一種電轉化熱纖梭菌(Clostridiumthermocellum)的方法
2023-10-09 10:21:14
專利名稱：一種電轉化熱纖梭菌(Clostridium thermocellum)的方法
技術領域：
本發明涉及微生物基因工程領域，具體是ー種電轉化熱纖梭菌(Clostridiumthermocellum)的萬法。
背景技術：
隨著經濟與社會發展的持續加速，能源資源短缺和環境汙染問題日益突出，加快生物質能的開發和利用，對於緩解國家能源供需矛盾，有效保護生態環境，促進社會可持續發展具有積極的推動作用。發展可再生能源資源，保障國家能源安全，將成為ー項重要戰略任務，而纖維素こ醇的開發和利用，有望解決上述問題(wu 2002 ；Cruz 2010 ；Service2010)。生物質能源作為新興能源之一，據估計，在未來50年將佔全球總能耗的40%以上。它作為ー種新型的清潔能源，是正在使用的汽車燃料的理想替代品。纖維素是地球上最廉價、最豐富的可再生資源之一，應用纖維素作為原料可以有效地避免こ醇生產和糧食、飼料供給的矛盾。同吋，由於纖維素也是太陽能的轉化載體之一，生產和利用纖維素こ醇，並不會引起環境中CO2總量的増加。因此，纖維素生物質已成為大規模燃料こ醇生產極具吸引力的原料。整合生物技術(Consolidated bioprocessing CBP)是指將纖維素酶和半纖維素酶生產、纖維素水解和こ醇發酵過程組合或部分組合，通過ー種微生物完成。CBP在纖維素生物質能源轉化產こ醇中具有無可替代的優越性，它可以同步實現纖維素酶的生產、纖維素的水解和發酵產こ醇。統計表明，以纖維素為底物，通過CBP技術每生產I加侖的こ醇總的耗費是 4. 23 <2 ,而通過 SSCF (Simultaneous Saccharification and Co-Fermentation)技術是18. 9 0 (生產纖維素酶的花費佔8. 95 <2 )，因此CBP是纖維素生物質能源轉化的首選(Lynd，Zyl et al. 2005)。發展實現CBP功能的微生物主要通過兩個途徑ー是基因工程改造水解纖維素的微生物來提高目標產品(如こ醇)的產量，ニ是基因工程改造非纖維素水解微生物，異源表達纖維素酶系統，從而生產目標產品(如こ醇)。其中熱纖梭菌(Clostridium thermocellum)和纖維降解梭菌(Clostridium cellulolyticum)分別代表CBP在降解木質纖維素的高溫和中溫模式菌株(Ng, Weimer et al. 1977 ；Desvaux 2005 ；Zhang 2005)。熱纖梭菌(Clostridium thermocellum)是一類能夠在高溫下(60°C )發酵纖維素生產こ醇、こ酸、乳酸、CO2和H2的革蘭氏陽性、厭氧菌，是目前所知的能夠利用纖維素產こ醇等能源的最好的微生物。原因是，在降解纖維素方面，熱纖梭菌(Clostridiumthermocellum)具有突出的優點1、能夠使糖化和發酵同步進行；2、厭氧生長,減少供氧的花費；3、細胞密度小，有利於こ醇的轉化；4、高溫生長，有助於こ醇的回收，降低冷卻的費 用，減少汙染的概率；5、可以與其他產こ醇及利用戍糖的微生物共培養(Demain, Newcombet al. 2005 ；Zhang 2005 ；Islam, Cicek et al. 2008)。然而，利用熱纖梭菌(Clostridium thermocellum)產こ醇，也存在諸多的技術難題，例如こ醇產率太低，こ醇耐受性較差，副產品較多等，因此，利用分子生物學手段，對熱纖梭菌(Clostridium thermocellum)進行遺傳改造，以達到最大的投入產出比迫在眉睫。令人遺憾的是，該微生物沒有通用、快速的基因轉化方法，從而限制了基因工程改造的實施。JeffreyA. Sands曾經嘗試轉化熱纖梭菌(Clostridium thermocellum)的原生質體，但是其成活率低，僅有 0. 2%左右(Gottlund,Montenecourt et al. 1988)。Lee R. Lynd 實驗室對熱纖梭菌(Clostridium thermocellum)成功進行了遺傳改造(Tyurin, Desai etal. 2004 ；Tyurin, Sullivan et al. 2005 ；01son, Tripathiet al. 2010 ；Tripathi, Olsonet al. 2010)，但是，關鍵電轉化過程所使用的電轉化儀需定製生產，且尚未商業化，由於大多數的實驗室不能配備相同性 能的電轉儀，所以，熱纖梭菌(Clostridium thermocellum)的電轉化成為了基因工程改造該菌株的瓶頸。針對目前應用常規商業化電轉儀仍沒有成功轉化的現狀，本發明使用細胞前處理與普通電轉化儀器相結合的方法，使得轉化熱纖梭菌(Clostridium thermocellum)成為ロ丁倉K。
發明內容
本發明開發了ー種適用普通商用電轉儀快速轉化熱纖梭菌(Clostridiumthermocellum)的方法。所要解決的技術問題可以通過以下方案實現熱纖梭菌(Clostridium thermocellum)是ー種高溫、厭氧、纖維素降解菌,其能在60°C下快速生長，分解纖維素、半纖維素為纖維ニ糖、木糖、木聚ニ糖等，並利用分解產生的小分子物質生產こ醇、こ酸、乳酸、CO2和h2。本發明所採用Clostridium thermocellum ATCC27405菌株,採用的抗生素為抑制細胞壁合成的抗生素如青黴素G鈉鹽和氨苄青黴素等，採用的商業化的電轉儀為BTXECM630 型電轉儀或 BIO-RED Gene Pulser Xcell 型電轉儀。本發明以抑制細菌細胞壁合成的抗生素(如青黴素、氨苄青黴素等)前處理Clostridiumthermocellum細胞，然後使用普通商業化電轉儀轉化Clostridiumthermocellum細胞,主要包括以下步驟I.電轉化細胞的活化。電轉化細胞活化培養基為GS-2培養基，其配方如2所示，將-80°C凍存的Clostridium thermocellum菌種，按一定比例接種至預熱的GS-2培養基中，60°C培養至OD = 0.4左右。2. GS-2 培養基配方。KH2PO4L 5g, K2HP042. 9g, Urea 2. lg, MgCl2. 6H20 I. Og,CaCl2. 2H20150mg, FeSO4. 6H20 I. 25mg, Cysteine hydrochloride I. Og, Resazurin 2. Og,Cellobiose 5. Og, Morpholinopropane sulfonic acid(MOPS)10. Og, Yeast extract
6.Og, Sodium citrate. 2H20 3. Og,加入蒸懼水定容至 1L。3.接種。將培養好的種子液按一定比例接入厭氧瓶中。4.培養。溫度60°C，厭氧，pH值為7. 4。培養至OD = 0. 2-0. 5，此時加入青黴素G鈉鹽或氨苄青黴素，使得其終濃度為IO-IOOii g/ml，繼續在37°C -60°c培養1_5小吋。5.收集菌體。在厭氧箱中將菌體轉入帶蓋50ml離心管中，置於冰上10_30分鐘。4°C、3000g離心10分鐘收集菌體。6.製作感受態細胞。使用無氧電轉緩衝液，配方如7所示，洗滌菌體3次，每次都以4°C、3000g離心10分鐘離心收集菌體，離心過程中使用帶蓋、可隔離氧氣的離心管。最終將所得菌體溶於500 ill電轉緩衝液中。7.電轉緩衝液配方。0. 2M纖維ニ糖，磷酸鹽緩衝系統(pH = 7. 0-8. 0)，10%甘油，0.01M MgCl2，使用電阻為18Q的去離子水配製電轉緩衝液。8.電轉化。吸取20 ii I感受態Clostridium thermocellum細胞,加入待轉化的質粒 DNA 5u g,電轉條件為電壓 I. 5KV-2. 5KV、電阻 50 Q -600 Q、電容 25 u F-50 U F。9.轉化後復甦。使用復甦培養基，51°C -58°C、15_18小時復甦轉化後的Clostridiumthermocellum細胞,復甦培養基配方如10所不。
10.復甦培養基配方。KH2PO4L 5g, K2HP042. 9g, U rea 2. lg, MgCl2. 6H20 I. Og,CaCl2. 2H20150mg, FeSO4. 6H20 I. 25mg, Cysteine hydrochloride I. Og, Resazurin 2. Og,Ce丄丄obiose5. 0g，Morpholinopropane sulfonic acid(MOPS)10. Og, Yeast extract 6. Og,Sodium citrate. 2H20 3. Og,鹿糖、纖維ニ糖或甘露糖(醇)0. 1-0. 27M,加入蒸懼水定容至Iし11.陽性克隆篩選。取一定量的轉化後Clostridium thermocellum菌液,與55 °C、0. 5-0. 7%瓊脂濃度GS-2培養基混合，鋪平板，室溫放置30分鐘後，使用MGC AnaeroPack厭氧系統置於58°C培養5-8天。按照以上步驟,轉化Clostridium thermocellum細胞是本技術領域的技術人員能夠實現的。本發明開發的轉化Clostridium thermocellum的方法,基於抑制細胞壁合成的抗生素，首先弱化Clostridium thermocellum細胞壁,然後使用普通的商業化電轉儀，實現快速將外源DNA導入Clostridium thermocellum細胞，突破了電轉化Clostridiumthermocellum細胞需使用定製電轉儀且前處理細胞操作繁瑣的缺點，為進一歩人工改造Clostridium thermocellum奠定了基礎,有利於構建高產こ醇、高こ醇耐受性或高氧氣耐受性的エ業化菌株。
無
具體實施例方式實施例I :pIKMl 質粒電轉化 Clostridium thermocellum ATCC27405 菌株。I.將 _80°C凍存的 Clostridium thermocellum ATCC27405 菌種，按 1/1000 的比例接種至4ml預熱的GS-2培養基中，60°C培養至OD = 0. 4左右。2.將培養好的種子液按1/1000比例接入裝有50ml GS-2培養基的厭氧瓶中。3. GS-2 培養基按配方KH2PO41. 5g, K2HP042. 9g, Urea 2. lg, MgCl2. 6H20 I. Og,CaCl2. 2H20 150mg, FeSO4. 6H20 I. 25mg, Cysteine hydrochloride I. Og, Resazurin 2. Og,Cellobiose 5. Og, Morpholinopropane sulfonic acid(MOPS)10. Og, Yeast extract6. Og,Sodium citrate. 2H20 3. Og,加入蒸懼水定容至 1L。4.培養溫度60°C，厭氧，pH值為7. 4，培養至OD = 0.2，此時加入青黴素G鈉鹽，使得其終濃度為10 U g/ml，繼續在37°C培養2小吋。5.在厭氧箱中將菌體轉入50ml帶蓋離心管中，置於冰上10分鐘，4°C、3000g離心10分鐘收集菌體。
6.使用無氧電轉緩衝液，配方如7所示，洗滌菌體3次，毎次都以4°C、3000g離心10分鐘收集菌體，離心過程中使用帶蓋、可隔離氧氣的離心管。最終將所得菌體溶於500 u I電轉緩衝液中。7.電轉緩衝液配方0. 2M纖維ニ糖，磷酸鹽緩衝系統(pH = 7. 0-8. 0)，10%甘油，0.01M MgCl2，使用電阻為18Q的去離子水配製電轉緩衝液。8.吸取20 ii I感受態Clostridium thermocellum細胞,加入5 ii g待轉化的質粒DNA,電轉條件為電壓2. 5KV、電阻200 Q、電容25 U F。9.使用復甦培養基，51°C、18小時復甦轉化後Clostridium thermocellum細胞，復甦培養基配方如10所示。10.復甦培養基配方=KH2PO4L 5g, K2HP042. 9g, Urea 2. lg, MgCl2. 6H20 I. Og,CaCl2. 2H20150mg, FeSO4. 6H20 I. 25mg, Cysteine hydrochloride I. Og, Resazurin 2. Og,Ce丄丄obiose5. 0g，Morpholinopropane sulfonic acid(MOPS)10. Og, Yeast extract 6. Og,Sodiumcitrate. 2H20 3. Og,甘露糖0. 27M,加入蒸懼水定容至1L。11.取一定量的轉化後 Clostridium thermocellum菌液,與 55°C、0. 7%瓊脂濃度GS-2培養基混合，鋪平板，室溫放置30分鐘後，使用MGC AnaeroPack厭氧系統置於58°C培養7天。12.轉化率為KT2-IO1陽性轉化子/ U g質粒DNA。實施例2 pIKMl 質粒電轉 Clostridium thermocellumATCC27405 菌株。I.將 _80°C凍存的 Clostridium thermocellum ATCC27405 菌種，按 1/1000 接種至4ml預熱的GS-2培養基中，60°C培養至OD = 0. 4左右。2.將培養好的種子液按1/1000比例接入裝有50ml GS-2培養基的厭氧瓶中。3. GS-2 培養基按配方KH2PO41. 5g, K2HP042. 9g, Urea 2. lg, MgCl2. 6H20 I. Og,CaCl2. 2H20 150mg, FeSO4. 6H20 I. 25mg, Cysteine hydrochloride I. Og, Resazurin2. Og,Cellobiose 5. Og, Morpholinopropane sulfonic acid(MOPS)10. Og, Yeast extract6. Og,Sodium citrate. 2H20 3. Og,加入蒸懼水定容至 1L。4.培養溫度60°C，厭氧，pH值為7. 4，培養至OD = 0.3，此時加入青黴素G鈉鹽，使得其終濃度為30 u g/ml，繼續在45°C培養2小吋。5.在厭氧箱中將菌體轉入50ml帶蓋離心管中，置於冰上10分鐘，4°C、3000g離心10分鐘收集菌體。6.使用無氧電轉緩衝液，配方如7所示，洗滌菌體3次，毎次都以4°C、3000g離心10分鐘收集菌體，離心過程中使用帶蓋、可隔離氧氣的離心管。最終將所得菌體溶於500 u I電轉緩衝液中。7.電轉緩衝液配方0. 2M纖維ニ糖，磷酸鹽緩衝系統(pH = 7. 0-8. 0)，10%甘油，
0.01M MgCl2，使用電阻為18Q的去離子水配製電轉緩衝液。8.吸取20 ii I感受態Clostridium thermocellum細胞,加入5 U g待轉化的質粒DNA,電轉條件為電壓2. 0KV、電阻100 Q、電容25 U F。9.轉化後復甦。使用復甦培養基，51 °C、18小時復甦轉化後Clostridium thermocellum細胞,復甦培養基配方如10所示。10.復甦培養基配方=KH2PO4L 5g, K2HP042. 9g, Urea 2. lg, MgCl2. 6H20 I. Og,CaCl2. 2H20150mg, FeSO4. 6H20 I. 25mg, Cysteine hydrochloride I. Og, Resazurin 2. Og,Cellobiose5. Og, Morpholinopropane sulfonic acid(MOPS)10. Og, Yeast extract 6. Og,Sodiumcitrate. 2H20 3. Og,鹿糖 0. 27M,加入蒸懼水定容至 1L。11.取一定量的轉化後 Clostridium thermocellum菌液,與 55°C,0. 7%瓊脂濃度GS-2培養基混合，鋪平板，室溫放置30分鐘後，使用MGC AnaeroPack厭氧系統置於58°C培養7天。12.轉化率為KT2-IO1陽性轉化子/ U g質粒DNA。實施例3 pIKMl 質粒電轉 Clostridium thermocellumATCC27405 菌株。I.將 _80°C凍存的 Clostridium thermocellum ATCC27405 菌種，按 1/1000 接種至4ml預熱的GS-2培養基中，60°C培養至OD = 0. 4左右。2.將培養好的種子液按1/1000比例接入裝有50ml GS-2培養基的厭氧瓶中。3. GS-2 培養基按配方KH2PO41. 5g, K2HP042. 9g, Urea 2. lg, MgCl2. 6H20 I. Og,CaCl2. 2H20 150mg, FeSO4. 6H20 I. 25mg, Cysteine hydrochloride I. Og, Resazurin2. Og,Cellobiose 5. Og, Morpholinopropane sulfonic acid(MOPS)10. Og, Yeast extract6. Og,Sodium citrate. 2H20 3. Og,加入蒸懼水定容至 1L。4.溫度60°C，厭氧，pH值為7. 4，培養至OD = 0. 4，此時加入青黴素G鈉鹽，使得其終濃度為50 u g/ml，繼續在60°C培養2小吋。5.在厭氧箱中將菌體轉入50ml離心管中，置於冰上10分鐘。4°C、3000g離心10分鐘收集菌體。6.使用無氧電轉緩衝液，配方如7所示，洗滌菌體3次，毎次都以4°C、3000g離心10分鐘收集菌體，離心過程中使用帶蓋、可隔離氧氣的離心管。最終將所得菌體溶於500 u I電轉緩衝液中。7.電轉緩衝液配方0. 2M纖維ニ糖，磷酸鹽緩衝系統(pH = 7. 0-8. 0)，10%甘油，
0.01M MgCl2，使用電阻為18Q的去離子水配製電轉緩衝液。8.吸取20 ii I感受態Clostridium thermocellum細胞,加入5 ii g待轉化的質粒DNA,電轉條件為電壓I. 5KV、電阻50 Q、電容25 U F。9.轉化後復甦。使用復甦培養基，51 °C、18小時復甦轉化後Clostridiumthermocellum細胞,復甦培養基配方如10所示。10.復甦培養基配方。KH2PO4L 5g, K2HP042. 9g, Urea 2. lg, MgCl2. 6H20 I. Og,CaCl2. 2H20150mg, FeSO4. 6H20 I. 25mg, Cysteine hydrochloride I. Og, Resazu rin 2. Og,Ce丄丄obiose5. 0g，Morpholinopropane sulfonic acid(MOPS)10. Og, Yeast extract 6. Og,Sodiumcitrate. 2H20 3. Og,纖維ニ糖0. 27M,加蒸懼水入定容至1L。11.陽性克隆篩選。取一定量的轉化後Clostridium thermocellum菌液,與55 °C、
0.7%瓊脂濃度GS-2培養基混合，鋪平板。室溫放置30分鐘後，使用MGC AnaeroPack厭氧系統置於58°C培養7天。12.轉化率為KT2-IO1陽性轉化子/ U g質粒DNA。以上是結合具體實施例子對本發明所做的進ー步描述。本行業的技術人員應該了解，本發明不受上述實施例的限制，上述實施例和說明書中描述的只是說明本發明的原理，在不脫離本發明精神和範圍的前提下，本發明還會有各種變化和改進，這些變化和改進都在要求保護的本發明範圍內。本發明要求保護範圍由所附的權利要求書及其等效物界定。參考文獻
Cruz, L. R. L. a. c. h. d. b. (2010). " Make Way for Ethanol. " Science330(11) :1176. Demain, A. L，M. Newcomb, et al. (2005). " Cellulase，clostridia, andethanol. " Microbiol Mol Biol Rev 69(1) :124-154.Desvaux, M. (2005). " Clostridium cellulolyticum model organism ofmesophilic cellulolytic clostridia. " FEMS Microbiol Rev 29(4) :741-764.Gottlund，K. L，B. S. Montenecourt, et al. (1988). " Protoplast formationand cell wall regeneration in< ；u> ；Clostridium< ；/u> ；&11 ；u> ；thermocellum< ；/u>. " Biotechnology Techniques 2(2) :137-140.Islam，R.，N. Cicek，et al. (2008). " Influence of initial celluloseconcentration on the carbon flow distribution during batch fermentation byClostridium thermocellum ATCC 27405. " Applied Microbiology and Biotechnology82(1) :141-148.Lynd, L. , W. Zyl, et al. (2005). " Consolidated bioprocessing of cellulosicbiomass an update. " Current Opinion in Biotechnology 16(5) :577-583.Ng, T. K.，T. K. Weimer, et al. (1977). " Cellulolytic and physiologicalproperties of Clostridium thermocellum. " Arch Microbiol 114(1) :1-7.Olson, D. G.，S. A. Tripathi，et al. (2010). " Deletion of the Cel48Scellulase from しlostridium thermocellum. " Proceedings of the National Academyof Sciences 107(41) :17727-17732.Service, R. F. (2010). " Is There a Road Ahead For CellulosicEthanol " Science 329(8) :784-785.Tripathi, S. A.，D. G. Olson, et al. (2010). " Development of pyrF-BasedGenetic System for Targeted Gene Deletion in しlostridiuim thermocellum andCreation of a pta Mutant. " Applied and Environmental Microbiology 76(19)6591-6599.Tyurin, M. V.，S.G.Desai，et al. (2004). " Electrotransformation ofClostridium thermocellum. " Applied and Environmental Microbiology 70(2)883-890.Tyurin, M. V.，C. R. Sullivan, et al. (2005). " Role of Spontaneous CurrentOscillations during High-Efficiency Electrotransformation of ThermophilicAnaerobes. " Applied and Environmental Microbiology 71 (12) :8069-8076.wu, q. -s. (2002). 」 study on energ strategic evaluation of china. 」 chinaindustrial economy 6(171) :13-21.Zhang, Y. H. P. (2005). " Cellulose utilization by Clostri diumthermocellum Bioenergetics and hydrolysis product assimilation. Proceedingsof the National Academy of Sciences 102(20) :7321-7325.
權利要求
1.ー種電轉化熱纖梭菌(Clostridium thermocellum)的方法,其特徵是,首先以抑制細菌細胞壁合成的抗生素(如青黴素、氨節青黴素等)前處理Clostridium thermocellum細胞，然後使用普通商業化電轉儀轉化Clostridium thermocellum細胞,從而達到將外源DNA 導入熱纖梭菌(Clostridium thermocellum)的目的。
2.根據權利要求I所述的方法，其所述電轉化前處理熱纖梭菌(Clostridiumthermocellum)的抗生素為,所有能夠抑制或阻礙該菌株細胞壁合成的抗生素(如青黴素G、青黴素G鈉鹽、氨苄青黴素等)或非抗生素類物質(如蘇氨酸、異煙肼、絲氨酸等)，之一或它們之間的任何組合。
3.根據權利要求I所述的方法，其特徵是所用菌株為熱纖梭菌屬(Clostridiumthermocellum)ATCC27405菌株或其他菌株如(LQRl)，以及在它們基礎上進行的任何突變株。
4.如權利要求I所述的方法，其特徵是所述電轉化系統為商業化電轉化儀器所能達到的所有電轉化設置參數組合。
5.如權利要求I所述的方法，其特徵是電轉化緩衝液的pH值為5.0-10. O。
6.如權利要求I所述的方法，其特徵是復甦培養基為在GS-2中加入蔗糖或纖維ニ糖或甘露糖(醇)等，且在溶液中的終濃度為0. 1M-0. 3M。
全文摘要
本發明屬於微生物基因工程領域，具體是一種電轉化嗜熱、厭氧、纖維素降解菌株——熱纖梭菌(Clostridium thermocellum)的方法。其特徵是，首先以抑制細菌細胞壁合成的抗生素(如青黴素、氨苄青黴素等)前處理Clostridium thermocellum細胞，然後使用普通商業化電轉儀轉化Clostridium thermocellum細胞，從而達到將外源DNA導入熱纖梭菌(Clostridium thermocellum)的目的。本方法的優點在於，將外源DNA通過普通商業化電轉化儀，快速導入熱纖梭菌細胞，為實現對該菌株的基因工程操作(如基因過表達、基因敲除等)，及構建適合工業生產乙醇的基因工程菌株奠定基礎。
文檔編號C12R1/145GK102653770SQ201110048349
公開日2012年9月5日 申請日期2011年3月1日 優先權日2011年3月1日
發明者劉亞君, 崔古貞, 崔球, 洪偉 申請人:中國科學院青島生物能源與過程研究所