利用基因工程技術在家蠶體內生產重組人乳鐵蛋白的方法
2023-10-28 07:26:47 2
專利名稱：利用基因工程技術在家蠶體內生產重組人乳鐵蛋白的方法
技術領域：
本發明涉及基因工程技術、杆狀病毒基因表達系統、蛋白質的純化，尤其涉及一種利用基因工程技術在家蠶體內大量表達生產重組LF的方法。
背景技術：
人乳鐵蛋白Lactoferrin(簡寫為LF)是由人體乳腺分泌的一種具有免疫活性的蛋白質，它由711個胺基酸組成，分子量約78KDa，是人奶中重要的鐵結合性糖蛋白，初乳中LF含量約為5-7mg/ml，目前已證實LF與人的免疫機能有關，在促進鐵的吸收及抗菌消炎等方面也起重要作用。因此，利用LF具有促進鐵的代謝調節以及抗微生物，包括細菌、真菌和病毒等優良性能，美國已開發LF作為功能性食品添加劑以及作為消化管感染症及複合免疫不全者，如愛滋病、接受過化學療法、放射線療法的癌症患者等治療的新型藥劑。因此，人LF具有廣闊的應用前景。但是目前市場上LF蛋白的價格昂貴，雖然用基因工程的方法在大腸桿菌中可以生產，但在大腸桿菌中LF以包含體的形式表達，需要對其重新摺疊恢復其生物活性，使得該過程效率很低且不經濟。為了克服這個問題，其他人曾試著用酵母和腺病毒感染的哺乳動物細胞進行表達生產，但酵母的質粒轉化體不穩定而哺乳動物培養細胞生產的成本又太高。因此有必要建立一種高效經濟的生產LF的方法。
杆狀病毒表達系統是當今最有效的真核基因表達系統之一，而「家蠶-重組杆狀病毒表達系統」由於可以利用我國飼養量最大的特色經濟昆蟲—家蠶作表達載體，家蠶具有個體大、易飼養等特點，因此具有生產成本低、可規模化生產等優點，適合於生物製藥產業化水平的要求。申請人在此之前構建了一個適用於家蠶的優良表達系統HyNPV(專利號ZL01125605.2)，它具有擴大的寄主域的突出優點。這樣，可以在AcNPV的寄主細胞Sf21中構建重組病毒，然後在家蠶幼蟲中低成本、高效地生產重組蛋白。
發明內容
本發明的目的在於提供一種重組人LF在家蠶體內基因工程生產的的方法。利用申請人構建的AcNPV和BmNPV的雜交杆狀病毒HyNPV作為載體(專利號ZL01125605.2)構建了含有人LF基因的重組病毒，並利用家蠶作為宿主，表達生產重組人LF。
為了達到上述目的，本發明採用的技術方案其步驟如下1、重組人LF在家蠶體內基因工程生產的方法(1)LF基因的克隆以人乳腺組織cDNA為模板，PCR基因擴增技術獲得人LF基因，引物設計如下正向引物5′-GGATCCATGAAACTTGTCTTCCTC-3′，含有BamHI酶切位點；反向引物5′-GGATCCTTACTTCCTGAGGAATTC-3′，含有BamHI酶切位點。PCR反應的循環數、溫度和時間的設計如下一個循環，94℃模板變性50秒；30個循環，55℃退火30秒，70℃延伸2分鐘；最後1個循環，70℃延伸10分鐘；利用1％瓊脂糖凝膠電泳進行PCR產物分析，並用PCR純化試劑盒純化，獲得全長為2136bp的LF基因，隨後將LF基因克隆入3.9kb載體pCR2.1，利用雙脫氧鏈終止法在核苷酸測序儀上測序確認克隆LF基因順序正確性；(2)含有人LF基因的重組杆狀病毒的構建用限制性內切酶BamHI消化pCR2.1-LF得到LF基因片段，然後克隆入杆狀病毒轉移載體pBlueBacHisa獲得重組體pBlueBacHisa-LF；然後利用申請人構建的AcNPV和BmNPV的雜交杆狀病毒HyNPV作為載體(專利號ZL01125605.2)，通過共轉染獲得含有人LF基因的重組病毒。共轉染的方法為1μg pBlueBacHisa-LF DNA和15μg HyNPVDNA混合，並加入14μl脂質體lipofectin，最後加入滅菌蒸餾水至終體積40μl；將該混合液在室溫培育15分鐘後共轉染對數生長期的Sf 21培養細胞。先用無血清的TC-100培養基培養24小時後，換成含有10％胎牛血清的新鮮培養基，27℃培養5天，收集培養基上清作為病毒原液，用來篩選重組病毒；重組病毒通過3輪空斑篩選，最終獲得高濃度純化的病毒溶液，濃度為108pfu/ml，申請人將此重組病毒命名為HyNPV-LF；(3)家蠶體內表達和重組LF純化使用家蠶幼蟲5齡起蠶，接種上述重組病毒進行感染表達；接種前，將幼蟲浸在冰水浴中麻醉10分鐘，注射用病毒懸浮液濃度為106pfu/ml，採用皮下注射的方法，每條家蠶注射20μl，注射1小時後給桑，在23-25℃下飼養；感染後的三天內，看不到明顯的症狀，到第四天，幼蟲開始食慾減弱，漸漸地呈現出感染症狀；感染後地五天或第六天，感染的幼蟲大部分死亡，在此之前收集家蠶幼蟲。將幼蟲的血淋巴作為重組人LF純化的起始材料，使用以下方法收集血淋巴在15ml收集管的上方，將幼蟲向背面彎曲，用一隻手固定幼蟲的頭部和尾部，讓腹部和腹足伸向外邊。用石蠟膜密封的25號針頭刺破腹足收集血液，讓血液直接滴進收集管中，為了防止血液氧化變黑，預先加入1/10體積的10mmol/L二硫蘇糖醇DTT，使其終濃度為1mmol/L；由於重組蛋白N-末端帶有6×His尾巴，可以用Ni-NTA親和柱在非變性條件下進行蛋白純化；從感染的幼蟲收集的血淋巴用非變性結合緩衝液，Na3P0450mmol/L，NaCl 0.5mol/L，pH 8.0，進行稀釋；樣品隨後結合於Ni-NTA柱，最後，重組蛋白用含有250mmol/L咪唑的非變性洗脫緩衝液洗脫，通過SDS-PAGE考馬斯亮藍染色後鑑定重組蛋白，結果表明獲得的重組LF非常純一，從每頭家蠶獲得的產量高達400μg。
本發明與背景技術相比，具有的有益效果是本發明較好地解決了LF在大腸桿菌中表達需要複雜的復性操作、酵母表達中質粒轉化體不穩定和在哺乳動物培養細胞生產的成本太高的缺點，家蠶幼蟲表達重組人LF具有成本低、產量高、生物活性強的優點。本專利建立的方法可以大量生產重組人LF，在未來的醫學和臨床治療領域具有廣闊的應用前景。
具體實施例方式
1、研究材料基因工程操作工具酶和PCR擴增試劑盒購於寶Takara生物工程有限公司(大連)。人乳腺組織cDNA購自Clotech公司，TA克隆試劑盒、杆狀病毒轉移載體pBlueBacHisa、脂質體lipofectin均為Invitrogen公司產品。DNA測序試劑盒購於PE Applied Biosystems。胎牛血清FCS、昆蟲細胞系Sf21的培養基TC-100為GibcoBRL的產品。秋粘蟲細胞系Tn-5的培養基ESF921購於Expression systems。草地貪夜蛾細胞Sf21用添加10％(v/v)FCS和0.26％細菌用胰蛋白腖的TC-100培養基在27℃培養。Tn-5利用無血清的ESF921培養基於27℃瓶中培養。本試驗使用家蠶雜交種，家蠶幼蟲桑葉飼養，溫度為23～25℃。
2、工作流程重組人LF在家蠶體內基因工程生產的方法，其特徵在於(1)LF基因的克隆以人乳腺組織cDNA為模板，PCR基因擴增技術獲得人LF基因，引物設計如下正向引物5′-GGATCCATGAAACTTGTCTTCCTC-3′，含有BamHI酶切位點；反向引物5′-GGATCCTTACTTCCTGAGGAATTC-3′，含有BamHI酶切位點；PCR反應的循環數、溫度和時間的設計如下一個循環，94℃模板變性50秒；30個循環，55℃退火30秒，70℃延伸2分鐘；最後1個循環，70℃延伸10分鐘；利用1％瓊脂糖凝膠電泳進行PCR產物分析，並用PCR純化試劑盒純化，獲得全長為2136bp的LF基因，隨後將LF基因克隆入3.9kb載體pCR2.1，利用雙脫氧鏈終止法在核苷酸測序儀上測序確認克隆LF基因順序正確性；(2)含有人LF基因的重組杆狀病毒的構建用限制性內切酶BamHI消化pCR2.1-LF得到LF基因片段，然後克隆入杆狀病毒轉移載體pBlueBacHisa獲得重組體pBlueBacHisa-LF；通過共轉染在昆蟲細胞內與雜交杆狀病毒HyNPVDNA同源重組產生重組病毒，共轉染的方法為1μg pBlueBacHisa-LF DNA和15μg HyNPV DNA混合，並加入14μl脂質體lipofectin，最後加入滅菌蒸餾水至終體積40μl；將該混合液在室溫培育15分鐘後共轉染對數生長期的Sf 21培養細胞。先用無血清的TC-100培養基培養24小時後，換成含有10％胎牛血清的新鮮培養基，27℃培養5天，收集培養基上清作為病毒原液，用來篩選重組病毒；重組病毒通過3輪空斑篩選，最終獲得高濃度純化的病毒溶液，濃度為108pfu/ml，將此重組病毒命名為HyNPV-LF；(3)家蠶體內表達和重組LF純化使用家蠶幼蟲5齡起蠶，接種上述重組病毒進行感染表達；接種前，將幼蟲浸在冰水浴中麻醉10分鐘，注射用病毒懸浮液濃度為106pfu/ml，採用皮下注射的方法，每條家蠶注射20μl，注射1小時後給桑，在23-25℃下飼養；感染後的三天內，看不到明顯的症狀，到第四天，幼蟲開始食慾減弱，漸漸地呈現出感染症狀；感染後地五天或第六天，感染的幼蟲大部分死亡，在此之前收集家蠶幼蟲。將幼蟲的血淋巴作為重組人LF純化的起始材料，使用以下方法收集血淋巴在15ml收集管的上方，將幼蟲向背面彎曲，用一隻手固定幼蟲的頭部和尾部，讓腹部和腹足伸向外邊。用石蠟膜密封的25號針頭刺破腹足收集血液，讓血液直接滴進收集管中，為了防止血液氧化變黑，預先加入1/10體積的10mmol/L二硫蘇糖醇DTT，使其終濃度為1mmol/L；由於重組蛋白N-末端帶有6×His尾巴，可以用Ni-NTA親和柱在非變性條件下進行蛋白純化；從感染的幼蟲收集的血淋巴用非變性結合緩衝液，Na3PO450mmol/L，NaCl 0.5mol/L，pH 8.0，進行稀釋；樣品隨後結合於Ni-NTA柱，最後，重組蛋白用含有250mmol/L咪唑的非變性洗脫緩衝液洗脫，通過SDS-PAGE考馬斯亮藍染色後鑑定重組蛋白，結果表明獲得的重組LF非常純一，從每頭家蠶獲得的產量高達400μg。
權利要求
1.利用基因工程技術在家蠶體內生產重組人乳鐵蛋白的方法，其特徵在於(1)LF基因的克隆以人乳腺組織cDNA為模板，PCR基因擴增技術獲得人LF基因，引物設計如下正向引物5′-GGATCCATGAAACTTGTCTTCCTC-3′，含有BamHI酶切位點；反向引物5′-GGATCCTTACTTCCTGAGGAATTC-3′，含有BamHI酶切位點；PCR反應的循環數、溫度和時間的設計如下一個循環，94℃模板變性50秒；30個循環，55℃退火30秒，70℃延伸2分鐘；最後1個循環，70℃延伸10分鐘；利用1％瓊脂糖凝膠電泳進行PCR產物分析，並用PCR純化試劑盒純化，獲得全長為2136bp的LF基因，隨後將LF基因克隆入3.9kb載體pCR2.1，利用雙脫氧鏈終止法在核苷酸測序儀上測序確認克隆LF基因順序正確性；(2)含有人LF基因的重組杆狀病毒的構建用限制性內切酶BamHI消化pCR2.1-LF得到LF基因片段，然後克隆入杆狀病毒轉移載體pBlueBacHisa獲得重組體pBlueBacHisa-LF；通過共轉染在昆蟲細胞內與構建的雜交杆狀病毒HyNPV DNA發生同源重組產生重組病毒，共轉染的方法為1μgpBlueBacHisa-LF DNA和15μg HyNPV DNA混合，並加入14μl脂質體lipofectin，最後加入滅菌蒸餾水至終體積40μl；將該混合液在室溫培育15分鐘後共轉染對數生長期的Sf21培養細胞，先用無血清的TC-100培養基培養24小時後，換成含有10％胎牛血清的新鮮培養基，27℃培養5天，收集培養基上清作為病毒原液，用來篩選重組病毒；重組病毒通過3輪空斑篩選，最終獲得高濃度純化的病毒溶液，濃度為108pfu/ml，將此重組病毒命名為HyNPV-LF；(3)家蠶體內表達和重組LF純化使用家蠶幼蟲5齡起蠶，接種上述重組病毒HyNPV-LF進行感染表達；接種前，將幼蟲浸在冰水浴中麻醉10分鐘，注射用病毒懸浮液濃度為106pfu/ml，採用皮下注射的方法，每條家蠶注射20μl，注射1小時後給桑，在23-25℃下飼養；感染後的三天內，看不到明顯的症狀，到第四天，幼蟲開始食慾減弱，漸漸地呈現出感染症狀；感染後地五天或第六天，感染的幼蟲大部分死亡，在此之前收集家蠶幼蟲；將幼蟲的血淋巴作為重組人LF純化的起始材料，使用以下方法收集血淋巴在15ml收集管的上方，將幼蟲向背面彎曲，用一隻手固定幼蟲的頭部和尾部，讓腹部和腹足伸向外邊；用石蠟膜密封的25號針頭刺破腹足收集血液，讓血液直接滴進收集管中，為了防止血液氧化變黑，預先加入1/10體積的10mmol/L二硫蘇糖醇DTT，使其終濃度為1mmol/L；由於重組蛋白N-末端帶有6×His尾巴，可以用Ni-NTA親和柱在非變性條件下進行蛋白純化；從感染的幼蟲收集的血淋巴用非變性結合緩衝液，Na3PO450mmol/L，NaCl 0.5mol/L，pH8.0，進行稀釋；樣品隨後結合於Ni-NTA柱，最後，重組蛋白用含有250mmol/L咪唑的非變性洗脫緩衝液洗脫，通過SDS-PAGE考馬斯亮藍染色後鑑定重組蛋白，結果表明獲得的重組LF非常純一，從每頭家蠶獲得的產量為400μg。
全文摘要
本發明公開了一種利用基因工程技術在家蠶體內生產重組人乳鐵蛋白的方法。利用申請人構建的AcNPV和BmNPV的雜交杆狀病毒HyNPV作為載體，構建了含有人LF基因的重組病毒。利用家蠶作為重組病毒的宿主，表達、生產了重組人LF。解決了LF在大腸桿菌中表達需要複雜的復性操作、酵母表達中質粒轉化體不穩定和在哺乳動物培養細胞生產的成本太高的缺點。家蠶幼蟲體內表達的重組人LF大部分分泌在家蠶血淋巴中，非常有利於蛋白質的快速提取，利用親和層析法純化了重組的LF，從每頭家蠶獲得的產量高達400μg。利用基因工程技術用家蠶作為表達載體可以大量生產重組LF，為它在醫學和治療領域上的應用開闢了廣闊的前景。
文檔編號C12N15/866GK1654647SQ20051004896
公開日2005年8月17日 申請日期2005年1月13日 優先權日2005年1月13日
發明者吳小鋒, 姚慧鵬, 曹翠平 申請人:浙江大學