一種生產人表皮生長因子(egf)的製備方法

2023-10-09 14:16:34

專利名稱：一種生產人表皮生長因子(egf)的製備方法
技術領域：
本發明涉及一種生產人表皮生長因子(EGF)的製備方法，屬生物工程領域。
背景技術：
1962 年，美國 Dr. Manley Cohen 博士與義大利科學家(Rita Levi-Montalcini) 教授發現了決定皮膚年齡的「表皮生長因子」EGF(Epidermal Growth lector)，他們因此獲得了世界科學的最高獎之一——諾貝爾生理學獎。表皮細胞生長因子是人體內的一種活性物質，由53個氨基組成的活細胞，藉由刺激表皮細胞生長因子受體之酪氨酸磷酸化，達到修補增生肌膚表層細胞，對受傷、受損之表皮肌膚擁有絕佳之療效。其最大特點是能夠促進細胞的增殖分化，從而以新生的細胞代替衰老和死亡的細胞.EGF還能止血，並具有加速皮膚和黏膜創傷癒合，消炎鎮痛，防止潰瘍的功效.EGF的穩定性能極好，在常溫下不易失散流動，能與人體內各種酶形成良好的協調效應。最初的EGF主要被運用於醫學領域，主要用於促進受損表皮的修復與再生，如治療燒傷、燙傷、促進傷口癒合、修復腸胃道、肝臟和眼角膜的損傷等，功效十分顯著。儘管目前已有一些EGF的基因工程生產方法，但這些方法均存在著發酵液中產物濃度低，提取工藝複雜，操作成本高及收率低等缺點，因此，至今為止，尚未有一個成熟的工業化發酵生產工藝。

發明內容
本發明的目的是提供一種方法簡單、不受環境影響、周期短的用基因工程大腸桿菌生產人表皮生長因子(EGF)的方法。為了達到上述目的，本發明採取下列措施一種生產人表皮生長因子(EGF)的製備方法，生產步驟如下(1)工程菌發酵從保存的菌種管中挑取單菌落接入種子培養基中，同時加入氨苄青黴素，使其在培養基中達到一定的濃度，經搖床培養，按比例的接種量將前面的培養液再次接入種子培養基中，同時加入氨苄青黴素，使其繼續在搖床培養，之後，再按比例的接種量將活化的種子液加入到發酵培養基中培養，然後溫度誘導，繼續培養一定時間。人表皮生長因子(EGF) 表達於菌種中。(2)擴張床吸附用冷凍離心機將發酵液離心，棄上清液保留沉澱保存備用。取適量沉澱，用數倍量的緩衝液溶解，經超聲處理若干個循環，再用冷凍離心機將緩衝液離心，棄上清液，取沉澱用裂解液溶解，再離心，收集上清液，用層析系統將該上清液加入擴張床中，用緩衝液以相同速度洗滌至波長為^Onm時紫外吸收峰值為零，再用緩衝液以一定比例洗脫，收集含人表皮生長因子(EGF)的洗脫峰，再將洗脫峰液用復性液復性，用層析系統將復性液液加入擴張床中，用精氨酸緩衝液以相同速度洗滌至波長為280nm時紫外吸收峰值為零，再用氯化鈉和精氨酸緩衝液以一定比例洗脫，收集含人表皮生長因子(EGF)的洗脫峰，洗脫液於在一定溫度條件下保存備用。(3)、凝膠分離用層析系統將洗脫液加入到凝膠層析柱中，然後將精氨酸緩衝液洗脫直至出峰完畢，用紫外檢測檢測儀在波長^Onm下進行檢測，收集保留吸收峰，收集原液。0)、冷凍升華乾燥將收集液冷凍升華乾燥，得白色乾粉狀人表皮生長因子(EGF)。
具體實施例方式實施例一(1)工程菌發酵從_70°C保存的菌種管中挑取單菌落接入5_15ml種子培養基中，同時加入氨苄青黴素，使其在培養基中的濃度達到50-200mg/mlJ8-32°C，150-250rpm搖床培養8_12小時，按1-8%接種量將前面的培養液再次接入種子培養基中，同時加入氨苄青黴素，使其在 50-200mg/mlJ8-32°C，150-250rpm搖床培養8-12小時，再按1-8%接種量將活化的種子液加入到發酵培養基中，29-31°C，160-240rpm，PH值維持7.0，培養9-11小時，然後溫度誘導， 繼續培養2-8小時。人表皮生長因子(EGF)表達於菌種中。(2)擴張床吸附用冷凍離心機將發酵液與2-18°C條件下以6000-12000rpm的速度離心10_30min， 棄上清液保留沉澱於2-18°C條件下保存備用。取適量沉澱，用10倍量Tris-Hcl緩衝液溶解，700-1800W超聲處理10- 個循環，每個循環35min，再用冷凍離心機將緩衝液與2_18°C 條件下以6000-12000rpm的速度離心10-30min，棄上清液，取沉澱用15-45倍裂解液溶解， 6000-12000rpm的速度離心30min，收集上清液，用層析系統將100_800ml的該上清液以 1. 5-8. 5ml/min速度加入source 30Q擴張床中，用20mMTris緩衝液以相同速度洗滌至波長為^Onm時紫外吸收峰值為零，再用含IM氯化鈉20mMTris緩衝液以7%比例洗脫，收集含人表皮生長因子(EGF)的洗脫峰，再將洗脫峰液用復性液復性，用層析系統將1500-3500ml 的復性液液以4-lOml/min速度加入source 30Q擴張床中，用15mM精氨酸緩衝液以相同速度洗滌至波長為^Onm時紫外吸收峰值為零，再用含0. 75M氯化鈉15mM精氨酸緩衝液以 10%比例洗脫，收集含人表皮生長因子(EGF)的洗脫峰，洗脫液於2-18°C條件下保存備用。(3)、凝膠分離用層析系統將15-30ml上面洗脫液以4-8ml/min的速度加到Superdex30凝膠層析柱中，然後將15mM精氨酸緩衝液以4-8ml/min的速度洗脫直至出峰完畢，用紫外檢測檢測儀在波長^Onm下進行檢測，收集保留吸收峰，收集體積為220480ml。0)、冷凍升華乾燥將收集液於-35 °C至_42°C下冷凍升華乾燥，得白色乾粉狀人表皮生長因子 (EGF)。實施例二 (1)工程菌發酵從_70°C保存的菌種管中挑取單菌落接入IOml種子培養基中，同時加入氨苄青黴素，使其在培養基中的濃度達到100mg/ml，30°C，200rpm搖床培養10小時，按5 %接種量將前面的培養液再次接入種子培養基中，同時加入氨苄青黴素，使其在100mg/ml，3(TC， 200rpm搖床培養10小時，再按5 %接種量將活化的種子液加入到發酵培養基中，30°C， 200rpm, PH值維持7. 0，培養10小時，然後溫度誘導，繼續培養4小時。人表皮生長因子 (EGF)表達於菌種中。(2)擴張床吸附用冷凍離心機將發酵液與4°C條件下以IOOOOrpm的速度離心30min，棄上清液保留沉澱於4°C條件下保存備用。取適量沉澱，用10倍量Tris-Hcl緩衝液溶解，900w超聲處理25個循環，每個循環35min，再用冷凍離心機將緩衝液與4°C條件下以IOOOOrpm的速度離心30min，棄上清液，取沉澱用20倍裂解液溶解，IOOOOrpm的速度離心30min，收集上清液，用層析系統將200ml的該上清液以;3ml/min速度加入source 30Q擴張床中，用 20mMTris緩衝液以相同速度洗滌至波長為280nm時紫外吸收峰值為零，再用含IM氯化鈉 20mMTris緩衝液以7%比例洗脫，收集含人表皮生長因子(EGF)的洗脫峰，再將洗脫峰液用復性液復性，用層析系統將2000ml的復性液液以Sml/min速度加入source 30Q擴張床中， 用15mM精氨酸緩衝液以相同速度洗滌至波長為^Onm時紫外吸收峰值為零，再用含0. 75M 氯化鈉15mM精氨酸緩衝液以10%比例洗脫，收集含人表皮生長因子(EGF)的洗脫峰，洗脫液於4°C條件下保存備用。(3)、凝膠分離用層析系統將25ml上面洗脫液以6. 5ml/min的速度加到Superdex30凝膠層析柱中，然後將15mM精氨酸緩衝液以6. 5ml/min的速度洗脫直至出峰完畢，用紫外檢測檢測儀在波長^Onm下進行檢測，收集保留吸收峰，收集體積為250ml。0)、冷凍升華乾燥將收集液於-40°C下冷凍升華乾燥，得白色乾粉狀人表皮生長因子(EGF)。利用上述方法製得的人表皮生長因子(EGF)，具有發酵液中產物濃度高(大於 100mg/L，較以往的技術提高一倍)，提取工藝簡單(只需要3步層析操作，較之前工藝簡化丄倍)，操作成本低及純度高(90 %以上)，是一個較為成熟的工業化發酵生產工藝，經濟效益十分顯著。
權利要求
1.一種生產人表皮生長因子(EGF)的製備方法，其特徵在於它的生產步驟如下(1)工程菌發酵從保存的菌種管中挑取單菌落接入種子培養基中，同時加入氨苄青黴素，使其在培養基中達到一定的濃度，經搖床培養，按比例的接種量將前面的培養液再次接入種子培養基中，同時加入氨苄青黴素，使其繼續在搖床培養，之後，再按比例的接種量將活化的種子液加入到發酵培養基中培養，然後溫度誘導，繼續培養一定時間。人表皮生長因子(EGF)表達於菌種中。(2)擴張床吸附用冷凍離心機將發酵液離心，棄上清液保留沉澱保存備用。取適量沉澱，用數倍量的緩衝液溶解，經超聲處理若干個循環，再用冷凍離心機將緩衝液離心，棄上清液，取沉澱用裂解液溶解，再離心，收集上清液，用層析系統將該上清液加入擴張床中，用緩衝液以相同速度洗滌至波長為^Onm時紫外吸收峰值為零，再用緩衝液以一定比例洗脫，收集含人表皮生長因子(EGF)的洗脫峰，再將洗脫峰液用復性液復性，用層析系統將復性液液加入擴張床中，用精氨酸緩衝液以相同速度洗滌至波長為280nm時紫外吸收峰值為零，再用氯化鈉和精氨酸緩衝液以一定比例洗脫，收集含人表皮生長因子(EGF)的洗脫峰，洗脫液於在一定溫度條件下保存備用。(3)、凝膠分離用層析系統將洗脫液加入到凝膠層析柱中，然後將精氨酸緩衝液洗脫直至出峰完畢， 用紫外檢測檢測儀在波長^Onm下進行檢測，收集保留吸收峰，收集原液。G)、冷凍升華乾燥將收集液冷凍升華乾燥，得白色於粉狀人表皮生長因子(EGF)。
2.根據權利要求1所述的一種生產人表皮生長因子(EGF)的製備方法，其特徵在於它的生產步驟如下(1)工程菌發酵從_70°C保存的菌種管中挑取單菌落接入5-15ml種子培養基中，同時加入氨苄青黴素，使其在培養基中的濃度達到50-200mg/mlJ8-32°C，150-250rpm搖床培養8_12小時， 按1-8%接種量將前面的培養液再次接入種子培養基中，同時加入氨苄青黴素，使其在 50-200mg/mlJ8-32°C，150-250rpm搖床培養8-12小時，再按1-8%接種量將活化的種子液加入到發酵培養基中，29-31°C，160-240rpm，PH值維持7. 0，培養9-11小時，然後溫度誘導，繼續培養2-8小時。人表皮生長因子(EGF)表達於菌種中。(2)擴張床吸附用冷凍離心機將發酵液與2-18°C條件下以6000-12000rpm的速度離心10-30min，棄上清液保留沉澱於2-18°C條件下保存備用。取適量沉澱，用10倍量Tris-Hcl緩衝液溶解， 700-1800w超聲處理10- 個循環，每個循環35min，再用冷凍離心機將緩衝液與2_18°C條件下以6000-12000rpm的速度離心10-30min，棄上清液，取沉澱用15-45倍裂解液溶解， 6000-12000rpm的速度離心30min，收集上清液，用層析系統將100_800ml的該上清液以 1. 5-8. 5ml/min速度加入source 30Q擴張床中，用20mMTris緩衝液以相同速度洗滌至波長為^Onm時紫外吸收峰值為零，再用含IM氯化鈉20mMTris緩衝液以7%比例洗脫，收集含人表皮生長因子(EGF)的洗脫峰，再將洗脫峰液用復性液復性，用層析系統將1500-3500ml的復性液液以4-lOml/min速度加入source 30Q擴張床中，用15mM精氨酸緩衝液以相同速度洗滌至波長為280nm時紫外吸收峰值為零，再用含0. 75M氯化鈉15mM精氨酸緩衝液以 10%比例洗脫，收集含人表皮生長因子(EGF)的洗脫峰，洗脫液於2-18°C條件下保存備用。(3)、凝膠分離用層析系統將15-30ml上面洗脫液以4-8ml/min的速度加到SuperdeX30凝膠層析柱中，然後將15mM精氨酸緩衝液以4-8ml/min的速度洗脫直至出峰完畢，用紫外檢測檢測儀在波長^Onm下進行檢測，收集保留吸收峰，收集體積為220480ml。G)、冷凍升華乾燥將收集液於_35°C至_42°C下冷凍升華乾燥，得白色乾粉狀人表皮生長因子(EGF)。
3.根據權利要求1所述的一種生產人表皮生長因子(EGF)的製備方法，其特徵在於它的生產步驟如下(1)工程菌發酵從_70°C保存的菌種管中挑取單菌落接入IOml種子培養基中，同時加入氨苄青黴素， 使其在培養基中的濃度達到100mg/ml，30°C，200rpm搖床培養10小時，按5%接種量將前面的培養液再次接入種子培養基中，同時加入氨苄青黴素，使其在100mg/ml，30°C，200rpm搖床培養10小時，再按5%接種量將活化的種子液加入到發酵培養基中，30°C，200rpm，PH值維持7.0，培養10小時，然後溫度誘導，繼續培養4小時。人表皮生長因子(EGF)表達於菌種中。(2)擴張床吸附用冷凍離心機將發酵液與4°C條件下以IOOOOrpm的速度離心30min，棄上清液保留沉澱於4°C條件下保存備用。取適量沉澱，用10倍量Tris-Hcl緩衝液溶解，900w超聲處理 25個循環，每個循環35min，再用冷凍離心機將緩衝液與4°C條件下以IOOOOrpm的速度離心 30min,棄上清液，取沉澱用20倍裂解液溶解，IOOOOrpm的速度離心30min，收集上清液，用層析系統將200ml的該上清液以3ml/min速度加入source 30Q擴張床中，用20mMTris緩衝液以相同速度洗滌至波長為^Onm時紫外吸收峰值為零，再用含IM氯化鈉20mMTris緩衝液以7%比例洗脫，收集含人表皮生長因子(EGF)的洗脫峰，再將洗脫峰液用復性液復性， 用層析系統將2000ml的復性液液以8ml/min速度加入source 30Q擴張床中，用15mM精氨酸緩衝液以相同速度洗滌至波長為280nm時紫外吸收峰值為零，再用含0. 75M氯化鈉15mM 精氨酸緩衝液以10%比例洗脫，收集含人表皮生長因子(EGF)的洗脫峰，洗脫液於4°C條件下保存備用。(3)、凝膠分離用層析系統將25ml上面洗脫液以6. 5ml/min的速度加到Superdex30凝膠層析柱中， 然後將15mM精氨酸緩衝液以6. 5ml/min的速度洗脫直至出峰完畢，用紫外檢測檢測儀在波長^Onm下進行檢測，收集保留吸收峰，收集體積為250ml。G)、冷凍升華乾燥將收集液於-40°C下冷凍升華乾燥，得白色乾粉狀人表皮生長因子(EGF)。
4.根據權利要求1或2所述的一種生產人表皮生長因子(EGF)的製備方法，其特徵在於擴張床吸附過程中，含IM氯化鈉20mMTris緩衝液為洗脫液洗脫時所佔比例為7%，含 0. 75M氯化鈉15mM精氨酸為洗脫液洗脫時所佔比例為10%。
5.根據權利要求1或2所述的一種生產人表皮生長因子(EGF)的製備方法，其特徵在於所用裂解液為20mM三羥甲基氨基甲烷、8M尿素、0. 1% β -巰基乙醇所組成的緩衝液。
6.根據權利要求1或2所述的一種生產人表皮生長因子(EGF)的製備方法，其特徵在於所用復性液為50mM精氨酸、IOmM氯化鈉、10%甘油所組成的緩衝液。
7.根據權利要求1或2所述的一種生產人表皮生長因子(EGF)的製備方法，其特徵在於冷凍乾燥收集液中所添加輔料為注射用甘露醇和海藻糖。
8.根據權利要求1或2所述的一種生產人表皮生長因子(EGF)的製備方法，其特徵在於其既可用於化妝品也可用於燒燙傷患者，對I型糖尿病患者，尤其是糖尿病足壞疽、糖尿病引發的眼肌都有很好的作用效果。
全文摘要
本發明公開了一種生產人表皮生長因子(EGF)的製備方法，它是採用工程菌發酵從保存的菌種管中挑取單菌落接入種子培養基中加入氨苄青黴素，搖床培養；擴張床吸附，用冷凍離心機將發酵液離心，棄發酵液保留沉澱，超聲處理後離心，入擴張床，洗脫，收集含人表皮生長因子(EGF)的洗脫峰，洗脫液保存備用；凝膠分離，用層析系統將洗脫液加到凝膠層析柱中，緩衝洗脫液，保留吸收峰；冷凍升華乾燥工藝獲得，本發明具有方法簡單、產物濃度高、操作成本低、收率高、提取工藝簡單的優點。
文檔編號A61P3/10GK102212596SQ20101013743
公開日2011年10月12日 申請日期2010年4月1日 優先權日2010年4月1日
發明者孫民富 申請人:孫民富