody-producingtissuecultureandtumorlinesbycellfusion.EurJImmunol.1976;6(7):511-9.[0129]KohlerGjHoweSC，MilsteinC.，Fusionbetweenimmunoglobulin-secretingandnonsecretingmyelomacelllines.EurJImmunol.1976;6(4):292-5.[0130]OvergaardMT，HaaningJ，BoldtHB，OlsenIM，LaursenLS，ChristiansenMjGleichGJjSottrup-JensenL，ConoverCA，OxvigCExpressionofrecombinanthumanpregnancyassociatedplasmaprotein—Aandidentificationoftheproformofeosinophilmajorbasicproteinasitsphysiologicalinhibitor.JournalofBiologicalChemistry,2000;275:31128-31133.[0131]下面給出與本申請相關的序列表。用於免疫動物的肽(序列7-10)在更大的片段(序列1，2和4)中下劃線標出。另外提供了一份序列表。[0132]SEQIDN0.1:(IGFBNP-4的N端):[0133]DEAIHCPPCSEEKLARCRPPVGCEELVREPGCGCCATCALGLGMPCGVYTPR-[0134]CGSGLRCYPPRGVEKPLHTLMHGQGVCMELAEIEAIQESLQPSDKDE-[0135]GDHPNNSFSPCSAHDRRCLQKHFAKIRDRSTSGGKM[0136]SEQIDN0.2:(IGFBP-4的C端):[0137]KVNGAPREDARPVPQGSCQSELHRALERLMSQSRTHEDLYIIPIPNCDRNGNFHPKQCHPALDGQRGKCWCVDRKTGVKLPGGLEPKGELDCHQLADSFRE[0138]SEQIDN03:(IGFBP-4)[0139]DEAIHCPPCSEEKLARCRPPVGCEELVREPGCGCCATCALGLGMPCGVYTPRCGS-[0140]GLRCYPPRGVEKPLHTLMHGQGVCMELAEIEAIQESLQPSDKDE⑶HP-NNSFSPCS-[0141]AHDRRCLQKHFAKIRDRSTSGGKMKVNGAPREDARPVPQGSCQSELHRALERLAA-[0142]SQSRTHEDLYIIPIPNCDRNGNFHPKQCHPALDGQRGKCWCVDRKTGVKLPGGLEPKGELDCHQLADSFRE[0143]SEQIDN04:(IGFBP-5的N端):[0144]LGSFVHCEPCDEKALSMCPPSPLGCELVKEPGCGCCMTCALAEGQSCGVYTERCAQGLRCLPRQDEEKPLHALLHGRGVCLNEKSYREQVKIERDSREHEEPTTSEMAEETYSPKIFRPKHTRISELKAEAVKKDRRKKLTQS[0145]SEQIDN05:(IGFBP-5的C端):[0146]KFVGGAENTAHPRIISAPEMRQESEQGPCRRHMEASLQELKASPRMVPRAVYLPNCDR-[0147]KGFYKRKQCKPSRGRKRGICWCVDKYGMKLPGMEYVD⑶FQCHTFDSSNVE[0148]SEQIDN06:(IGFBP-5):[0149]LGSFVHCEPCDEKALSMCPPSPLGCELVKEPGCGCCMTCALAEGQSCGVYTERCAQ-[0150]GLRCLPRQDEEKPLHALLHGRGVCLNEKSYREQVKIERDSREHEEPTTSEMAEETYSPKIFRPKHTRISELKAEAVKKDRRKKLTQSKFVGGAENTAHPRIISAPEMRQESEQGPCRR-[0151]HMEASLQELKASPRMVPRAVYLPNCDRKGFYKRKQCKPSRGRKRGICWCVDKYGMKLPGMEYVD⑶FQCHTFDSSNVE[0152]SEQIDN07:(IGFBP-4肽-1):CHFAKIRDRSTSGGKM[0153]SEQIDN08:(IGFBP-4肽-2、:KVNGAPREDARPVPQC[0154]SEQIDN09:(IGFBP-5肽_4):CKAEAVKKDRRKKLTQS[0155]SEQIDNOlO:(IGFBP-5肽-2):CLNEKSYREQVKIERDSREHE【權利要求】1.一種確定個體中未來的嚴重不良心血管事件的風險的方法，包括下述步驟:(a)測定該個體的樣品中的下述的量:對應於SEQIDNO:1的IGFBP-4N端片段，或對應於具有SEQIDNO:1的至少13個連續胺基酸的序列的片段，或對應於與SEQIDNO:1有至少80%同一性的序列的片段，或測定該個體的樣品中的下述的量:對應於SEQIDNO:2的IGFBP-4C端片段，或者或對應於具有SEQIDNO:2的至少13個連續胺基酸的序列的片段，或對應於與SEQIDNO:2有至少80%同一性的序列的片段，或測定該個體的樣品中的下述的量:對應於SEQIDNO:4的IGFBP-5N端片段，或對應於具有SEQIDNO:4的至少9個連續胺基酸的序列的片段，或對應於與SEQIDN0:4有至少80%同一性的序列的片段，或測定該個體的樣品中的下述的量:對應於SEQIDNO:5的IGFBP-5C端片段，或者對應於具有SEQIDNO:5的至少9個連續胺基酸的序列的片段，或對應於與SEQIDNO:5有至少80%同一性的序列的片段，(b)將步驟a)中測定的量與相應的肽的合適的參考量進行比較，和(c)確定未來的嚴重不良心血管事件的風險。2.一種監測個體中的心血管疾病治療的效力的方法，包括下述步驟:a)測定在所述治療開始前、開始時或過程中獲取的該個體的第一樣品中的任何如權利要求I中定義的片段的量，b)測定在晚於所述第一樣品獲取的所述個體的第二樣品中相應的片段的量，c)將步驟(a)中測得的所述片段的量與步驟(b)中測得的相應片段的量進行比較，其中步驟(b)中測得的片段的量相比於步驟(a)中測得的量相比有增加或者水平相同則表明所述治療對所述個體無效，和d)將步驟a)中測得的所述片段的量與步驟(b)中測得的相應片段的量進行比較，其中步驟(b)中測得的片段的量與步驟(a)中測得的量相比有減少則表明所述治療對所述個體有效。3.權利要求2的方法，其中所述治療包括對所述個體的抗血小板療法、抗炎療法、他汀類藥物療法、降脂療法、以斑塊穩定化或退化為目的的療法，或溶栓療法。4.權利要求1的方法，其中所述片段的量高於它們的參考量表明所述個體有未來的嚴重不良心血管事件的風險。5.權利要求1的方法，其中所述片段的量低於它們的參考量表明所述個體的未來的嚴重不良心血管事件的風險低。6.權利要求1的方法，還包括根據所述片段的測量值將所述個體歸入不同的風險組的步驟。7.權利要求1-6中任一項的方法，其中所述嚴重不良心血管事件是選自下列的一種或多種事件:急性冠狀動脈症候群(ACS)、不穩定型心絞痛、心肌梗死(MI)、ST-抬高MI，非ST-抬高MI，血管重建、緊急冠狀動脈搭橋術，經皮冠狀動脈介入、與冠心病相關的死亡。8.權利要求1-6中任一項的方法，其中所述嚴重不良心血管事件是卒中。9.權利要求1的方法，還包括針對另一種或多種嚴重不良心血管事件預測標誌的測定法，所述標誌選自下組:膽固醇成分、C反應性蛋白(CRP)、心臟肌鈣蛋白I，心臟肌鈣蛋白T，B型鈉尿肽(BNP)，BNP前體肽(proBNP)，N端前BNP(NT-proBNP)，脂蛋白相關的磷脂酶A2(Lp-PLA2),胎盤生長因子(PlGF)，估計的腎小球濾過率(eGFR)，同型半胱氨酸(HCY)，膽鹼，缺血修飾白蛋白，可溶性⑶40配體(s⑶40L),或髓過氧化物酶(MPO)，其中任何如權利要求1中定義的片段的水平與所述一種或多種其他標誌的組合可預示未來嚴重不良心血管事件的風險。10.權利要求1-9中任一項的方法，其中所述樣品中的任何如權利要求1中定義的片段的量高於在沒有任何心血管疾病史的群體中發現的相應片段的第50百分位。11.權利要求1-9中任一項的方法，其中所述樣品中的任何如權利要求1中定義的片段的量高於在沒有任何心血管疾病史的群體中發現的相應片段的第95百分位。12.權利要求1的方法，還包括下述步驟:(d)測量所述樣品中相當於SEQIDNO:3的IGFBP-4的量；(e)計算如權利要求1中定義的任何IGFBP-4片段的量與該IGFBP-4的量的比例；(f)將步驟(e)中確定的比例與相應片段的合適的參考比例值進行比較；(g)確定未來的嚴重不良心血管事件的風險。13.權利要求1的方法，還包括下述步驟:(d)測量所述樣品中相當於SEQIDNO:6的IGFBP-5的量；(e)計算如權利要求1中定義的任何IGFBP-5片段的量與該IGFBP-5的量的比例；(f)將步驟(e)中確定的比例與相應片段的合適的參考比例值進行比較；(g)確定未來的嚴重不良心血管事件的風險。14.權利要求1-13中任一項的方法，其中所述個體是表現有ACS、胸痛或者氣促的個體。15.權利要求14的方法，其中所述ACS是選自下列的一種或多種事件:冠心病、穩定型心絞痛、不穩定型心絞痛、M1、ST-抬高的M1、非-ST抬高的MI，左心室功能障礙，和充血性心力衰竭。16.權利要求1-13中任一項的方法，其中所述個體是不顯示任何與冠心病相關的症狀的個體。17.權利要求1-15中任一項的方法，其中所述個體是暴露於任何類型的心血管疾病治療的個體。18.—種評價心血管疾病治療的效力的方法，包括:a)測定參與臨床試驗的至少一個個體的樣品中任何如權利要求1定義的片段的量，其中所述測定在所述臨床試驗開始時、之中、或之後進打;b)將早先測定的任何如權利要求1定義的片段的量與後來測定的相應片段的量進行比較，其中所述量的增加或者水平相同表明所述治療無效；c)將早先測定的任何如權利要求1定義的片段的量與後來測定的相應片段的量進行比較，其中所述量的減少表明所述治療有效。19.前述任一項權利要求的方法，其中所述樣品是血液、血漿或血清樣品。20.治療個體中的心血管病症或阻礙心血管病症進展的方法，其導致所述個體的循環中任何如權利要求1定義的片段減少。21.前述任一項權利要求的方法，其中所述個體是人或哺乳動物。22.—種藥物組合物，其包含用於預防卒中、心臟病發作或心血管疾病，或者用於治療心血管疾病的藥劑，所述藥劑選自下組:抗炎劑、抗糖尿病藥、抗血栓藥、抗血小板劑、溶纖劑、降脂劑、直接凝血酶抑制劑、糖蛋白Ilb/IIIa受體抑制劑、結合細胞粘附分子並抑制白細胞結合此類分子的能力的藥劑、鈣離子通道阻斷劑、β_腎上腺能受體阻斷劑、環加氧酶-2抑制劑、和血管緊張素系統抑制劑；其中所述藥物組合物還包含能夠降低個體中如權利要求I中定義的任何片段的水平的組分。23.一種用於實施權利要求1-9中任一項所述的方法的測試試劑盒，所述試劑盒包含用於實施所述方法的說明，以及a)用於測量個體的樣品中任何如權利要求1中定義的片段的量的手段，和b)用於將所述量與合適的參考量比較的手段，通過比較從而(c)確定未來的嚴重不良心血管事件的風險。24.權利要求23的測試試劑盒，還包括針對另一種或多種嚴重不良心血管事件預測標誌的測定系統，所述標誌選自下組:膽固醇成分、C反應性蛋白(CRP)、心臟肌鈣蛋白I，心臟肌鈣蛋白T，B型鈉尿肽(BNP)，BNP前體肽(proBNP)，N端前BNP(NT-proBNP)，脂蛋白相關的磷脂酶A2(Lp-PLA2)，胎盤生長因子(PlGF)，估計的腎小球濾過率(eGFR)，同型半胱氨酸(HCY)，膽鹼，缺血修飾白蛋白，可溶性⑶40配體(s⑶40L)，或髓過氧化物酶(MPO)。【文檔編號】A61P9/00GK103703373SQ201280029310【公開日】2014年4月2日申請日期:2012年4月13日優先權日:2011年4月15日【發明者】A.G.凱特魯卡,A.B.波斯特尼科夫,T.I.斯莫萊諾瓦,A.V.卡裡託諾夫,N.N.塔姆申請人:西特斯特有限公司