血吸蟲抗獨特型抗體NP30嵌合Fab抗體片段及製備方法、應用的製作方法

2023-10-09 07:29:44 1

專利名稱：血吸蟲抗獨特型抗體NP30嵌合Fab抗體片段及製備方法、應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及的是一種血吸蟲抗獨特型抗體NP30嵌合Fab抗體片段及製備方法、應用，是 利用基因重組技術，對血吸蟲抗獨特型抗體NP30進行改造，將鼠源性抗體的可變區與人IgG, 的CH,、Cic重組，以降低抗獨特型抗體的鼠源性成分，用於血吸蟲病的免疫保護及急性血吸 蟲病的治療等，本發明涉及基因工程技術和製備免疫治療藥物領域。
背景技術：
血吸蟲病是繼瘧疾之後的全球第二大寄生蟲病，據統計，全球有76個國家6億左右的人 口受血吸蟲感染威脅，約有2億人感染血吸蟲，全球每年估計至少有20萬人死於血吸蟲病， 寄生於人體的血吸蟲主要有日本血吸蟲，埃及血吸蟲和曼氏血吸蟲三種。流行於我國的曰本 血吸蟲寄生於人體引起的疾病，稱為日本血吸蟲病。
自1984年iffl0提出"以疾病控制代替以往的傳播阻斷"新的防治策略以來，建議血吸蟲 病防治策略應著眼於人及人的行為，採用以大規模和反覆化療為主的防治措施。安全有效、 價格低廉的吡喹酮的問世使得大規模的化療成為可能。1992-2001年，世行貸款中國血吸蟲 病控制項目中，執行以化療為主的幹預措施。隨後的血吸蟲病防治規劃中，化學藥物治療已 成為傳染源控制的一個常規措施。大規模的化療及滅螺、環境改造等綜合措施的實施使得我 國血吸蟲病防治取得了顯著的成果。但近幾年來，由於生物、自然和社會、經濟等因素變化 較大，我國血吸蟲病疫情回升顯著，表現為血吸蟲病患病人數增多，急性感染人數呈上升趨 勢，局部地區釘螺擴散明顯，感染性釘螺分布範圍逐漸擴大，部分已經達到傳播控制標準和 傳播阻斷標準的地區疫情嚴重回升。
吡喹酮，是目前唯一一種可用於治療埃及血吸蟲(最常見的種類)、日本血吸蟲、湄公血 吸蟲和間插血吸蟲以及所謂的次要血吸蟲感染的藥物。對於曼氏血吸蟲感染的治療，奧沙尼 喹雖然商業上可提供，但是昂貴的價格限制了它的使用，而且不易獲得。因此，吡喹酮實際上 是2億血吸蟲感染者唯一可用的藥物。理論和實踐都強烈提示，任何抗感染化合物實際上不 可避免的都會有藥物抵抗現象。如果抗性降低了吡喹酮的有效性,開發一個適當的代替藥物將 要花上幾年的時間。考慮到每年需要使用幾百萬劑吡喹酮，這就提高了抗藥性發生的危險。 因此，迫切需要尋找開發新的抗血吸蟲藥物。隨著現代生物技術的迅猛發展，運用功能基因
組學、蛋白質組學、生物信息學等現代生化與分子生物學技術，結合基因工程、蛋白質工程、 細胞工程等技術，使得生物技術藥物研發高潮迭起。治療性抗體成熱點抗體藥物是以細胞工 程技術和基因工程技術為主體的抗體工程技術製備的藥物，其在感染、心血管疾病、自身免 疫性疾病、腫瘤治療中有巨大的潛力與應用前景。當前，治療性抗體藥物研發己成為生物技 術藥物領域的熱點，而抗體藥物作用靶點的選擇性、抗體藥物的人源化、小型化和高效化也 是今後的研究重點。
Olds根據抗獨特型抗體的免疫調節作用，將抗獨特型抗體用於曼氏血吸蟲急性感染的治 療，研究結果表明抗獨特型抗體可降低急性蟲卵肉芽腫反應和急性血吸蟲感染的死亡率，提 示抗獨特型抗體有可能用於急性血吸蟲感染的治療。NP30為我室管曉虹教授等建立的一株曰 本血吸蟲抗獨特型抗體，為腸相關抗原(GAA)的內影像抗獨特型抗體，其抗體同型為IgM。 對NP30的一系列研究表明NP30對蟲卵肉芽腫的形成具有致敏作用，對感染宿主(昆明種小鼠、 C57BL/6小鼠和山羊)具有較好的免疫保護作用(減蟲率分別為50. 46%、 41. 67%、 42. 78%); 用NP30主動免疫小鼠具有抗雌蟲生殖產卵和抗卵胚發育的雙重功效，另外還對血吸蟲病肉芽 腫和肝纖維化有明顯的負調節作用。結果表明NP30抗獨特型抗體是一個非常有應用前景的免 疫保護及治療用抗體分子。但由於NP30抗獨特型抗體為鼠源性單克隆抗體，其自身攜帶的免 疫原性使得作用於人體時可能會引起人抗鼠免疫反應(HAMA)和過敏反應，且在人體血清中 半衰期很短，易於被清除，這就限制了NP30的體內研究。

發明內容
本發明目的是針對述不足之處提供一種血吸蟲抗獨特型抗體NP30嵌合Fab抗體片段及制 備方法、應用利用基因重組技術對一株鼠源性的血吸蟲抗獨特型抗體NP30進行改造，即將鼠 源性單克隆抗體NP30的重鏈可變區、輕鏈可變區分別和人IgG抗體的CIi和Cic片段重組，再通 過重疊延伸PCR擴增到一個全長為l. 5kb左右的NP30嵌合Fab抗體片段的核苷酸片段。嵌合Fab 抗體片段的核苷酸片段和原核表達質粒pComb3XSS分別用Sfil限制性內切酶酶切後進行連接， 構建嵌合Fab片段的原核表達載體，轉入大腸桿菌T0P10F'後誘導表達嵌合的Fab抗體片段，其 中嵌合Fd段分子量約為30KD，嵌合L鏈分子量約為26KD，兩者通過鏈間二硫鍵連接組成嵌合的 Fab抗體片段。該蛋白保持了鼠源性NP30的抗原特異性，可用於血吸蟲病免疫保護及急性血吸 蟲病的治療。
血吸蟲抗獨特型抗體NP30嵌合Fab抗體片段及製備方法是採取以下方案實現 日本血吸蟲抗獨特型抗體NP30的嵌合Fab抗體片段，即鼠源性抗獨特型抗體NP30的重鏈 和輕鏈可變區與人IgG,的重鏈部分恆定區(CH》及輕鏈恆定區(Cic )進行重組形成的融合 蛋白；鼠源性抗體NP30的輕鏈可變區與人IgG,的輕鏈恆定區C K重組的嵌合L鏈及鼠源性抗
體NP30的重鏈可變區VH與人IgCTl的CH,重組的嵌合Fd段，兩者中間通過前導序列pelB連 接，嵌合Fd段、L鏈分泌到細菌周質腔時前導序列pelB被剪切，兩者通過鏈間二硫鍵連接 構成嵌合Fab抗體片段；嵌合L鏈的胺基酸序列為-
GluAsnLeuLeuThrGinSerProAlalieMetSerAlaSerProGlyGluLysValThrMet
ThrCysSerAlaSerSerSerValSerTyrValTyrTrpTyrLeuGinLysProGlySerSer
ProArgLeuLeulieTyrAspThrSerAsnLeuAlaSerGlyValProValArgPheSerGly
SerGlySerGlyThrSerTyrSerLeuThrlieSerArgMetGluAlaGluAspAlaAlaThr
TyrTyrCysGinGinTrpThrSerTyrProPheThrPheGlySerGlyThrCysLeuGluLeu
LysArgThrValAlaAlaProSerValPheliePheProProSerAspGluGinLeuLysSer
GlyThrAlaSerValValCysLeuLeuAsnAsnPheTyrProArgGluAlaLysValGinTrp
LysValAspAsnAlaLeuGinSerGlyAsnSerGinGluSerValThrGluGinAspSerLys
AspSerThrTyrSerLeuSerSerThrLeuThrLeuSerCysAlaAspTyrGluLysHisLys
ValTyrAlaCysGluValThrHisGinGlyLeuSerSerProValThrLysSerPheAsnArg
Gly Glu Cys ;
嵌合Fd段的胺基酸序列為:
GinValGinLeuValGluSerGlyProGluLeuLysProGlyGluThrValArglieSer
CysLysAlaSerGlyTyrThrPheThrThrAlaGlyMetGinTrpValGinLysMetProGly
LysGlyLeuLysTrplieGlyTrplieAsnThrHisSerGlyValProLysTyrAlaGluAsp
PheLysGlyArgPheAlaPheSerLeuGluThrSerAlaSerThrAlaTyrLeuGinlieSer
AsnteuLysAsnGluAspThrAlaThrTyrPheCysAlaArgSerArgAspTyrAlaMetAsp
TyrTrpGlyGinGlyThrThrValThrValSerSerAlaSerThrLysGlyProSerValPhe
ProLeuAlaProSerSerLysSerThrSerGlyGlyThrAlaAlaLeuGlyCysLeuValLys
AspTyrPheProGluProValThrValSerTrpAsnSerGlyAlaLeuThrSerGlyValHis
ThrPheProAlaValLeuGinSerSerGlyLeuTyrSerLeuSerSerValValThrValPro
SerSerSerLeuGlyThrGinThrTyrlieCysAsnValAsnHisLysProSerAsnThrLys
ValAspLysLysAla GluProLysSerCysAspLysThrSerGlyGinAlaGlyGinHisHis
His His His His Gly Ala Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Ser 。
應用抗獨特型抗體NP30嵌合Fab片段的製備方法採取如下方法和歩驟實現: 1)抗體可變區基因片段的擴增及驗證
鼠源性抗獨特型抗體NP30雜交瘤細胞培養至對數生長期，Trizol-氯仿-異丙醇法抽提 細胞總RNA;以總RNA中的mRNA為模板，以0ligodLs為引物，反轉錄擴增獲得單鏈cDNA。
設計鼠源性抗獨特型抗體NP30的重鏈可變區(VH)、輕鏈可變區(VL)的擴增引物，分 別擴增VH 、 VL片段，輕鏈可變區(VL )的上遊引物為VLF : 5 '-GGGCCCAGGCGGCCGAGAATCTGCTCACCCAGTCTCC-3', 下 遊 引 物 為 VLR : 5'-6^6^Mfi471 6T6^6tOC^ 77T6TTTCAGTTCCAGCTTGGTC03'，在VLF的5'端引入了 Sfil 的酶切識別位點即下劃線部分序列，VLR的5'端引入了與人IgG,的C k上遊引物5'端互補的 24個鹼基即斜體部分序列，以利於NP30的VL與人IgG,的CK片段的重疊PCR擴增；重鏈可 變區(VH)的上遊引物為VHF: 5'-"776^(X^a:A^076^aCAGGTACAGCTGGTGGAGTCTG-3',下 遊引物為VHR: 5'-(X47W^Or7T^T6^^7CTGAGGAGACAGTGACTGTGG-3'，在VHF的5'端引入 了和人Igd的Ck下遊引物互補的21個鹼基序列即斜體部分序列，V服的5'端引入了和人 Igd的C仏上遊引物互補的21個鹼基序列，即斜體部分，以利於NP30的VH與人IgG,的CH, 片段的重疊PCR擴增。
分別以反轉錄擴增的cDNA為模板，用引物VHF、 VHR擴增鼠源性抗獨特型抗體NP30的 VH基因片段，用引物VLF、 VLR擴增鼠源性抗獨特型抗體NP30的VL基因片段。擴增條件均 為95。C 4分鐘；95°C 30秒、56°C 30秒、72°C 30秒，30個循環；72。C延伸10分鐘。瓊脂 糖凝膠電泳，膠回收純化擴增基因片段，VH、 VL PCR膠回收純化產物分別與pMD-18T載體進 行TA連接。連接產物轉化大腸桿菌XL1-Blue,塗布含氨苄青黴素(100|_ig/ml)、四環素 (30pg/ml)的LB平板，置37'C12-16h。次日隨機挑取轉化菌及空質粒轉化對照菌，37'C搖 菌5小時後分別用VH、 VL基因片段的上下遊特異引物對菌液進行PCR鑑定，含有插入VH基 因片段質粒的菌株擴增出一條393bp左右的條帶，含有插入VL基因片段質粒的菌株擴增出一 條359bp左右的條帶。菌液PCR驗證擴增出大小正確條帶的菌液送生物公司進行測序。其中 VL的核苷酸序列為
GAG AAT CTG CTC ACC CAG TCT CCA GCA ATC ATG TCT GCA TCT CCA GGG GAG AAG GTC ACC ATG ACC TGC AGT GCC AGC TCA AGT GTT AGT TAC GTT TAC TGG TAC CTG CAG AAG CCA GGA TCC TCC CCC AGA CTC CTG ATT TAT GAC ACA TCC AAC CTG GCT TCT GGA GTC CCT GTT CGC TTC AGT GGC AGT GGG TCT GGG ACC TCT TAC TCT CTC ACA ATC AGC CGA ATG GAG GCT GAA GAT GCT GCC ACT TAT TAC TGC CAG CAG TGG ACT AGT TAC CCA TTC ACG TTC GGC TCG GGG ACC AAG CTG GAA CTG AAA
VH的核苷酸序列為
CAG GTA CAG CTG GTG GAG TCT GGA CCT GAG CTG AAG AAG CCT GGA GAG ACA GTC AGG ATC TCCTGC AAG GCT TCT GGG TAT ACC TTC ACA ACT GCT GGA ATG CAG TGG GTG CAA AAG ATG CCA GGA AAG GGT TTG AAG TGG ATT GGC TGG ATA AAC ACC CAC TCT GGA GTG CCA AAA TAT GCA GAA GAC TTC AAG GGA CGG TTT GCC TTC TCT TTG GAA ACC TCT GCC AGC ACT GCA TAT TTA CAG ATA AGC AAC CTC AAA AAT GAG GAC ACG GCT ACG TAT TTC TGT GCG AGA TCA AGG GAC TAT GCT ATG GAC TAC TGG GGT CAA GGA ACC ACA GTC ACT GTC TCC TCA 2)嵌合Fab片段的擴增-
(1) 人IgCn抗體的CH,和ck段的擴增
以質粒pComb3XTT為模板，分別擴增人Igd抗體的Ck和CH,核苷酸片段；Ck段的上遊 引物為C k F: 5'-CGAACTGTGGCTGCACCATCTGTC-3'，下遊引物為C k R: 5'-GGCCATGGCTGGTTGGGC AGC-3'; L'&的上遊引物為 CHF: 5'-GCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTC-3'，下遊引物為 CH,R:AGAAGCGTAGTCCGGAACGTC-3'。擴增條件均為95°C 4分鐘;95°C 30秒,56°C 30秒，72 °C 30秒，30個循環；72°C延伸10分鐘，瓊脂糖凝膠電泳，分別擴增出約420bp、 387bp的 條帶，膠回收純化擴增條帶，溶於去離子水內，-2(TC凍存備用；
(2) 嵌合L鏈、Fd段基因片段的擴增 以鼠源性抗獨特型抗體NP30的VL及人IgG,抗體的Cic的PCR擴增產物為模板，用上遊
引物LF: 5'-GAGGAGGAGGAGGAGGAGGCGGGGCCCAGGCGGCCGAGAATCTG -3'和下遊引物LR: 5'-
GGCCATGGCTGGTTGGGCAGC -3'進行重疊延伸PCR擴增嵌合L鏈，擴增條件為95°C， 4分鐘；
95°C， 30秒、56°C, 30秒、72°C, 30秒，30個循環；72。C, 10延伸10分鐘。瓊脂糖凝膠電泳， 擴增出約773bp的條帶，膠回收擴增條帶，溶於去離子水內，-2(TC凍存備用。
以鼠源性抗獨特型抗體NP30的VH及人IgG,抗體的CH,的PCR擴增產物為模板，用上遊
引物FdF: 5'-GCTGCCCAACCAGCCATGGCC-3'和下遊引物FdR: 5'-AGAAGCGTAGTCCGGAAC GTC-3'
進行重疊延伸PCR擴增嵌合Fd片段，擴增條件為95。C， 4分鐘95。C,30秒、56'C，30秒、 72°C， 30秒，30個循環；72", 10延伸10分鐘。瓊脂糖凝膠電泳，擴增出約738bp的條帶， 膠回收擴增條帶，溶於去離子水內，-2(TC凍存備用。
(3) 嵌合Fab基因片段的擴增
以擴增獲得的嵌合Fd段和L鏈核苷酸序列的膠回收純化產物為模板，用上遊引物FabF: 5'-GAGGAGGAGGAGGAGGAGGCGGGGCCCAGGCGGCCGAGAATCTG-3' 和下遊引物 FabR:5'-GAGGAGGAGGAGGAGGAGAGAAGCGTAGTCCGGAACGTC-3'進行重疊延伸PCR擴增，擴增時，先不加引 物，95°C 4分鐘；94°C 30秒、45°C 30秒、72°C 90秒，8個循環；而後加入FabF、 FabR 引物後94。C 30秒、56°C 30秒、72°C 90秒，22個循環；72°C延伸10分鐘，瓊脂糖凝膠
電泳擴增出約1.5kb的條帶，膠回收純化擴增條帶，溶於去離子水內，-2(TC凍存備用； 3)嵌合Fab原核表達載體的構建和鑑定
提取質粒pComb3XSS(本室保存)，質粒及Fab片段的PCR膠回收產物用Sfil限制性內切 酶在50'C酶切12-16h，電泳後膠回收酶切的質粒大片段，溶於去離子水中。取pComb3XSS、 Fab擴增產物的酶切產物按1: 4摩爾比混勻，在同一離心管內用T4連接酶16'C連接12-16h。
將連接產物轉化感受態大腸桿菌TOP10F'，塗布含氨苄青黴素(100嗎/ml) LB平板，置 37°C12-16h。次日隨機挑取轉化菌及空質粒轉化對照菌，37'C搖菌5小時後，分別用Fab的 特異引物對對菌液進行PCR擴增鑑定，含有插入Fab片段質粒的菌株擴增出一條約1. 5kb左 右的條帶。菌液PCR驗證擴增出大小正確條帶的菌液送生物公司進行測序，DNA序列分析證 實在重組質粒中含有構建的嵌合Fab片段，序列完全正確，其中橫線部分為前導序列pelB， 方框內TAA、 TAG分別為嵌合L鏈、Fd段翻譯終止密碼子
GAG AAT CTG CTC ACC CAG TCT CCA GCA ATC ATG TCT GCA TCT CCA GGG GAG AAG GTC ACC ATG ACC TGC AGT GCC AGC TCA AGT GTT AGT TAC GTT TAC TGG TAC CTG CAG AAG CCA GGA TCC TCC CCC AGA CTC CTG ATT TAT GAC ACA TCC AAC CTG GCT TCT GGA GTC CCT GTT CGC TTC AGT GGC AGT GGG TCT GGG ACC TCT TAC TCT CTC ACA ATC AGC CGA ATG GAG GCT GAA GAT GCT GCC ACT TAT TAC TGC CAG CAG TGG ACT AGT TAC CCA TTC ACG TTC GGC TCG GGG ACC AAG CTG GAA CTG AAA CGA ACT GTG GCT GCA CCA TCT GTC TTC ATC TTC CCG CCA TCT GAT GAG CAG TTG AAA TCT GGA ACT GCC TCT GTT GTG TGC CTG CTG AAT AAC TTC TAT CCC AGA GAG GCC AAA GTA CAG TGG AAG GTG GAT AAC GCC CTC CAA TCG GGT AAC TCC CAG GAG AGT GTC ACA GAG CAG GAC AGC AAG GAC AGC ACC TAC AGC CTC AGC AGC ACC CTG ACG CTG AGC AAA GCA GAC TAC GAG AAA CAC AAA GTC TAC GCC TGC GM GTC ACC CAT CAG GGC CTG AGT TCG CCC GTC ACA AAG AGC TTC AAC AGG
GGA GAG TGT g TTC TAG ATA ATT AAT TAG GAG GAA TTT AAA ATG AM TAC CTA TTG CCT ACG
GCA GCC GCT GGA TTG TTA TTA CTC GCT GCC CAA CCA G(X ATG GCC CAG GTA CAG CTG GTG GAG TCT GGA CCT GAG CTG AAG AAG CCT GGA GAG ACA GTC AGG ATC TCC TGC AAG GCT TCT GGG TAT ACC TTC ACA ACT GCT GGA ATG CAG TGG GTG CAA AAG ATG CCA GGA AAG GGT TTG AAG TGG ATT GGC TGG ATA AAC ACC CAC TCT GGA GTG CCA AAA TAT GCA GAA GAC TTC AAG GGA CGG TTT GCC TTC TCT TTG GAA ACC TCT GCC AGC ACT GCA TAT TTA CAG ATA AGC AAC CTC AAA AAT GAG GAC ACG GCT ACG TAT TTC TGT GCG AGA TCA AGG GAC TAT GCT ATG GAC TAC TGG GGT CAA GGA ACC ACA GTC ACT GTC TCC TCA GCC TCC ACC AAG GGC CCA TCG GTC TTC CCC CTG GCA CCC TCC TCC AAG AGC ACC TCT GGG GGC ACA GCG GCC CTG GGC TGC CTG GTC AAG GAC TAC TTC CCC GAA CCG
GTGACG GTG TCG TGG AAC TCAGGCGCC CTG ACC AGCGGCGTGCACACCTTC CCG GCT GTC CTA
CAGTCC TCA GGA CTC TAC TCCCTCAGC AGC GTG GTGACCGTGCCCTCCAGC AGC TTG GGC ACC
CAGACC TAC ATC TGC AAC GTGAATCAC AAG CCC AGCAACACCAAGGTGGAC AAG AAA GCA GAG
CCCAAA TCT TGT GAC AAA ACTAGTGGC CAG GCC GGCCAGCACCATCACCAT CAC CAT GGC GCA
TAC CCG TAC GAC GTT CCG GAC TAC GCT TCT TAG
構建的重組質粒表達嵌合的L鏈及Fd段重組的嵌合Fab片段，兩者之間前導肽序列pelB 翻譯的22個胺基酸連接，翻譯的蛋白片段分泌至細菌周質腔時前導肽pelB被剪切，嵌合L
鏈和Fd段通過鏈間二硫鍵連接。嵌合L鏈的胺基酸序列為-
GluAsnLeuLeuThrGinSerProAlalieMetSerAlaSerProGlyGluLysValThrMet
ThrCysSerAlaSerSerSerValSerTyrValTyrTrpTyrLeuGinLysProGlySerSer
ProArgLeuLeulieTyrAspThrSerAsnLeuAlaSerGlyValProValArgPheSerGly
SerGlySerGlyThrSerTyrSerLeuThrlieSerArgMetGluAlaGluAspAlaAlaThr
TyrTyrCysGinGinTrpThrSerTyrProPheThrPheGlySerGlyThrLysLeuGluLeu
tysArgThrValAlaAlaProSerValPheliePheProProSerAspGluGinLeuLysSer
GlyThrAlaSerValValCysLeuLeuAsnAsnPheTyrProArgG]uAlaLysValGinTrp
LysValAspAsnAlaLeuGinSerGlyAsnSerGinGluSerValThrGluGinAspSerLys
AspSerThrTyrSerLeuSerSerThrLeuThrLeuSerLysAlaAspTyrGluLysHisLys
ValTyrAlaCysGluValThrHisGinGlyLeuSerSerProValThrLysSerPheAsnArg
GlyGluCys
嵌合Fd段的胺基酸序列為
GinValGinLeuValGluSerGlyProGluLeuLysLysProGlyGluThrValArglieSer
CysLysAlaSerGlyTyrThrPheThrThrAlaGlyMetGinTrpValGinLysMetProGly
LysGlyLeuLysTrplieGlyTrplieAsnThrHisSerGlyValProLysTyrAlaGluAsp
PheLysGlyArgPheAlaPheSerLeuGluThrSerAlaSerThrAlaTyrLeuGinlieSer
AsnLeuLysAsnGluAspThrAlaThrTyrPheCysAlaArgSerArgAspTyrAlaMetAsp
TyrTrpGlyGinGlyThrThrValThrValSerSerAlaSerThrLysGlyProSerValPhe
ProLeuAlaProSerSerLysSerThrSerGlyGlyThrAlaAlaLeuGlyCysLeuValLys
AspTyrPheProGluProValThrValSerTrpAsnSerGlyAlaLeuThrSerGlyValHis
ThrPheProAlaVa]LeuGinSerSerGlyLeuTyrSerLeuSerSerValValThrValProSer Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr lie Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Ala Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr Ser Gly Gin Ala Gly Gin His His His His His His Gly Ala Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Ser
將含有正確重組質粒的菌液按1: 100轉入2ml SB溶液中，氨苄青黴素工作濃度為 100叫/ml，葡萄糖終濃度為4%， 37。C搖菌過夜；過夜的細菌lOOOOg離心15分鐘，棄去上清 液，而後用2ml SB重懸，將重懸後的菌液按1: 100轉入2mlSB中(氨苄青黴素終濃度為lOOpg /ml), 37。C培養OD600-1. 0左右，加入異丙基-B-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至終濃度為lmmol/L, 蔗糖終濃度至4%， 23。C振蕩培養20h。離心收集菌體，分別處理培養上清、菌體超聲上清及 超聲沉澱，進行SDS-PAGE及western-blot檢測，結果嵌合Fab片段在培養上清、菌體超聲 上清及超聲沉澱中均有表達，其中可溶性蛋白主要是在菌體超聲上清中，Fd段分子量約為 30KD，嵌合L鏈分子量約為26KD,而對照菌T0P10F'中無目的蛋白條帶。
4) 表達蛋白的純化
細菌大量誘導表達後菌液10000g離心15分鐘，棄培養上清，沉澱中加入原菌液1/10體 積的20mM磷酸鹽平衡緩衝液(含0. 5M/L NaCl， 20mM咪唑)，將細菌重懸；而後對菌液進行 超聲，超10秒，停10秒，共超90次，而後4。C 12000rpra離心30分鐘，棄沉澱，超聲上清 用0.22pm濾膜過濾，然後用5ml Histr即HP柱子進行純化。先用用5倍柱體積的水以 2.5ml/min的速度洗柱子，而後用至少10倍柱體積的平衡緩衝液平衡柱子，然後以2ml/min 的速度上樣；用平衡緩衝液平衡鎳柱至基線，分別用5倍柱體積的含50mM、 100 mM、 200 mM、 500raM咪唑的緩衝液洗柱子，並收集相應濃度咪唑的洗脫液。取300pl的洗脫液用冰凍乙醇 進行10倍濃縮，而後進行12%SDS-PAGE電泳，觀察蛋白純化情況。結果含200mm咪唑的洗脫 液中Fab蛋白最純。將200mm咪唑的洗脫液用10KD的millpore超濾柱子進行除鹽濃縮，PBS 洗3次。
5) 嵌合Fab抗體片段的活性鑑定
將純化的嵌合Fab抗體片段用50mM/L的碳酸鹽緩衝液(PH9.6)包板，每孔100ul，終 濃度為5嗎/ml 4X:過夜，PBS (含O. 5% Tween20) 5%脫脂牛奶-洗滌緩衝液封閉。雙"抗原" 夾心法檢測血吸蟲病人血清及正常人血清。結果顯示，嵌合Fab抗體片段能與血吸蟲病人血 清反應，不與正常人血清反應，說明該嵌合Fa b抗體片段保留了鼠源性抗獨特型抗體NP30 的模擬抗原性質和特異性。
6) 嵌合Fab抗體片段對急性血吸蟲病動物模型的治療作用
36隻BALB/C小鼠隨機分為三組，每組12隻，雌雄對半。各組小鼠經腹部皮膚感染日本
血吸蟲尾蚴40條/只，於感染後33-35天連續給藥3天①嵌合Fab抗體片段治療組每隻
小鼠肌肉注射嵌合Fab抗體片段100(Lig/只/次，連續3天給藥三次。②陽性對照組以鼠源 性NP30代替嵌合Fab抗體片段，其他處理同嵌合Fab抗體片段治療組。③陰性對照治療組 以PBS代替嵌合Fab抗體片段，其他處理同嵌合Fab抗體片段治療組。觀察小鼠死亡情況， 直至感染後第49天。結果小鼠感染後7周，鼠源性抗獨特型抗體NP30注射組死亡1隻，嵌 合Fab抗體片段治療組無死亡，而對照組死亡6隻，死亡率為50%， Fisher確切概率法顯示 嵌合Fab抗體片段治療組的小鼠死亡率與鼠源性抗獨特型抗體NP30治療組間無顯著性差異， 而顯著低於PBS對照組，表明嵌合Fab抗體片段保留了鼠源性抗獨特型抗體NP30的抗原活性， 有治療急性血吸蟲病的潛力。
利用上述獲得的血吸蟲抗獨特型抗體NP30嵌合Fab抗體片段，可以在原核細胞、酵母細
胞、真核細胞中進行重組表達、製備。
血吸蟲抗獨特型抗體NP30的嵌合Fab抗體片段在製備檢測血吸蟲抗體、抗原製劑，血吸 蟲病免疫保護及免疫治療藥物中的應用。
鑑於NP30為鼠源性的IgM型單克隆抗體，通過基因重組技術，將NP30鼠源性抗體的重鏈、 輕鏈可變區和人IgGl抗體的CH,和CK片段進行重組，擴增了嵌合的Fab分子，並構建了嵌合Fab 抗體片段的原核表達質粒並進行可溶性表達，建立了表達蛋白的純化方法，獲得了高純度的 可溶性蛋白，並開展動物試驗用於急性血吸蟲病的治療。
本發明與現有技術相比具有的優點
我國血吸蟲病防治工作中，主要是應用吡喹酮進行化療，青蒿類藥物由於價格較貴等原 因限制了其在現場的應用。長期反覆廣泛的使用吡喹酮，在一定程度上增加了其產生耐藥性 的危險，而開發一個適當的代替藥物將要花上幾年的時間，因此迫切需要研發新的藥物作為 吡喹酮的補充或替代品。隨著現代生物技術的迅猛發展，運用功能基因組學、蛋白質組學、 生物信息學等現代生化與分子生物學技術，結合基因工程、蛋白質工程、細胞工程等技術，
使得生物技術藥物研發高潮迭起。治療性抗體是以細胞工程技術和基因工程技術為主體的抗 體工程技術製備的藥物，以其特異性強、安全有效而成為當前生物技術藥物研發的熱點。本 發明製備的血吸蟲抗獨特型抗體NP30，通過試驗表明具有治療急性血吸蟲病的潛力。為將來 進行體內研究，使用基因重組技術對該抗獨特型抗體進行改造製備嵌合Fab抗體片段，製備 的抗體片段有以下優點
(1) 大大降低了抗獨特型抗體NP30的鼠源性成分，有利於進一步開展體內試驗。
(2) 保留了鼠源性抗體的模擬抗原特性，可用表達的蛋白和酶標的鼠源性抗體NP30組成雙
"抗原"夾心法診斷血吸蟲病。
(3) 原核表達載體易於構建，可大量表達，生產快速且便於純化。
(4) 有利於改造成嵌合的全分子抗體或其他形式的抗體片段，進一步降低抗獨特型抗體中 的鼠源成分以開展治療血吸蟲病的相關研究。


以下將結合附圖對本發明作進一步說明
圖1:嵌合Fab抗體片段原核表達載體構建示意圖。
圖2:鼠源性單克隆抗體NP30雜交瘤細胞總RNA電泳結果，顯示RNA抽提較好，沒有 發生降解。
圖3:鼠源性單克隆抗體NP30重鏈可變區(VH)及輕鏈可變區(VL) PCR擴增產物電泳。 Ml:核酸標準分子量(Takara lOObp Ladder); 1: VL基因片段；2: VH基因片段；M2: 核酸標準分子量(Takara DL2000)。
圖4:以pComb3XTT為模板擴增的人Ig&的輕鏈恆定區(CK)及重鏈恆定區1 (CH,)片 段電泳結果。Ml:核酸標準分子量(Takara DL2000); h 420bp的Ck基因片段；2: 387bp 的CH,基因片段；M2:核酸標準分子量(Takara lOObp Ladder)。
圖5:嵌合Fd段及L鏈擴增產物的電泳結果。Ml:核酸標準分子量(Takara lOObp Ladder); 1: 773bp的L基因片段；2: 738bp的Fd基因片段；M2:核酸標準分子量(Takara DL2000)。
圖6:嵌合Fab擴增產物的電泳結果。Ml:核酸標準分子量(Takara lOObp Ladder); 1: Fab基因片段；M2:核酸標準分子量(Takara DL2000)。
圖7:嵌合Fab純化蛋白SDS-PAGE電泳結果，M為蛋白質標準(Fermentas， SSM0441), l為純化的嵌合Fab抗體片段。
具體實施例方式
血吸蟲抗獨特型抗體NP30嵌合Fab抗體片段及製備方法、應用
抗獨特型抗體嵌合Fab抗體片段基因序列的合成、原核表達載體的構建及鑑定
材料與方法
1、 細胞株、菌株與質粒NP30雜交瘤細胞、宿主菌XLl-blue、 T0P10F'、質粒pComb3XSS、 pComb3XTT、載體pMD18-T (Takara)
2、 分子生物學試劑M-MLV逆轉錄酶(p，ega)、 rTaq (Takara)、 ExTaq酶(Takara)、 T4
連接酶、質粒純化試劑盒(Takara)、瓊脂糖凝膠回收試劑盒(Qiagen)、 Sfil內切酶(Biolab)。 其他試劑為進口或國產分析純試劑。
3、 引物合成南京金思特公司幫助合成
4、 基因重組技術脂A的抽提、cDNA的合成、PCR、 DNA、質粒的酶切、連接、電泳；質粒的 提取、轉化按一般分子克隆常規方法進行。
5、 DNA序列分析PCR驗證正確的菌液送金思特公司測序，測序結果用DNAstar及DNAclub 軟體進行分析。
結果
1、抗體可變區的擴增及驗證
(1) cDNA的合成:
NP30雜交瘤細胞培養至對數生長期，Trizol法抽提細胞總RNA，置於一80。C保存備用， 凝膠電泳鑑定RNA抽提質量。以oligodT,s為引物，抽提的RNA為模板，進行逆轉錄合成cDNA。 反應條件為總RNA 2ul、 oligodT15 2ul、 DEPC處理過的水22 u 1，混勻後7(TC水浴5分 鍾，立即置冰浴中5分鐘，而後管中加入5XM-MLV bufferlOix 1、 dNTP10yl 、 RNAi2yl 、 M-MLV2ul，混勻後42。C溫育1小時，94°C5分鐘，而後取出置-2CTC。
(2) 輕鏈可變區(VL)、重鏈可變區(VH)的擴增及鑑定 設計鼠源性抗獨特型抗體NP30的重鏈可變區(VH)、輕鏈可變區(VL)的擴增引物，分
別擴增VH、 VL片段，輕鏈可變區(VL)的上遊引物為VLF: 5'-GGGCCCAGGCGG
Q^GAGAATCTGCTCACCCAGTCTCC-3'，下遊引物為VLR: 5'-fi^WC力W7^;rft:
^7(X4C46T7T6TTTCAGTTCCAGCTTGGTCC-3'，在VLF的5'端引入了 Sfil的酶切識別位點即下劃
線部分序列，VLR的5'端引入了與人Ig^的C k上遊引物5'端互補的24個鹼基即斜體部分序
列，以利於NP30的VL與人IgG,的ck片段的重疊PCR擴增；重鏈可變區(VH)的上遊引物
為VHF: 5'-"77( a:C^<X^aMr6^aCAGGTACAGCTGGTGGAGTCTG-3'， 下遊引物為V服5'-0^7^^ar7T^T6^^rrGAGGAGACAGTGACTGTGG-3'，在VHF的5'端引入了和人IgG,的C k
下遊引物互補的21個鹼基序列即斜體部分序列，V服的5'端引入了和人IgG:的CH,上遊引物
互補的21個鹼基序列，即斜體部分，以利於NP30的VH與人IgG,的CHi片段的重疊PCR擴增
分別以反轉錄擴增的cDNA為模板，用引物VLF、 VLR擴增鼠源性抗獨特型抗體NP30的
VL基因片段，用引物VHF、 VHR擴增鼠源性抗獨特型抗體NP30的VH基因片段。擴增體系為
50nl: 10 X buffer 5^1 ， 2. 5mM/L dNTP 4 u 1 、 2. 5raM/L MgCl2 3 P 1 、 cDNA 2pl， VLF/VLR (VHF/VHR)
各lpl， rTaq酶0.5nl，去離子水33.5nl。擴增條件均為95°C 4分鐘；95°C 30秒、56°C 30
秒、72°C 30秒，30個循環；72'C延伸IO分鐘。瓊脂糖凝膠電泳，膠回收純化擴增基因片段， VL、VH的膠回收純化產物分別與pMD-18T載體進行TA連接。連接產物轉化大腸桿菌XL1-Blue， 塗布含氨苄青黴素(100ng/nil)、四環素(30嗎/ml)的LB平板，置37°C12-16h。次日通過 抗性篩選、藍白斑篩選以及菌液PCR，篩選含有插入VL基因片段質粒的菌株(PCR擴增出一 條359bp左右的條帶)、含有插入VH基因片段質粒的菌株(PCR擴增出一條393bp左右的條 帶)送生物公司進行測序。其中VL的核苷酸序列為
GAG AAT CTG CTC ACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACC ATG
ACC TGC AGT GCC AGCTCAAGTGTTAGTTACGTTTACTGGTACCTGCAGAAGCCAGGATCC TCC
CCC AGA CTC CTG ATTTATGACACATCCAACCTGGCTTCTGGAGTCCCTGTTCGCTTCAGT GGC
AGT GGG TCT GGG ACCTCTTACTCTCTCACAATCAGCCGAATGGAGGCTGAAGATGCTGCC ACT
TAT TAC TGC CAG CAGTGGACTAGTTACCCATTCACGTTCGGCTCGGGGACCAAGCTGGAA CTG
AAA
VH的核苷酸序列為-.
CAG GTA CAG CTG GTGGAGTCTGGACCTGAGCTGAAGAAGCCTGGAGAGACAGTCAGGATC TCC
TGC AAG GCT TCT GGGTATACCTTCACAACTGCTGGAATGCAGTGGGTGCAAAAGATGCCA GGA
AAG GGT TTG AAG TGGATTGGCTGGATAAACACCCACTCTGGAGTGCCAAAATATGCAGAA GAC
TTC AAG GGA CGG TTTGCCTTCTCTTTGGAAACCTCTGCCAGCACTGCATATTTACAGATA AGC
AAC CTC AAA AAT GAGGACACGGCTACGTATTTCTGTGCGAGATCAAGGGACTATGCTATG GAC
TAC TGG GGT CAA GGA ACC ACA GTC ACT GTC TCC TCA
將含有正確VL、 VH序列的重組體菌液按1: 100轉入3mlLB液體培養基中，37'C培養12-16h; 用Takara公司的Minibest plasmid purification Kit抽提質粒，超純水溶解，-20。C保存。
(3)抗獨特型抗體嵌合Fab抗體片段的核苷酸序列擴增 ①人IgG,抗體的C k和CH,基因片段的擴增
以質粒pComb3XTT為模板，分別擴增人IgGt抗體的CH,和Ck核苷酸片段；Ck段的上遊 引物為C k F: 5'-CGAACTGTGGCTGCACCATCTGTC-3',下遊引物為C k R: 5'-GGCCATGGCTGGTT GGGCAGC-3'; 的上遊引物為CH,F: 5'-GCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTC-3'，下遊引物為 CH!R:AGAAGCGTAGTCCGGAACGTC-3'。擴增體系為50^1: 10Xbuffer 5pl， 2. 5mM/L dNTP 4ul、 2. 5mM/L MgCl2 3p1、 pComb3XTT 2}il, C k F/Ck R(CH,F/師)各lpl， ExTaq酶0. 5^1，去離
子水33. 5口1。擴增條件均為95。C 4分鐘；95°C 30秒、56°C 30秒、72°C 30秒，30個循環；
72'C延伸10分鐘。瓊脂糖凝膠電泳，分別擴增出一條約420bp、 387bp的條帶，膠回收純化
擴增的CK、 CH,基因片段，溶於去離子水內，-2(TC凍存備用。
② 嵌合L鏈和Fd段基因片段的擴增
以鼠源性抗獨特型抗體NP30的VL及人IgG,抗體的C k的膠回收純化擴增產物為模板，
用上遊引物LF: 5'-GAGGAGGAGGAGGAGGAGGCGGGGCCCAGGCGGCCGAGAATCTG -3'和下遊引物LR:
5' - GGCCATGGCTGGTTGGGCAGC -3'進行重疊PCR擴增嵌合L鏈；以鼠源性抗獨特型抗體NP30
的VH及人IgG,抗體的CHt的膠回收純化擴增產物為模板，用上遊引物FdF:
5'-GCTGCCCAACCAGCCATGGCC-3'和下遊引物FdR: 5'-AGAAGCGTAGTCCGGAAC GTC-3'進行重疊
PCR擴增嵌合Fd片段。擴增體系均為50|iil: 10X buffer 5^1， 2. 5raM/L dNTP4u 1、2. 5mM/L MgCl2 3ii 1、 pMD18-T-VL l)iil, CK純化產物1^1 ， LF、 LR引物各1^1， ExTaq酶0. 5pl,去離子水
33.5口1。擴增條件為95°C 4分鐘；95°C 30秒、56°C 30秒、72°C 30秒，30個循環；72 。C延伸10分鐘。瓊脂糖凝膠電泳，分別擴增出約773bp (嵌合L鏈)、738bp(嵌合Fd段)的 條帶，膠回收擴增條帶，溶於去離子水內，-2(TC凍存備用；
③ 嵌合Fab的擴增
以擴增膠回收純化的嵌合L鏈和Fd段的基因片段為模板，用上遊引物FabF: 5'-GAGGAG GAGGAGGAGGAGGCGGGGCCCAGGCGGCCGAGAATCTG-3' 和 下 遊 引 物 FabR:
5'-GAGGAGGAGGAGGAGGAGAGAAGCGTAGTCCGGAACGTC-3'進行重疊延伸PCR擴增，擴增體系為50pl: 10Xbuffer 5卩1， 2. 5mM/LdNTP 4ul、 2. 5mM/L MgCl2 3ul、 L鏈基因片段lpl， Fd段基因
產物lpl , FabF、 FabR引物各l卩l， LATaq酶0. 5pl,去離子水33. 5pl。擴增時，先不加引
物，95'C, 4分鐘；95。C,30秒、45。C,30秒、72°C， 90秒，8個循環，而後加入FabF、 FabR 引物後95。C,30秒、56。C，30秒、72°C, 90秒，共22個循環；72°C，延伸10分鐘。瓊脂糖 凝膠電泳，擴增出一條約1.5kb的條帶，膠回收擴增條帶，溶於去離子水內，-20'C凍存備用。
(4)嵌合Fab原核表達載體的構建及鑑定
提取質粒pComb3XSS (本室保存)，質粒及Fab片段的PCR膠回收產物用Sfil限制性內切 酶在50。C酶切12-16h，電泳後膠回收酶切的質粒大片段，溶於去離子水中。取pComb3XSS、 Fab擴增產物的酶切產物按1: 4摩爾比混勻，在同一離心管內用T4連接酶16'C連接12-16h。
將連接產物轉化感受態大腸桿菌T0P10F'，塗布含氨苄青黴素(100|_ig/ml) LB平板，置 37°C]2-16h。次日隨機挑取轉化菌及空質粒轉化對照菌，37'C搖菌5小時後，分別用Fab的 特異引物對對菌液進行PCR擴增鑑定，含有插入Fab抗體片段核苷酸序列的質粒的菌株擴增 出一條約1. 5kp左右的條帶。菌液PCR驗證擴增出大小正確條帶的菌液送生物公司進行測序， DM序列分析證實在重組質粒中含有構建的嵌合Fab抗體片段的核苷酸序列，其中橫線部分 為前導序列pelB，方框內TAA、 TAG分別為嵌合L鏈、Fd段翻譯終止密碼子
GAGAATCTGCTCACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACCATG
ACCTGCAGTGCCAGCTCAAGTGTTAGTTACGTTTACTGGTACCTGCAGAAGCCAGGATCCTCC
CCCAGACTCCTGATTTATGACACATCCAACCTGGCTTCTGGAGTCCCTGTTCGCTTCAGTGGC
AGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATCAGCCGAATGGAGGCTGAAGATGCTGCCACT
TATTACTGCCAGCAGTGGACTAG丁TACCCATTCACGTTCGGCTCGGGGACCAAGCTGGAACTG
AAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCT
GGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGG
AAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAG
GACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAA
GTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGACTTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGG
GGAGAGTGT岡TTCTAGATAATTAATTAGGAGGAATTTAAAATGAAATACCTATTGCCTACG
GCAGCCGCTGGA TTGTTATTACTCGCTGCCCAACCAGCCATGGCCCAGGTACAGCTGGTGGAG
TCTGGACCTGAGCTGAAGAAGCCTGGAGAGACAGTCAGGATCTCCTGCAAGGCTTCTGGGTAT
ACCTTCACAACTGCTGGAATGCAGTGGGTGCAAAAGATGCCAGGAAAGGGTTTGAAGTGGATT
GGCTGGATAAACACCCACTCTGGAGTGCCAAAATATGCAGAAGACTTCAAGGGACGGTTTGCC
TTCTCTTTGGAAACCTCTGCCAGCACTGCATATTTACAGATAAGCAACCTCAAAAATGAGGAC
ACGGCTACGTATTTCTGTGCGAGATCAAGGGACTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACC
ACAGTCACTGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCC
AAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCG
GTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTA
CAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACC
CAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGCAGAG
CCCAAATCTTGTGACAAAACTAGTGGCCAGGCCGGCCAGCACCATCACCATCACCATGGCGCA
TAC CCG TAC GAC GTT CCG GAC TAC GCT TCT TAG
抗獨特型抗體嵌合Fab抗體片段的表達、鑑定及純化
材料與方法
1、 菌株與質粒宿主菌T0P10F'、質粒pComb3XSS-Fab
2、 試劑和耗材咪唑(Sigma) , HisTrap純化柱(法瑪尼亞)，PMSF、異丙基-B-D-硫代半 乳糖苷(IPTG)、氨苄青黴素、蔗糖、葡萄糖以及其他試劑為進口或國產分析純試劑，ELISA96 孔酶標板(costar)、 HRP-NP30(本實驗室自製)。
3、 蛋白的表達和純化質粒的提取、轉化、誘導表達及SDS-PAGE、 western-blot按一般分 子克隆常規方法進行。
4、 活性鑑定採用雙"抗原"夾心法檢測血吸蟲病人血清。 結果
1、小量表達及鑑定
將含有正確重組質粒的菌液按1: 100轉入2ml SB溶液中，並設空質粒菌對照，氨苄青 黴素工作濃度為100|ag/ml，葡萄糖終濃度為4%， 37度搖菌過夜；過夜的細菌10000g離心15 分鐘，棄去上清液，而後用2ml SB重懸，將重懸後的菌液按l: 100轉入2mlSB中(氨苄青 黴素終濃度為IOO叫/ml )， 37度培養OD600=1. 0左右，加入異丙基-B -D-硫代半乳糖苷(IPTG) 至終濃度為lmmol/L，蔗糖終濃度至4%， 23度振蕩培養20h。
離心收集菌體，培養上清各取30nl於2個新的Eppendorf管中，其餘上清棄去。細菌沉 澱溶於100nl PBS (PH 7.4)中，重懸菌體，而後進行冰浴超聲，1200rpm 4'C離心15分鐘， 各取30^1於新的Eppendorf管中，其餘上清棄去，沉澱加60nl PBS (PH 7.4)重懸後分裝 成2管。而後每管加lOpl 4X loading buffer,混勻後IO(TC煮沸5分鐘。上樣，進行SDS-PAGE 電泳， 一塊膠染色， 一塊膠做western-blot檢測。SDS-PAGE電泳中，培養液上清、超聲上 清、沉澱中均有相應條帶表達，但與空白菌無顯著差異。做western-blot時，先300mA電轉 印70分沐然後用含5%脫脂奶粉的PBS緩衝液(含Tween-20 0. 1%)室溫下封閉lh，棄去封 閉液，加入1: 2000稀釋的HRP-羊抗人IgG(Fab特異性的)，室溫下孵育lh。而後PBS(Tween-20 0. 1%)洗3次，每次5分鐘。而後加DAB顯色液顯色，結果在培養上清、菌體超聲上清及超 聲沉澱中均有2個條帶，嵌合Fd段分子量約為30KD，嵌合L鏈分子量約為26KD。培養液上 清及菌體超聲上清為可溶性表達蛋白，超聲沉澱中為包涵體。空白質粒對照菌中無條帶表達。
構建的重組質粒在大腸桿菌T0P10F'中翻譯，L鏈和Fd段之間的前導序列翻譯的信號肽 pelB在轉入細菌周質腔時被剪切，表達的嵌合L鏈和Fd段通過鏈間二硫鍵連接組成抗獨特
型抗體NP30的嵌合Fab抗體片段。嵌合L鏈的胺基酸序列為:
GluAsnLeuLeuThrGinSerProAlalieMetSerAlaSerProGlyGluLysValThrMet
ThrCysSerAlaSerSerSerValSerTyrValTyrTrpTyrLeuGintysProGlySerSer
ProArgLeuLeulieTyrAspThrSerAsnLeuAlaSerGlyValProValArgPheSerGly
SerGlySerGlyThrSerTyrSerLeuThrlieSerArgMetGluAlaGluAspAlaAlaThr
TyrTyrCysGinGinTrpThrSerTyrProPheThrPheGlySerGlyThrLysLeuGluCeu
LysArgThrValAlaAlaProSerValPheliePheProProSerAspGluGinLeuLysSer
GlyThrAlaSerValValCysLeuLeuAsnAsnPheTyrProArgGluAlaLysValGinTrp
LysValAspAsnAlaLeuGinSerGlyAsnSerGinGluSerValThrGluGinAspSerLys
AspSerThrTyrSerLeuSerSerThrLeuThrLeuSerLysAlaAspTyrGluLysHisLys
ValTyrAlaCysGluValThrHisGinGlyLeuSerSerProValThrtysSerPheAsnArg
GlyGluCys
嵌合Fd.段的胺基酸序列為
GinValGinLeuValGluSerGlyProGluLeuLysLysProGlyGluThrValArglieSer
CysLysAlaSerGlyTyrThrPheThrThrAlaGlyMetGinTrpValGinLysMetProGly
LysGlyLeuLysTrplieGlyTrplieAsnThrHisSerGlyValProLysTyrAlaGluAsp
PheLysGlyArgPheAlaPheSerLeuGluThrSerAlaSerThrAlaTyrLeuGinlieSer
AsnLeuLysAsnGluAspThrAlaThrTyrPheCysAlaArgSerArgAspTyrAlaMetAsp
TyrTrpGlyGinGlyThrThrValThrValSerSerAlaSerThrLysGlyProSerValPhe
ProLeuAlaProSerSerLysSerThrSerGlyGlyThrAlaAlaLeuGlyCysLeuValLys
AspTyrPheProGluProValThrValSerTrpAsnSerGlyAlaLeuThrSerGlyValHis
ThrPheProAlaValLeuGinSerSerGlyLeuTyrSerLeuSerSerValValThrValPro
SerSerSerLeuGlyThrGinThrTyrlieCysAsnValAsnHisLysProSerAsnThrLys
ValAspLysLysAla GluProLysSerCysAspLysThrSerGlyGinAlaGlyGinHisHis
H丄sHisHisHisGly Ala Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Ser
2、大量表達及純化
細菌大量誘導表達後菌液lOOOOg離心15分鐘，棄培養上清，沉澱中加入原菌液1/10體 積的20mM磷酸鹽平衡緩衝液(含0.5M/L NaCl,20mM咪唑)，將細菌重懸；而後對菌液進行 超聲，超10秒，停10秒，共超90次，而後4。C 12000rpm離心30分鐘，棄沉澱，超聲上清 用0.22,濾膜過濾，然後用5ml Histrap HP柱子進行純化。先用用5倍柱體積的水以 2.5ml/min的速度洗柱子，而後用至少10倍柱體積的平衡緩衝液平衡柱子，然後以2ml/min
的速度上樣；用平衡緩衝液平衡鎳柱至基線，分別用5倍柱體積終濃度為50mM/L、 100Mm/L、 200 mM/L、 500函/L咪唑的緩沖液洗柱子，並收集相應濃度咪唑的洗脫液。取300nl的洗脫 液用冰凍乙醇進行10倍濃縮，而後進行12%SDS-PAGE電泳，觀察蛋白純化情況。結果含200mm 咪唑的洗脫液中嵌合Fab抗體片段最純。將含200mM/L咪唑的洗脫液用10KD的超濾管進行除 鹽濃縮，PBS洗3次。
3、嵌合Fab抗體片段的活性鑑定
將純化的嵌合Fab抗體片段按5ing/ml用50mM的碳酸鹽緩衝液(PH9. 6)包板，鼠源性抗 獨特型抗體NP30做對照，每孔10(^1， 4'C包板過夜；而後每孔加入20(^1含5%脫脂牛奶PBST 緩衝液，37。C封閉2h;甩去孔中液體，PBST(Tween-20: 0.05%)洗4次。3份血吸蟲病人血清 分別用PBST按1: 100稀釋，每孔加入100pl稀釋血清(設復孔)，並設正常人血清、PBST 空白對照。37。C孵育30分鐘，甩去血清，PBST洗4遍，加入本室自製的10(^1 HRP標記的 NP30,而後37。C孵育30分鐘。甩去酶標抗體，PBST洗4遍，每孔加TMB50pl、 HA50pl，室 溫下反應15分鐘，每孔加21\0^045(^1終止反應。酶標儀測定A450。嵌合Fab抗體片段能與 血吸蟲病人血清反應，不與正常人血清反應，說明該嵌合Fab抗體片段保留了鼠源性單克隆 抗體的模擬抗原性質和特異性(檢測的OD值見下表)。
1 2 3 4 5 6
0.243 0.086 0.097 0.664 0.460 0.564
0.256 0. 120 0. 139 0.734 0.368 0.548
0.152 0.067 0.133 0.920 0.635 0.839 NP30 0.170 0.055 0.114 0.871 0.700 0.691
*其中1-3為正常人血清，4-6為血吸蟲病人血清。 嵌合Fab抗體片段對急性血吸蟲感染動物模型的治療作用
材料與方法
1、蛋白NP30雜交瘤細胞培養上清，飽和硫酸銨沉澱後，透析除鹽；NP30嵌合抗體Fab段 可溶性表達用Histr鄰HP進行純化，分光光度計法測定蛋白濃度後-7CTC保存備用。
嵌合Fab 抗體片 段
2、試驗動物及分組取36隻BALB/C小鼠，6-7周齡，隨機分為三組，雌雄各半。每隻小 鼠經腹部皮膚感染日本血吸蟲尾蚴40條，於感染後33-35天連續給藥3天 ①嵌合Fab抗體片段治療組每隻小鼠肌肉注射嵌合Fab抗體片段100嗎/只/次，連續3天 給藥三次。②鼠源性抗獨特型抗體NP30對照組以鼠源性NP30代替嵌合Fab抗體片段，其 他處理同嵌合Fab抗體片段治療組。③PBS對照組以PBS代替嵌合Fab抗體片段，其他處 理同嵌合Fab抗體片段治療組。
3、治療效果觀察抗體注射後觀察小鼠死亡情況，直至感染後第49天。 結果
PBS對照組在感染後第43天即抗體注射後10天開始死亡，43、 44天死亡比較集中，死 亡率為41.7%,而鼠源性抗獨特型抗體NP30、嵌合抗體Fab抗體片段治療組均未出現死亡。 抗體注射後2周，鼠源性抗獨特型抗體NP30組小鼠死亡1隻，嵌合Fab抗體片段治療組未出 現死亡。Fisher確切概率法顯示鼠源性抗獨特型抗體NP30治療組、嵌合Fab抗體片段治療 組的死亡率顯著低於PBS對照組(/<0.05)。結果提示，嵌合Fab抗體片段有延長急性血吸蟲 病小鼠壽命的潛力。
血吸蟲抗獨特型抗體NP30嵌合Fab抗體片段核苷酸及蛋白序列表 〈110〉南京醫科大學
〈120〉血吸蟲抗獨特型抗體NP30嵌合Fab抗體片段及製備方法、應用
3
〈210> 1 <211〉 1482 <212〉廳 <213〉人工序列


〈223>鼠源性抗獨特型抗體輕鏈可變區基因片段序列。 <220〉
<221〉 C一region 〈319》..
人抗體IgGl輕鏈恆定區CK基因片段序列。
mis-feature
<222〉 〈639》'.
〈223〉輕鏈基因片段翻譯的終止密碼子。
<220〉
<221〉 mis-feature 〈642》'.
<223〉嵌合Fab片段輕鏈和Fd基因片段重疊延伸擴增的核苷酸序列，含核糖體結合位點。 <220〉
<221〉 mis-feature <222〉 <672》"
〈'223〉為使NP30嵌合Fab中Fd段可溶性表達增加的pelB信號肽序列，將在蛋白分泌至周質 腔時被剪切。
〈220〉
〈221> V—region
<222〉 <739》.'
〈223〉鼠源性抗獨特型抗體NP30重鏈可變區VH基因片段序列 <220〉
〈221〉 C一region <222〉 <1090》"〈1410〉
人抗體IgGl輕鏈恆定區CH1基因片段序列。
mis-feature 〈222〉 <1411》.'
連接嵌合Fab抗體片段基因和載體pComb3XSS的Sfil酶切位點。
mis-feature
〈1423》..
〈223>載體pComb3XSS上序列，含His標籤。

mis-feature
〈1480〉…〈1482〉
載體pComb3XSS上的琥珀酸終止子。
〈德1
GAG AAT CTG CTC ACC CAG TCT CCA GCA ATC ATG TCT GCA TCT CCA GGG GAG MG GTC ACC 60
Glu Asn Leu Leu Thr Gin Ser Pro Ala lie Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr 15 10 15 20
ATG ACC TGC AGT GCC AGC TCA AGT GTT AGT TAC GTT TAC TGG TAC CTG CAG MG CCA GGA 120
Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Val Tyr Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly
25 30 35 40
TCC TCC CCC AGA CTC CTG ATT TAT GAC ACA TCC MC CTG GCT TCT GGA GTC CCT GTT CGC 180
Ser Se上'Pro Arg [>eu Leu lie Tyr Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg
45 50 55 60
TTC AGT GGC AGT GGG TCT GGG ACC TCT TAC TCT CTC ACA ATC AGC CGA ATG GAG GCT GAA 240
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr lie Ser Arg Met Glu Ala Glu
65 70 75 80
GAT GCT GCC ACT TAT TAC TGC CAG CAG TGG ACT AGT TAC CCA TTC ACG TTC GGC TCG GGG 300
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Trp Thr Ser Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly
85 90 95 100
ACCAAGCTGGMCTGAAACGA ACTGTG GCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCT360
ThrLysLeuGluLeu 105LysArg ThrValAla 110AlaProSerValPhe 115liePheProProSer 120
GATGAGCAGTTGAMTCTGGA ACTGCCTCTGTTGTCTCCCTGCTGAATAACTTCTATCCC420
AspGluGinLeuLys 125SerGly ThrAlaSer 130ValValCysLeuLeu 135AsnAsnPheTyrPro 140
AGAGAGGCCAMGTACAGTGG MGGTG GATMCGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAG480
ArgGluAlaLysVal M5GinTrp LysValAsp 150AsnAlaLeuGinSer 155GlyAsnSerGinGlu 160
AGTGTCACAGAGCAGGACAGC AAGGACAGC虹TACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTG540
SerValThrGluG]n 165AspSer LysAspSer ]70ThrTyrSerLeuSer 175SerThrLeuThrLeu 180
AGCAMGCAGACTACGAGAAA CACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTC600
SerLysAlaAspTyr 185GluLys HisLysVal 190TyrAlaCysGluVal 195ThrHisGinGlyLeu 200
AGTTCGCCCGTCACAAAGAGC TTCMCAGGGGAGAGTGTTAATTCTAGATAATTAATTAG660
SerSerProValThr 205LysSer PheAsnArg 210GlyGluCys
GAGGMTTTAAAATGAMTAC CTATTGCCTACGGCAGCCGCTGGATTGTTATTACTCGCT720
MetLysTyr LeuLeuProThrAlaAlaAlaGlyLeuLeuLeuLeuAla
GCCCMCCAGCCATGGCCCAG GTACAGCTGGTGGAGTCTGGACCTGAGCTGMGAAGCCT780
AlaGinProAlaMetAlaGin Val 1GinLeuVal 5GluSerGlyProGlu 10LeuLysLysPro
GGAGAGACAGTCAGGA丁CTCC TGCAAGGCTTCTGGGTATACCTTCACAACTGCTGGAATG840
GlyGluThrValArglieSer CysLysAlaSerGlyTyrThrPheThrThrAlaGlyMet
15202530
CAGTGGGTGCMAAGATGCCA GGAAAGGGTTTGMGTGGATTGGCTGGATAAACACCCAC900
GinTrpValGinLysMetPro GlyLysGlyLeuLysTrplieGlyTrplieAsnThrHis
35404550
TCTGGAGTGCCAAMTATGCA GAAGACTTCMGGGACGGTTTGCCTTCTCTTTGGAAACC960
SerGlyValProLysTyrAla GluAspPheLysGlyArgPheAlaPheSerLeuGluThr
55606570
TCTGCCAGCACTGCATATTTA CAGATAAGCMCCTCAAAAATGAGGACACGGCTACGTAT1020
SerAlaSerThrAlaTyrLeu GinlieSerAsnLeuLysAsnGluAspThrAlaThrTyr
75808590
TTCTGTGCGAGATCAAGGGAC TATGCTATGGACTACTGGGGTCMGGAACCACAGTCACT調
PheCysAlaSerArgAsp TyrAlaMetAspTyrTrpGlyGinGlyThrThrValThr
95100105110
GTCTCCTCAGCCTCCACCAAG GGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGC1140
VaA Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser 115 120 125 130
ACC TCT GGG GGC ACA GCG GCC CTG GGC TGC CTG GTC AAG GAC TAC TTC CCC GAA CCG GTG 1200 Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val 135 140 145 150
ACG GTG TCG TGG AAC TCA GGC GCC CTG ACC AGC GGC GTG CAC ACC TTC CCG GCT GTC CTA 1260 Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 155 160 165 170
CAG TCC TCA GGA CTC TAC TCC CTC AGC AGC GTG GTG ACC GTG CCC TCC AGC AGC TTG GGC 1320 Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Scr Ser Ser Leu Gly 175 180 185 190
ACC CAG ACC TAC ATC TGC AAC GTG AAT CAC AAG CCC AGC AAC ACC AAG GTG GAC AAG AAA 1380 Thr Gin Thr Tyr lie Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys 195 200 205 210
GCA GAG CCC AAA TCT TGT GAC AAA ACT AGT GGC CAG GCC GGC CAG CAC CAT CAC CAT CAC 1440 Ala Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr Ser Gly Gin Ala Gly Gin His His His His His 215 220 225 230
CAT GGC GCA TAC CCG TAC GAC GTT CCG GAC TAC GCT TCT TAG 1482 His Gly Ala Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Ser 235 240 245
<210〉 2 213 PRT <213〉人工序列

<223〉抗獨特型抗體NP30的嵌合輕鏈，即抗獨特型抗體NP30的輕鏈可變區與人IgGl的恆定 區(Cic)重組後形成的融合蛋白，全長213個胺基酸。
<400〉 2
Glu Asn Leu Leu Thr Gin Ser Pro Ala lie Met Ser Ala Ser Pro
15 10 15
Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser
20 25 30
Tyr Val Tyr Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Ser Ser Pro Arg Leu
35 40 45
Leu lie Tyr Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg
50 55 60
Phe Ser Gly Arg Met Glu Thr Ser Tyr Lys Arg Thr Asp Glu Gin Asn Asn Phe Tyr
Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr lie
65 70 Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin
80 85 Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr
Cys Gin Lys Leu
Glu
95 100 Val Ala Ala Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro
Asn Ala Leu Gin
Asp Ser Lys Ser Lys Ala Thr His Gin
110
Leu Lys Ser 125 Pro 140 Ser 155 Ser 170 Tyr 185 Leu 200
Asp Asp Gly
Arg Gly Thr Glu
115
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu 130
Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val 145
Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu
Tyr Ser Lys His
160
Leu Ser Ser Thr Leu Thr
Lys
Ser Ser Pro Val
175 Val 190 Thr 205
Tyr Lys
Ala Cys Glu
Ser Phe Asn
Ser
75
Trp
90
Leu
105
Ser
120
Leu
135
Asp
150
Gin
165
Leu
180
Val
195
Arg
210
Gly Glu Cys 213
3 247 PRT 〈213>人工序列
<220〉
<223〉抗獨特型抗體NP30的嵌合Fd段， 鏈恆定區的CH1重組後形成的融合蛋白，全長247個胺基酸。
即抗獨特型抗體NP30的重鏈可變區與人IgGl的重
3
Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly
15 10 15
Glu Thr Val Arg lie Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr
20 25 30
Thr Ala Gly Met Gin Trp Val Gin Lys Met Pro Gly Lys Gly Leu
35 40 45
Lys Trp lie Gly Trp lie Asn Thr His Ser Gly Val Pro Lys 丁yr
50 Lys 65 Tyr 80 Phe 95 Gly 110 Val 125 Ala 140 Thr 155 Phe 170 Val 185 Cys 200 Ala 215 His 230 Tyr 245
Ala Glu Asp Phe Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser
65 70 Ala Ser Thr Ala Tyr Leu Gin lie Ser Asn Leu
80 85 Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Ser Arg Asp
Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser
Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser
Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 140
Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser
170 175 Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
Gin Thr Tyr lie Cys Asn Val Asn His Lys Pro
Val Asp Lys Lys Ala Glu Pro Lys Ser 215
Gin Ala Gly Gin His His His His His Asp Val Pro Asp Tyr Ala Ser
55 Phe 70 Asn 85 Arg 100 Val 115 Pro 130 Cys Leu Val 145
Asn Ser Gly 160 Gin 175 Ser 190 Lys 205 Cys 220 His 235
Asp Gly
60
Leu Glu Thr Ser 75
Lys Asn Glu Asp 90
Tyr Ala Met Asp 105
Ser Ala Ser Thr 120
Ser Lys Ser Thr 135
Lys Asp Tyr Phe 150
Ala Leu Thr Ser 165
Ser Gly Leu Tyr 180
Ser Leu Gly Thr 195
Ser Asn Thr Lys 210
Lys Thr Ser Gly 225
Ala Tyr Pro Tyr 240
權利要求
1、日本血吸蟲抗獨特型抗體NP30的嵌合Fab抗體片段，即鼠源性抗獨特型抗體NP30的重鏈和輕鏈可變區與人IgG1的重鏈部分恆定區(CH1)及輕鏈恆定區(Cκ)進行重組形成的融合蛋白；鼠源性抗體NP30的輕鏈可變區與人IgG1的輕鏈恆定區Cκ重組的嵌合L鏈及鼠源性抗體NP30的重鏈可變區VH與人IgG1的CH1重組的嵌合Fd段，兩者中間通過前導序列pelB連接，嵌合Fd段、L鏈分泌到細菌周質腔時前導序列pelB被剪切，兩者通過鏈間二硫鍵連接構成嵌合Fab抗體片段；嵌合L鏈的胺基酸序列為Glu Asn Leu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr MetThr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Val Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Ser SerPro Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser GlySer Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala ThrTyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Ser Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu LeuLys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys SerGly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln TrpLys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser LysAsp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His LysVal Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn ArgGly Glu Cys；嵌合Fd段的胺基酸序列為Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu Thr Val Arg Ile SerCys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Ala Gly Met Gln Trp Val Gln Lys Met Pro GlyLys Gly Leu Lys Trp Ile Gly Trp Ile Asn Thr His Ser Gly Val Pro Lys Tyr Ala Glu AspPhe Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Ile SerAsn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Ser Arg Asp Tyr Ala Met AspTyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val PhePro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val LysAsp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val HisThr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val ProSer Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys ValAsp Lys Lys Ala Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr Ser Gly Gln Ala Gly Gln His His HisHis His His Gly Ala Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Ser。
2、權利要求l所述的日本血吸蟲抗獨特型抗體NP30嵌合Fab抗體片段的製備方法，該 抗體片段是利用基因工程技術製備，具體方法如下1) 抗體可變區的基因擴增及驗證鼠源性抗獨特型抗體NP30雜交瘤細胞培養至對數生長期，Trizol-氯仿-異丙醇法抽提 細胞總RNA;以總RNA中的mRNA為模板，以oligodT's為引物，反轉錄擴增獲得單鏈cDNA， 設計鼠源性抗獨特型抗體NP30的重鏈可變區(VH)、輕鏈可變區(VL)的擴增引物，分別擴 增VH、 VL片段，輕鏈可變區(VL)的上遊引物為VLF: 5'-GGGCCCAGGCGGCCGAGAATCTGCTCA CCCAGTCTCC-3'，下遊引物為VLR: 5'-C"/WW6^WrW 7a^ffa7力C^77T6TTTCAGTTCCAGCTTG GTCC-3'，在VLF的5'端引入了 Sfil的酶切識別位點即下劃線部分序列，VLR的5'端引入 了與人lgG,的C k上遊引物5'端互補的24個鹼基即斜體部分序列，以利於NP30的VL與人 IgG,的CK片段的重疊PCR擴增；重鏈可變區(VH)的上遊引物為VHF: 5'-6tT(XCa^OftX47^( aCAGGTACAGCTGGTGGAGTCTG-3', 下遊引物為VHR : 5'-fl^7W^ar7T6ttTft^6KCTGAGGAGACAGTGACTGTGG-3',在VHF的5'端引入了和人IgG,的C k下遊引物互補的21個鹼基序列即斜體部分序列，VHR的5'端引入了和人IgG,的CR上遊 引物互補的21個鹼基序列，即斜體部分，以利於NP30的VH與人IgG,的CH,片段的重疊PCR 擴增；分別以反轉錄擴增的cDNA為模板，用引物VHF、 VHR擴增鼠源性抗獨特型抗體NP30的 VH片段，用引物VLF、 VLR擴增鼠源性抗獨特型抗體NP30的VL片段；擴增條件均為95'C 4 分鐘；95°C 30秒，56°C 30秒，72°C 30秒，30個循環；72'C延伸10分鐘，瓊脂糖凝膠電 泳，膠回收純化擴增基因片段，膠回收產物分別與pMD-18T進行TA連接，然後轉化大腸桿菌 XL1-Blue,篩選PCR擴增出大小正確條帶的菌液送生物公司進行測序，序列完全正確，抽提 含有正確插入序列的重組質粒；2) 嵌合Fab片段的基因擴增(1)人IgG,抗體的CH,和Ctc段的擴增以質粒pComb3XTT為模板，分別擴增人IgG,抗體的CH,和Ck核苷酸片段；Ck段的上遊 弓I物為C k F: 5' -CGAACTGTGGCTGCACCATCTGTC-3'，下遊引物為C k R: 5' -GGCCATGGCTGGTTGG GCAGC-3' ; CH,的上遊引物為Cf^F: 5'-GCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTC-3'，下遊引物為 CHR:AGAAGCGTAGTCCGGAACGTC-3';擴增條件均為95。C 4分鐘;95°C 30秒，56'C 30秒,72 °C 30秒，30個循環；72°C延伸10分鐘，瓊脂糖凝膠電泳，分別擴增出約420bp、 387bp的 條帶，膠回收純化擴增條帶，溶於去離子水內，-20'C凍存備用；(2) 嵌合Fd段和L鏈的基因擴增以鼠源性抗獨特型抗體NP30的VL及人IgG,抗體的Ck的膠回收純化擴增產物為模板， 用上遊引物LF: 5' -GAGGAGGAGGAGGAGGAGGCGGGGCCCAGGCGGCCGAGAATCTG -3'和下遊引物LR: 5'- GGCCATGGCTGGTTGGGCAGC -3'進行重疊PCR擴增嵌合L鏈；以鼠源性抗獨特型抗體NP30 的VH及人IgG,抗體的CH,的膠回收純化擴增產物為模板，用上遊引物FdF: 5' -GCTGCCCAACCAGCCATGGCC-3'和下遊引物FdR: 5' -AGAAGCGTAGTCCGGAAC GTC-3'進行重疊 PCR擴增嵌合Fd片段，擴增條件為95。C 4分鐘；95°C 30秒，56°C 30秒，72°C 30秒，30 個循環；72'C延伸10分鐘，瓊脂糖凝膠電泳，分別擴增出約773bp、 738bp的條帶，膠回收 擴增條帶，溶於去離子水內，-2(rc凍存備用；(3) 嵌合Fab片段的基因擴增以擴增獲得的嵌合Fd段和L鏈核苷酸序列的膠回收純化產物為模板，用上遊引物FabF: 5'-GAGGAGGAGGAGGAGGAGGCGGGGCCCAGGCGGCCGAGAATCTG-3' 和下遊引物 FabR:5: GAGGAGGAGGAGGAGGAGAGAAGCGTAGTCCGGAACGTC-3'進行重疊延伸PCR擴增，擴增時，先不加引 物，95°C 4分鐘；94°C 30秒、45°C 30秒、72°C 90秒，8個循環；而後加入FabF、 FabR 引物後94 °C 30秒、56°C 30秒、72 °C 90秒，22個循環；72°C延伸10分鐘，瓊脂糖凝膠 電泳擴增出約1.5kb的條帶，膠回收純化擴增條帶，溶於去離子水內，-2CTC凍存備用； 3)嵌合Fab片段原核表達載體的構建和鑑定pComb3XSS質粒、Fab膠回收純化片段分別用Sfil限制性內切酶在5(TC酶切12-16h，電 泳後膠回收酶切的質粒大片段，溶於去離子水中，pComb3XSS質粒、Fab酶切產物在同一離心 管內用T4連接酶16度連接12-16h;將連接產物轉化感受態大腸桿菌TOP10F'，塗布含氨苄青黴素終濃度為lOOtig/rnl的LB 平板，置37'C12-16h，次日隨機挑取轉化菌及空質粒轉化對照菌，37t:搖菌5小時後，分別 用Fab的特異引物對對菌液進行PCR擴增鑑定，含有插入Fab片段質粒的菌株擴增出一條約 1.5kb的條帶；提取含嵌合Fab片段核苷酸序列的質粒進行DNA序列分析，證實在重組質粒 中含有構建的嵌合Fab片段，序列完全正確，其中橫線部分為前導序列pelB，方框內TAA、 TAG分別為嵌合L鏈、Fd段翻譯終止密碼子GAG AAT CTG CTC ACC CAG TCT CCA GCA ATC ATG TCT GCA TCT CCA GGG GAG AAG GTC ACC ATG ACC TGC AGT GCC AGC TCA AGT GTT AGT TAC GTT TAC TGG TAC CTG CAG AAG CCA GGA TCC TCC CCC AGA CTC CTG ATT TAT GAC ACA TCC AAC CTG GCT TCT GGA GTC CCT GTT CGCTTC AGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATCAGCCGAATGGAGGCTGAAGAT GCTGCCACTTATTACTGCCAGCAGTGGACTAGTTACCCATTCACGTTCGGCTCGGGGACC AAGCTGGAACTGAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGAT GAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGA GAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGT GTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACG CTGAGC AAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGT TCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTTCTAGATAATTAATTAGGAG GAATTTAAAATGAAATACCTATTGCCTACGGCAGCCGCTGGATTGTTATTACTCGCTGCC CAACCAGCCATG GCCCAGGTACAGCTGGTGGAGTCTGGACCTGAGCTGAAGAAGCCTGGA GAGACAGTCAGGATCTCCTGCAAGGCTTCTGGGTATACCTTCACAACTGCTGGAATGCAG TGGGTGCAAAAGATGCCAGGAAAGGGTTTGAAGTGGATTGGCTGGATAAACACCCACTCT GGAGTGCCAAAATATGCAGAAGACTTCAAGGGACGGTTTGCCTTCTCTTTGGAAACCTCT GCCAGCACTGCATATTTACAGATAAGCAACCTCAAAAATGAGGACACGGCTACGTATTTC TGTGCGAGATCAAGGGACTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCACAGTCACTGTC TCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACC TCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACG GTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAG TCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACC CAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGCA GAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTAGTGGCCAGGCCGGCCAGCACCATCACCATCACCAT GGCGCATACCCGTACGACGTTCCGGACTACGCTTCT岡構建的重組質粒表達嵌合的L鏈及Fd段重組的嵌合Fab抗體片段，兩者之間有前導肽pelB的 22個胺基酸連接，這22個胺基酸在嵌合Fab片段分泌至細菌周質腔時被剪切，嵌合L鏈和 Fd段通過鏈間二硫鍵連接；4)表達嵌合Fab細菌的篩選鑑定及表達蛋白的純化將含有正確重組質粒的菌液按1: 100轉入2ml SB溶液中，氨苄青黴素工作濃度為 100l^g/ml，葡萄糖終濃度為4%， 37。C搖菌過夜；過夜的細菌10000g離心15分鐘，棄去上清 液，而後用2ml SB重懸，將重懸後的菌液按1: 100轉入2ml含氨苄青黴素終濃度為100M>g Ail 的SB培養基中，37t培養0D600=1. 0左右，加入IPTG至終濃度為lmmol/L，蔗糖終濃度至4%,23'C振蕩培養20h,離心收集菌體，分別處理培養上清、菌體超聲上清及超聲沉澱，進行 SDS-PAGE及western-blot檢測，嵌合Fab片段在培養上清、菌體超聲上清及超聲沉澱中均 有表達，其中可溶性蛋白主要是在菌體超聲上清中，Fd段分子量約為30KD， L鏈分子量約為 26KD,而對照菌T0P10F'中無目的蛋白條帶；大量誘導培養的菌液，10000g離心15分鐘，棄培養上清，沉澱中加入原菌液1/10體積 的20mM磷酸鹽平衡緩衝液，其中NaCl終濃度為0. 5M/L,咪唑終濃度為20Mm/L，將細菌重懸 後進行超聲，超10秒，停10秒，共超90次，而後4。C 12000rpni離心30分鐘，超聲上清用 0.22um濾膜過濾，然後用5ml Histrap HP柱子在Akta系統上進行純化，用5倍柱體積的水 以2. 5ml/min的速度洗柱子，而後用至少10倍柱體積的平衡緩衝液平衡柱子，然後以2ml/min 的速度上樣，平衡緩衝液平衡鎳柱至基線，分別用5倍柱體積的含50mM、 100 mM、 200 mM、 300mM、 500mM， 1M咪唑的緩衝液洗柱子，並收集相應濃度咪唑的洗脫蛋白，用12%SDS-PAGE 檢觀(j，結果200mm咪唑的洗脫液中Fab蛋白最純，將200mm咪唑的洗脫液用10KD的超濾管除 鹽濃縮，即獲得純化的嵌合Fab;5)嵌合Fab的活性鑑定將純化的嵌合Fab重組蛋白用50mM/LPH為9. 6的碳酸鹽緩衝液稀釋，並以鼠源性抗獨特 型抗體NP30做對照，按5Pg/ml包板，每孔IOOW， 4'C包板過夜，PBST洗5次後，每孔加 300ri含5%脫脂牛奶的PBST緩衝液封閉過夜，PBST緩衝液洗滌5次後，每孔加入血吸蟲病 人血清，正常人血清為陰性對照，雙"抗原"夾心法檢測顯示，嵌合Fab抗體片段能與血吸 蟲病人血清反應，不與正常人血清反應，說明該嵌合Fab抗體片段保留了鼠源性抗獨特型抗 體NP30的模擬抗原性質和特異性。
3、 權利要求1所述的血吸蟲抗獨特型抗體NP30嵌合Fab抗體片段,其特徵在於利用上 述獲得的嵌合Fab基因片段，可以在原核細胞、酵母細胞、真核細胞中進行重組表達、製備。
4、 權利要求1所述的血吸蟲抗獨特型抗體NP30的嵌合Fab抗體片段在製備檢測血吸蟲 抗體、抗原製劑，血吸蟲病免疫保護及免疫治療藥物中的應用。
全文摘要
本發明涉及的是一種血吸蟲抗獨特型抗體NP30嵌合Fab抗體片段及製備方法、應用，屬於基因工程技術和製備免疫治療藥物領域。本發明是利用基因工程技術製備鼠源性血吸蟲抗獨特型抗體NP30的嵌合Fab片段，即將鼠源性抗獨特型抗體的重鏈和輕鏈可變區與人IgG1的重鏈部分恆定區(CH1)及輕鏈恆定區(Cκ)進行重組，並插入到原核表達載體pComb3XSS中，進行表達。該嵌合Fab抗體片段保留了鼠源性抗獨特型抗體的模擬抗原性及特異性，可用於血吸蟲病免疫保護及急性血吸蟲病的治療。
文檔編號C07K16/46GK101357944SQ20081015707
公開日2009年2月4日 申請日期2008年9月23日 優先權日2008年9月23日
發明者馮振卿, 朱曉娟, 紅 李, 管曉虹, 靜 許, 顧春燕 申請人:南京醫科大學