大量生產抗微生物肽的方法
2023-10-09 11:12:09 1
專利名稱：大量生產抗微生物肽的方法
背景技術：
發明領域本發明涉及大量生產抗微生物肽的方法，更具體地說，涉及通過基因操作手段生產有外源肽的融合蛋白質形式的抗微生物肽的大量生產抗微生物肽的方法。現有技術的描述總的來說，抗微生物肽受物理和化學因素例如加熱、鹼等作用時不易於失去它們的生物學活性。而且，它們不易於誘導對微生物的抗性，因為它們通過其特徵性作用機理顯示抗微生物活性，顯然它們的作用機理與常規抗生素有區別。因此，在藥劑學、食品等領域抗微生物肽已經具有高工業實用性。
但是，抗微生物肽在工業上應用存在極困難的問題，因為常規技術不允許以低價格大量生產這樣的肽。例如，化學合成不能以經濟合理的方式大量生產抗微生物肽。關於這一點，本領域內技術人員已經提出了使用重組微生物的遺傳工程技術作為一種可替代的方法。但是，該方法也已經顯示了產量低的缺點，因為表達的抗微生物肽抑制重組微生物的生長。
美國專利5,205,154公開了包括抑制殺菌肽的抗微生物活性的載體多肽基因和殺菌肽的基因的基因構建體，其中araB用作為載體多肽，儘管載體多肽的特性不是關鍵的。
美國專利5,593,866教導了用於製備帶正電的抗微生物肽的方法，所述肽為與帶負電的肽融合的蛋白質，以抑制細菌蛋白質的裂解，其中將穀胱甘肽-S-轉移酶、蛋白質A、蛋白質A的IgG-結合區域、銅綠假單孢菌的F蛋白質或前防衛素原用作為帶負電的肽。
因此，非常需要研製和開發用於以經濟方式大量生產抗微生物肽的可替代的方法。發明概述本發明人已經對解決製備抗微生物肽的過程中低產量和低經濟效率的缺點進行了嘗試，並且藉助於重組DNA技術以大規模和經濟的方式成功地製備了抗微生物肽。
本發明的首要目的是提供在重組微生物中大量生產抗微生物肽的方法，該方法使用了可以大量生產抗微生物肽的表達系統。附圖簡述根據下面給出的描述以及結合附圖，本發明的上述和其它目的和特徵是顯而易見的，其中
圖1(A)顯示了Guamerin基因的核苷酸序列(SEQ ID NO1)和從其轉譯的胺基酸序列(SEQ ID NO2)。
圖1(B)顯示MMIS(修飾的爪蟾抗菌肽插入片段)基因的核苷酸序列(SEQ ID NO3)和從其轉譯的胺基酸序列(SEQ ID NO4)。
圖2(A)是顯示通過PCR對Guamerin基因與Buforin II基因的融合產物(SEQ ID NO5)進行構建的方案圖解。
圖3是顯示利用基因擴增載體構建多聚體融合基因的構建方案圖解。
圖4(A)是顯示含有抗微生物肽MSI-78的基因和Guamerin基因的融合基因(基因I)(SEQ ID NO7)的構建方案圖解。
圖4(B)是顯示含有抗微生物肽MSI-78的基因和Guamerin基因的融合基因(基因II)(SEQ ID NO8)的構建方案圖解。
圖5(A)是用含有包括Guamerin或MMIS的多聚體融合基因的載體轉化的大腸桿菌在誘導蛋白質表達之後的細胞裂解物的SDS-PAGE模式。
圖5(B)是用含有前爪蟾抗菌肽原基因的載體轉化的大腸桿菌在誘導蛋白質表達之後的細胞裂解物的SDS-PAGE模式。
圖6是用含有包括Guamerin基因和各種抗微生物肽的基因的融合基因的載體轉化的大腸桿菌在誘導蛋白質表達之後的細胞裂解物的SDS-PAGE模式。
圖7是用含有包括Guamerin基因和各種抗微生物肽的融合基因的載體轉化的大腸桿菌在誘導蛋白質表達之後的細胞裂解物的SDS-PAGE模式。發明詳述本發明的大量生產抗微生物肽的方法包括下列步驟構建含有編碼具有至少兩個半胱氨酸殘基的酸性肽的第一個基因和編碼鹼性抗微生物肽的第二個基因的融合基因；用包括該融合基因的表達載體轉化宿主微生物；培養轉化的微生物以表達含有酸性肽和抗微生物肽的融合肽；和從該融合肽回收抗微生物的肽。
在實施本發明時，本質上需要包括編碼具有至少兩個半胱氨酸殘基的酸性肽的第一個基因和編碼鹼性抗微生物肽的第二個基因的基因構建體，以及包括可操作連接到含有編碼具有至少兩個半胱氨酸殘基的酸性肽的第一個基因和編碼鹼性抗微生物肽的第二個基因的序列的啟動子的表達載體，該融合基因以單體或多體的方式存在。
與美國專利5,593,866的結果相反，本發明人發現通常的酸性肽基因不允許鹼性抗微生物肽進行有效的表達；並且酸性肽中的至少兩個半胱氨酸殘基的存在能夠有效地解決所述的問題。
對於本發明的基因構建體，第一個基因編碼為具有至少兩個半胱氨酸殘基和基本上中和抗微生物肽的正電荷的酸性肽。儘管酸性肽的長度沒有限制，當考慮正電荷的長度和分布時優選的是它等同於或長於抗微生物肽的長度以便有效地中和所需的抗微生物肽的電荷。此外，酸性肽具有兩個或多個半胱氨酸殘基。推測由於藉助於二硫鍵形成次級結構，半胱氨酸殘基促進了酸性肽的負電荷和抗微生物肽的正電荷之間的相互作用。
根據本發明，可以採用人工方法合成或在天然酸性肽中選擇酸性肽，並且可以利用編碼肽的合成基因獲得或從自然界分離。人工設計的酸性肽具有兩個或多個半胱氨酸殘基，可以將天然的酸性肽修飾為具有足夠的半胱氨酸殘基。為了易於與編碼抗微生物肽的第二個基因融合，易於從融合肽分離抗微生物肽，或製備融合基因的各種多聚體形式，也可以以各種方式修飾酸性肽基因。
例如，可以合成或修飾酸性肽基因以便可以將它連接到抗微生物肽基因，從而具有正確的閱讀框架，導致產生所需的抗微生物肽。也可以合成或修飾酸性肽基因以使之包括編碼特異性蛋白酶或化學產品的裂解位點的核苷酸序列，以便從表達的融合肽分離抗微生物的肽。
可以在酸性肽基因的單體或多體中選擇具有最適合於中和抗微生物肽的長度的酸性肽基因。通過使用基因擴增技術可以製備酸性肽基因的多體。例如，通過將在含有兩個以相反方向定位的IIS類選擇性酶位點的載體的兩個IIS類選擇性酶位點之間插入酸性肽基因，用IIS類選擇性酶位點消化載體，分離含有酸性肽基因的DNA片段，自體連接分離的DNA片段以製備多體，並且將各個多體克隆到用IIS類選擇性酶消化的該載體，能夠製備包括酸性肽基因的多體的載體(參見Lee，J.H.等人，遺傳分析生物分子工程學，13139-145(1996))。
根據本發明，可以人工設計或在天然酸性肽中選擇抗微生物的肽，並且可以利用編碼所需肽的合成基因獲得或從自然界分離。為了易於與酸性肽基因融合，易於從融合肽分離抗微生物的肽，或製備各個多體形式的融合基因，可用各個方法修飾抗微生物的肽基因。
例如，可以對抗微生物的肽基因進行修飾以便可以以正確的閱讀框架將抗微生物肽的C-末端的區域連接到酸性肽的N-末端區域(抗微生物肽基因I)。
還可以將抗微生物肽的基因進行修飾以便在抗微生物肽的N-末端包括編碼由特定的蛋白酶或化學物質裂解的位點的核苷酸序列，以便從表達的融合肽分離抗微生物的肽，並且在抗微生物肽的C-末端包括允許肽合成終止的核苷酸序列(抗微生物肽基因II)。
另外，可以將抗微生物的肽基因進行修飾以在抗微生物肽的N-末端和C-末端包括編碼特定的蛋白酶或化學物質的裂解位點的核苷酸序列(例如，編碼由CNBr裂解的甲硫氨酸殘基的密碼子)，以便從表達的融合肽分離抗微生物的肽(抗微生物肽基因III)。
通過將酸性肽基因和如上所述製備的抗微生物肽基因連接可以製備融合基因，並且酸性肽基因或抗微生物肽基因可以是如上所述的單體或多體。
根據本發明，融合基因含有編碼酸性肽的第一基因和編碼抗微生物肽的第二基因，這些基因可以通過直接或藉助於連接段等間接連接，只要兩個基因以正確的閱讀框架連接。
在本發明的優選的實施方案中，通過將酸性肽基因和抗微生物肽基因修飾以在各個基因的單鏈的3』-末端具有互補的核苷酸序列，藉助於部分雜交將兩個基因退火，用雜交的基因作為模板和對應於各個單鏈基因的5』末端的序列作為引物進行PCR，可以製備融合基因。
採用本領域內的常規方法，例如融合基因的自體連接，可以將由此製備的各種數量的融合基因的單體連接以製備該融合基因的各種多體。通過使用基因擴增系統也可以製備融合基因的多體，例如，通過將在含有兩個以相反方向定位的IIS類選擇性酶位點的載體的兩個IIS類選擇性酶位點之間插入該融合基因，用IIS類選擇性酶位點消化該載體，分離含有融合基因的DNA片段，自體連接分離的DNA片段以製備該融合基因的多體，並且將融合基因的多體克隆到用IIS類選擇性酶消化的載體，能夠製備包括融合基因的多體的載體。
在本發明的一個優選的實施方案中，融合基因的多體是包括抗微生物肽基因III的融合基因的多體。
在本發明的一個優選的實施方案中，融合基因的多體是其中將包括抗微生物肽基因II的融合基因連接到包括抗微生物肽基因I的融合基因的單體或多體的3』-末端的多體。
在本發明的一個優選的實施方案中，融合基因的多體是其中將包括抗微生物肽基因II的融合基因連接到包括抗微生物肽基因III的融合基因的單體或多體的3』-末端的多體。
可以將融合基因的多體克隆到合適的表達載體並且在微生物例如大腸桿菌中表達，從而表達融合肽的多體。用一種酶或化學物質例如CNBr處理融合肽的多體以去除酸性肽並且將抗微生物肽分離為單體，利用陽離子交換層析等純化抗微生物的肽。當用一種酶或化學物質例如CNBr處理多體表達之後獲得融合肽的多體，可以獲得單體的天然形式的存在於多體的末端的抗微生物肽。
在下面的實施例中進一步描述本發明，這些實施例不應該被認為用於限制本發明的範圍。特別是，由於實施例中使用的抗微生物肽，酸性肽和它們的多體僅僅是本發明的優選的實施方案，本發明覆蓋了為了大量生產各個鹼性抗微生物肽目的而使用含有至少兩個半胱氨酸殘基的酸性肽的所有發明的內容。
實施例1酸性肽的選擇將具有大量半胱氨酸殘基的天然的Guamerin(下文中稱之為「G」；Jung，H.I.等人(1995)生物化學雜誌，27013879-13884)和修飾的MIS(下文稱之為「M」；Zasloff，M.(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，845449-5453)用作酸性肽。如在附圖1(A)和1(B)(其中僅顯示有意義鏈)中看到的，合成了編碼酸性肽的單鏈寡聚核苷酸(SEQ ID NO1和SEQ IDNO3)。
以相同的摩爾比將由此合成的寡聚核苷酸溶解於TE緩衝液(pH8.0)，在70℃加熱10分鐘，並且在0℃保持30分鐘。在20％(W/V)聚丙烯醯胺凝膠電泳之後，分離雙鏈DNA片段，並且克隆到用BbsI消化的pBBS1載體(參見Lee，J.H.等人，遺傳分析生物分子工程，13139-145(1996))以構建pBBS1-G1(Guamerin)或pBBS1-M1(MIS)載體。由於利用由此構建的pBBS1-G1或pBBS1-M1可以製備酸性肽基因的多體(pBBS1-Gn或pBBS1-Mn，n＝1，2，3......)，選擇具有中和抗微生物肽最合適的長度的酸性肽。
實施例2抗微生物肽基因的製備為了通過表達融合肽的多體形式的抗微生物肽並且用CNBr處理製備抗微生物肽，將甲硫氨酸密碼子導入到Buforin II(TRSSRAGLQFPVGRVHRLLRK(SEQ ID NO9)(Park，C.B.等，(1996)生物化學和生物物理學研究通訊，218，408-413)，一種抗微生物肽的基因的兩個末端。
合成編碼Buforin II(下文中稱之為「B」)的DNA序列並且克隆到用BbsI消化的pBBS1載體以構建pBBS1-B1載體。獲得的pBBS1-B1載體含有完整的Buforin II基因和在Buforin II基因的兩個末端含有兩個甲硫氨酸密碼子。
實施例3製備含有酸性肽基因和抗微生物肽基因的融合基因為了製備含有實施例1中的酸性肽基因和實施例2中的抗微生物肽基因的融合基因，按照如下所述進行PCR(參見附圖2(A)和2(B))分別利用對應於酸性肽(即Guamerin)基因的5』-末端和3』末端的偶合引物(引物15』-AAAGAAGACGGCCCCCGGTCGACGAGAATGCG-3』(SEQ ID NO10)和引物25』-GCTGCTACGGGTCATGATCCCCGCGCAGGT-3』(SEQ ID NO11))，藉助於PCR技術擴增Guamerin基因。同時，利用分別對應於抗微生物肽(Buforin II)的5』-末端和3』末端的偶合引物(引物35』-ACCTGCGCGGGGATCATGACCCGTAGCAGC-3』(SEQ ID NO12)和引物45』-TGCATGCCTGC AG GTCGA-3』(SEQ ID NO13))，通過PCR擴增Buforin II基因。
將由此擴增獲得的PCR產物以相同的摩爾比例混合併且利用引物1(SEQ ID NO10)和引物4(SEQ ID NO13)通過PCR再擴增。由此獲得的PCR產物用BbsI消化。然後，分離含有Guamerin基因和BuforinII基因的融合基因的片段，並且克隆到用BbsI消化的pBBS1載體以構建pBBS1-(GB)1載體(參見附圖2(A))。
然後，為了使用基因擴增系統製備融合基因的多體，將pBBS1-(GB)1載體用BbsI消化並且分離含有融合基因的片段。分離的DNA片段自體連接以製備多體，並且將各個多體克隆到用BbsI消化的pBBS1載體以構建含有命名為pBBS1-(GB)n(n＝1，2，3，4，......)的融合基因的多體的載體(參見附圖3)。
另一方面，以類似於上面所述的方法，構建pBBS1-(MB)1載體和包括融合基因的多體的載體pBBS1-(MB)n(n＝1，2，3，4，......)，不同的是使用了MIS(含有S-S鍵)作為酸性肽替代Guamerin(參見附圖2(B))。
實施例4用於表達天然的抗微生物肽和其多體的融合基因的製備從實施例3製備的融合基因的多體獲得的抗微生物多肽在其C-末端具有高絲氨酸殘基。為了製備不含有高絲氨酸殘基的天然的抗微生物肽，按照如下所述製備對在實施例3製備的融合基因的序列稍微修飾的融合基因為了該目的，分別將Guamerin用作酸性肽並將MSI-78(GIGKFLKKAKKFGKAFVKILKK-氨基SEQ ID NO14)用作為抗微生物肽。
製備適用於該目的的兩種抗微生物肽基因(下文分別稱之為「BI」和「BII』)，而在製備抗微生物肽基因I時，使由該基因編碼的肽可以在N-末端沒有甲硫氨酸殘基，並且在框架中將C-末端以正確的閱讀框架融合到下列酸性肽基因，在製備抗微生物肽基因II時，使由該基因編碼的肽可以在N-末端具有-個甲硫氨酸殘基，並且使肽的合成可以在C-末端終止。
以類似於實施例3的方式分別將由此製備的抗微生物肽基因I和II連接到酸性肽基因以製備融合基因，和克隆到用BbsI消化的pBBS1載體以分別構建pBBS1-(GBI)1載體和pBBS1-(GBII)1載體(參見附圖4(A)和4(B))。使用基因擴增系統從pBBS1-(GBI)1載體製備GB I融合基因的多體，和將GB II融合基因的單體連接到該多體的末端以構建命名為pBBS1-[(GB I)n(GB II)](n＝0，1，2，3，4，......)的載體。
實施例5抗微生物肽的表達和製備為了在大腸桿菌中表達克隆到實施例3和4中製備的載體的融合基因的多體，將該多體克隆到用BanH I/Hind III消化的pET21c(Novagen，USA)表達載體，並且轉化到大腸桿菌BL21(DE3)，用以表達融合肽的多體。在誘導多體的表達之後，從培養基收集細胞。採用SDS-PAGE分析由此獲得的裂解液(參見附圖5(A))。在附圖5(A)中，泳道M顯示分子量標記物；泳道1顯示不含有表達載體的大腸桿菌的細胞裂解液；泳道2-14顯示分別用pET21c，pET21c-B1，pET21c-B2，pET21c-B4，pET21c-B6，pET21c-(GB)1，pET21c-(GB)2，pET21c-(GB)4，pET21c-(GB)6，pET21c-(MB)1，pET21c-(MB)2，pET21c-(MB)4和pET21c-(MB)6轉化的大腸桿菌的細胞裂解液。如圖5(A)所示，發現與僅含Buforin II的多體相比，該多體的表達顯著地增加了。在含有表達載體的重組大腸桿菌中，最後選擇顯示最大表達的重組體。
將按照如上所述證實其表達的融合肽的多體的包含體懸浮於含有1N鹽酸和6M鹽酸胍的溶液中，用1M CNBr處理。然後，利用Sep-Pak通過反相濃縮收集該肽，通過QAE-Sephadex(Sigma化學公司，USA)陰離子交換層析純化帶正電的抗微生物肽。通過反相HPLC進一步純化由此分離的抗微生物肽以獲得純化的重組抗微生物肽。純化的重組抗微生物肽的生物學活性分析已經顯示它與上面的天然形式具有類似的抗微生物活性。
比較實施例1將具有類似於(MB)6的結構但是不含有半胱氨酸殘基的編碼前爪蟾抗菌肽原的基因(SEQ ID NO15)克隆到pET21b(Novagen，USA)載體並且轉化到大腸桿菌BL21(DE3)。核苷酸序列和由此轉譯的胺基酸序列如下所述(其中底下劃線的序列是爪蟾抗菌肽1或2)前爪蟾抗菌肽原ccaaaggcctctgcggatgaagatatggatgaaagagaggtccggggaattggtP K A S A D E D M D E R E V RG I GaaatttttgcattcagcgggcaaatttggaaaagcttttgtgggagagataatgK F L H S A G K F G K A F V G E I MaagtcaaaacgagatgcagaagcagtaggaccagaggcctttgcagatgaagatK SK R D A E A V G P E A F A D E DttagatgaaagagaggtccggggaattggtaaatttttgcactcagcaaaaaaaL D E R E V RG I G K F L H S A K KtttggaaaagcttttgtgggagagataatgaattcaaaacgagatgcagaagcaF G K A F V G E I M N SK R D A E AgtaggaccagaggcctttgcagatgaagatttagatgaaagagaggtccggggaV G P E A F A D E D L D E R E V R GattggtaaatttttgcactcagcaaaaaaatttggaaaagcttttgtgggagaaI G K F L H S A K K F G K A F V G EataatgaattcaaaacgagatgcagaagcagtaggaccagaggcctttgcagatI M N SK R D A E A V G P E A F A DgaagatttagatgaaagagaggtccggggaattggtaaatttttgcactcagcaE D L D E R E V RG I G K F L H S AaaaaaatttggaaaagcttttgtgggagaaataatgaattcaaaacgagatgcaK K F G K A F V G E I M N SK R D AgaagcagtaggaccagaggcctttgcagatgaagatttagatgaaagagaggtcE A V G P E A F A D E D L D E R E VcggggaattggtaaatttttgcactcagcaaaaaaatttggaaaagcttttgtgRG I G K F L H S A K K F G K A F VggagagataatgaattcaaaacgagatgcagaagcagtaggaccagaggcctttG E I M N SK R D A E A V G P E A FgcagatgaagatttagatgaaagagaggtccggggaattggtaaatttttgcacA D E D L D E R E V RG I G K F L HtcagcaaaaaaatttggaaaagcttttgtgggagagataatgaattcaaaacgaS A K K F G K A F V G E I M N SK Rgatgcagaagcagta(SEQ ID NO15)D A E A V (SEQ ID NO16)收集和裂解經過培養的轉化體。通過SDS-PAGE分析由此獲得的裂解液(參見附圖5(B))。在附圖5(B)中，泳道M顯示分子量標記物(97.4，66.2，45，31，21.5，14.4Kd)；泳道1和2顯示在IPTG誘導之前和之後用pET21b轉化的大腸桿菌的細胞裂解液；泳道3和4顯示在IPTG誘導之前和之後用pET21b-(前爪蟾抗菌肽原)轉化的大腸桿菌的細胞裂解液；如圖5(B)所示，發現當利用相同的表達系統表達沒有半胱氨酸的前爪蟾抗菌肽原時，沒有觀察到前爪蟾抗菌肽原的表達。
比較實施例2用穀胱甘肽-S-轉移酶(GST)序列和來源於HNP-I的作為酸性肽基因的前防衛素原序列和作為抗微生物肽基因的PGQ構建融合基因。
分別用BspLU11I和NcoI處理前防衛素原序列和GST基因並且連接到用NcoI消化的PGQ基因。在酸性肽和抗微生物肽之間導入-個甲硫氨酸殘基以便進一步用CNBr裂解。將獲得的融合基因克隆到pRSET(Invitrogen，USA)載體並且轉化到大腸桿菌HMS174(DE3)。通過SDS-PAGE(參見附圖6)分析融合肽的表達。在附圖6中，泳道M顯示分子量標記物(97.4，66.2，45，31，21.5，14.4Kd)；泳道1顯示大腸桿菌HMS174(DM3)的細胞裂解液；泳道2和3顯示攜帶具有前原防衛素-PGQ和GST-PGQ的融合基因的載體的大腸桿菌的細胞裂解液。
攜帶具有上述融合基因的載體的大腸桿菌細胞的生長被嚴重地抑制了。如圖6所示，發現沒有觀察到有以前防衛素原作為酸性肽的融合肽的表達，而觀察到有以GST作為酸性肽的的非常低的表達。
實施例6包括作為酸性肽基因的Guamerin基因的融合基因的製備對編碼Guamerin的核苷酸序列(SEQ ID NO1)進行稍微的修飾以便其C-末端可以用BspHI消化，當將Guamerin基因融合到抗微生物肽基因時，在抗微生物肽基因的前面可以插入甲硫氨酸密碼子，以便通過CNBr裂解融合肽僅分離到純化的抗微生物肽。
首先，按照如下所述合成含有BamHI和NdeI限制性酶位點的N-末端寡聚核苷酸和含有BamHI和BspHI限制性酶位點的C-末端寡聚核苷酸N-末端寡聚核苷酸5』-CGGGATCCATATGCCCCCGGTCGAC-3』(25聚體)(SEQ ID NO17)C-末端寡聚核苷酸5』-CGGGATCCTCATGATACCCGCGCAG-3』(25聚體)(SEQ IDNO18)
利用由此合成的N-末端和C-末端的寡聚核苷酸引物和Guamerin基因(附圖1)作為模板，進行PCR合成新的Guamerin基因。
對本領域內已知的8個抗微生物肽(參見肽科學，37期，105-122(1995))進行選擇以融合肽形式表達它們，其生物化學特性概括於表1。基於大腸桿菌密碼子的使用從相應的肽序列(SEQ ID NO20；SEQ IDNO22；SEQ ID NO24；SEQ ID NO26；SEQ ID NO28；SEQ IDNO30；SEQ ID NO32；SEQ ID NO34；SEQ ID NO36)推測下面的DNA序列(SEQ ID NO19；SEQ ID NO21；SEQ ID NO23；SEQ ID NO25；SEQ ID NO27；SEQ ID NO29；SEQ ID NO31；SEQ ID NO33；SEQ ID NO35)，並且合成它們備用。Apidaecin Iggt aac aac cgt ccg gtt tac atc ccg cag ccg cgt ccg ccgG N N R P V Y I P Q P R P Pcac ccg cgt act (SEQ ID NO19)H P R I (SEQ ID NO20)Bombininggt atc ggt gcg ctg tct gcg aaa ggt gcg ctg aaa ggt ctgG I G A L S A K G A L K G* Lgcg aaa ggt ctg gcg gaa cac ttc gcg aac (SEQ ID NO21)A K G L A E H F A N (SEQ ID NO22)Cecropin Aaaa tgg aaa ttc aaa aaa atc gaa aaa gtt ggt cag aac atcK W K F K K I E K V G Q N Icgt gac ggt atc atc aaa gcg ggt ccg gcg gtt gcg gtt gttR D G I I K A G P A V A V Vggt cag gcg acc cag atc gcg aaa (SEQ ID NO23)G Q A T Q I A K (SEQ ID NO24)Drosoc1nggt aaa ccg cgt ccg tac tct ccg cgt ccg acc tct cac ccgG K P R P Y S P R P T S H Pcgt ccg atc gcg gtt (SEQ ID NO25)R P I A V (SEQ ID NO26)HNP-Igcg tgc tac tgc cgt atc ccg gcg tgc atc gcg ggt gag cgtA C Y C R I P A C I A G E Rcgt tac ggt acc tgc atc tac cag ggt cgt ctg tgg gcg ttcR Y G T C I Y Q G R L W A Ftgc tgc (SEQ ID NO27)CC (SEQ ID NO28)Indolicidinatc ctg ccg tgg aaa tgg ccg tgg tgg ccg tgg cgt cgtI L P W K W P W W P W R R(SEQ ID NO29)(SEQ ID NO30)Magainin (MST-344*)ggt atc ggc aaa ttc ctg aaa aag gct aag aaa ttt ggt aagG I G K F L K K A K K F G Kgcg ttc gtt aaa atc ctg aaa aag (SEQ ID NO31)A F V K I L K K (SEQ ID NO32)Melittinggt act ggt gcg gtt ctg aaa gtt ctg acc acc ggt ctg ccgG I G A V L K V L T T G L Pgcg ctg atc tct tgg atc aaa cgt aaa cgt cag cagA L I S W I K R K R Q Q(SEQ ID NO33)(SEQ ID NO34)Tachvplesin Iaaa tgg tgc ttc cgt gtt tgc tac cgt ggt atc tgc tac cgtK W C F F V C Y R G I C Y Rcgt tgc cgt (SEQ ID NO35)R C R (SEQ ID NO36)
表1各種抗微生物肽的生物化學特性*
*選自於肽科學，第37期，105-122(1995)通過分別將合成的Guamerin基因與顯示於表1的各種抗微生物肽基因融合製備各種Guamerin-抗微生物肽融合基因。就是說，用BspHI消化合成的Guamerin基因以獲得與BspHI或NcoI裂解位點互補的末端，並且與用NcoI消化的所合成的抗微生物肽基因融合以製備融合基因。
實施例7抗微生物肽的表達為了在大腸桿菌中表達實施例6製備的融合基因，使用pRSET(Invitrogen，USA)表達載體。用BamHI和EcoRI消化表達載體，脫磷酸化，並且克隆在實施例6合成的Guamerin-抗微生物肽融合基因。採用氯化鈣方法用具有融合基因的載體轉化大腸桿菌BL21(DE3)pLysS(參見Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊，第二版(1989))。
於37℃在補充了氨苄青黴素的5毫升LB培養基中培養轉化體過夜。在5毫升的新鮮LB培養基中將培養的細胞稀釋到終濃度為1％(V/V)，並且在37℃培養2小時。然後，將乳糖加入到培養基中至終濃度為2％，在37℃，保溫4小時以誘導融合肽的表達。通過SDS-PAGE分析融合基因的表達(參見附圖7)。在附圖7中，泳道M顯示分子量標記物(97.4，66.2，45，31，21.5，14.4Kd)；泳道1-8顯示用融合基因轉化的大腸桿菌的細胞裂解液，其中分別將編碼apidaecin I，bombinin，殺菌肽A，drosocin，HNP1，indolicidin，melittin和tachyplesin I的基因用作為抗微生物肽基因。
如在上文清楚地闡明和證實的，本發明提供了大量生產抗微生物肽的方法，該方法包括製備具有外源肽的融合肽形式的抗微生物肽的步驟。根據本發明，通過將它與酸性肽融合可以急劇減少表達的抗微生物肽對宿主微生物的生長的抑制作用。因此，從重組微生物可以大規模製備抗微生物的肽，不管抗微生物肽的種類如何。
序列表序列表(1)-般資料(i)申請人(A)姓名SAMYANG GENEX公司等(B)街道263，Yonji-Dong，Chongno-Ku(C)城市漢城(D)州不適用(E)國家韓國(F)郵政編碼(ZIP)110-470(G)電話042-865-8305(H)傳真042-865-8399(ii)發明名稱大量生產抗微生物肽的方法(iii)序列數目36(iv)計算機可讀形式(A)媒介類型Floppy盤(B)計算機IBMPC兼容(C)作業系統PC-DOS/MS-DOS(D)軟體Patent In Release#1.0，版本#1.30(EPO)(2)SEQ ID NOI的資料(i)序列特徵(A)長度183個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈
(D)拓撲結構線性(ii)分子類型DNA(iv)反義不是(vii)直接的來源(B)克隆Guamerin基因(xi)序列描述SEQ ID NO1CCCCCGGTCG ACGAGAATGC GGAGGACACA CATGGTCTCT GCGGGGAAAA 50AACCTGCTCT CCAGCACAAG TCTGTCTAAA CAACGAATGC GTTTGCACTG 100CAATCAGATG CGAGATCTTC TGTCCTAACG GATTCAAAGT TGATGAGAAT 150GGATGCGAAT ACCCATGTAC CTGCGCGGGG ATC183(2)SEQ ID NO2的資料(i)序列特徵(A)長度61個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲結構線性(ii)分子類型肽(vii)直接的來源(B)克隆Guamerin(xi)序列描述SEQ ID NO2Pro Pro Val Asp Glu Asn Ala Glu Asp Thr His Gly Leu Cys15 10Gly Glu Lys Thr Cys Ser Pro Ala Gln Val Cys Leu Asn Asn15 20 25Glu Cys Val Cys Thr Ala Ile Arg Cys Glu Ile Phe Cys Pro30 35 40Asn Gly Phe Lys Val Asp Glu Asn Gly Cys Glu Tyr Pro Cys45 50 55Thr Cys Ala Gly Ile60(2)SEQ ID NO3的資料(i)序列特徵(A)長度81個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型DNA(iv)反義不是(vii)直接的來源(B)克隆MIS(爪蟾抗菌肽插入片段)基因(xi)序列描述SEQ ID NO3CCCCTGTGCG ATGCAGAAGC AGTAGGACCA GAGGCCTTTG CAGATGAAGATTTAGATGAA TGCCCCCGGG TCTTCTAGAG T(2)SEQ ID NO4的資料(i)序列特徵(A)長度27個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲結構線性(ii)分子類型肽(vii)直接的來源(B)克隆MIS(xi)序列描述SEQ ID NO4Pro Leu Cys Asp Ala Glu Ala Val Gly Pro Glu Ala Phe Ala1 5 10Asp Glu Asp Leu Phe Ala Asp Glu Asp Leu Asp Glu Cys15 20 25(2)SEQ ID NO5的資料(i)序列特徵(A)長度84個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲結構線性(ii)分子類型蛋白質(vii)直接的來源(B)克隆Guamerin/BuforinII融合蛋白質(xi)序列描述SEQ ID NO5Pro Pro Val Asp Glu Asn Ala Lys Asp Thr His Gly Leu Cys15 10Gly Glu Lys Thr Cys Ser Pro Ala Gln Val Cys Leu Asn Asn15 20 25Glu Cys Val Cys Thr Ala Ile Arg Cys Met Ile Phe Cys Pro30 35 40Asn Gly Phe Lys Val Asp Lys Asn Gly Cys Glu Tyr Pro Cys45 50 55Thr Cys Ala Gly Ile Met Thr Arg Ser Ser Arg Ala Gly Leu60 65 70Gln Phe Pro Val Gly Arg Val His Arg Leu Leu Arg Lys Met75 80(2)SEQ ID NO6的資料(i)序列特徵
(A)長度46個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲結構線性(ii)分子類型蛋白質(vii)直接來源(B)克隆MIS/BuforinII融合蛋白(xi)序列描述SEQ ID NO6Pro Leu Cys Asp Ala Lys Ala Val Gly Pro Glu Ala Phe Ala15 10Asp Glu Asp Leu Asp Glu Cys Pro Leu Met Thr Arg Ser Ser15 20 25Arg Ala Gly Leu Gln Phe Pro Val Gly Arg Val His Arg Leu30 35 40Leu Arg Lys Met45(2)SEQ ID NO7的資料(i)序列特徵(A)長度84個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲結構線性(ii)分子類型蛋白質(vii)直接來源(B)克隆Guamerin/MIS-78融合蛋白(xi)序列描述SEQ ID NO7Pro Pro Val Asp Glu Asn Ala Glu Asp Thr His Gly Leu Cys15 10Gly Glu Lys Thr Cys Ser Pro Ala Gln Val Cys Leu Asn Asn15 20 25Glu Cys Val Cys Thr Ala Ile Arg Cys Glu Ile Phe Cys Pro30 35 40Asn Gly Phe Lys Val Asp Glu Asn Gly Cys Glu Tyr Pro Cys45 50 55Thr Cys Ala Gly Ile Cys Gly Ile Gly Lys Phe Leu Lys Lys60 65 70Ala Lys Lys Phe Gly Lys Ala Phe Val Lys Ile Leu Lys Lys75 80(2)SEQ ID NO8的資料(i)序列特徵(A)長度84個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲結構線性(ii)分子類型蛋白質(vii)直接來源(B)克隆Guamerin/MIS-78融合蛋白(xi)序列描述SEQ ID NO8Pro Pro Val Asp Glu Asn Ala Glu Asp Thr His Gly Leu Cys15 10Gly Glu Lys Thr Cys Ser Pro Ala Gln Val Cys Leu Asn Asn15 20 25Glu Cys Val Cys Thr Ala Ile Arg Cys Glu Ile Phe Cys Pro30 35 40Asn Gly Phe Lys Val Asp Glu Asn Gly Cys Glu Tyr Pro Cys45 50 55Thr Cys Ala Gly Ile Met Gly Ile Gly Lys Phe Leu Lys Lys60 65 70Ala Lys Lys Phe Gly Lys Ala Phe Val Lys Ile Leu Lys Lys75 80(2)SEQ ID NO9(A)長度21個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲結構線性(ii)分子類型肽(vii)直接來源(B)克隆BuforinII(xi)序列描述SEQ ID NO9Thr Arg Ser Ser Arg Ala Gly Leu Gln Phe Pro Val Gly Arg1 5 10Val His Arg Leu Leu Arg Lys15 20(2)SEQ ID NO10的資料(i)序列特徵(A)長度32個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型DNA(vii)直接來源(B)克隆引物(xi)序列描述SEQ ID NO10AAAGAAGACG GCCCCCGGTC GACGAGAATG CG 32(2)SEQ ID NO11的資料(i)序列特徵(A)長度30個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型DNA(vii)直接來源(B)克隆引物(xi)序列描述SEQ ID NO11GCTGCTACGG GTCATGATCC CCGCGCAGGT 30(2)SEQ ID NO12的資料(i)序列特徵(A)長度30個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型DNA(vii)直接來源(B)克隆引物(xi)序列描述SEQ ID NO12ACCTGCGCGG GGATCATGAC CCGTAGCAGC 30(2)SEQ ID NO13的資料(i)序列特徵
(A)長度18個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型DNA(vii)直接來源(B)克隆引物(xi)序列描述SEQ ID NO13TGCATGCCTG CAGGTCGA18(2)SEQ ID NO14的資料(A)長度22個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲結構線性(ii)分子類型肽(vii)直接來源(B)克隆MSI-78(xi)序列描述SEQ ID NO14Gly Ile Gly Lys Phe Leu Lys Lys Ala Lys Lys Phe Gly Lys15 10Ala Phe Val Lys Ile Leu Lys Lys15 20(2)SEQ ID NO15的資料(i)序列特徵(A)長度825個鹼基對
(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型DNA(iv)反義不是(vii)直接來源(B)克隆前爪蟾抗菌肽基因(xi)序列描述SEQ ID NO15CCAAAGGCCT CTGCGGATGA AGATATGGAT GAAAGAGAGG TCCGGGGAAT 50TGGTAAATTT TTGCATTCAG CGGGCAAATT TGGAAAAGCT TTTGTGGGAG 100AGATAATGAA GTCAAAACGA GATGCAGAAG CAGTAGGACC AGAGGCCTTT 150GCAGATGAAG ATTTAGATGA AAGAGAGGTC CGGGGAATTG GTAAATTTTT 200GCACTCAGCA AAAAAATTTG GAAAAGCTTT TGTGGGAGAG ATAATGAATT 250CAAAACGAGA TGCAGAAGCA GTAGGACCAG AGGCCTTTGC AGATGAAGAT 300TTAGATGAAA GAGAGGTCCG GGGAATTGGT AAATTTTTGC ACTCAGCAAA 350AAAATTTGGA AAAGCTTTTG TGGGAGAAAT AATGAATTCA AAACGAGATG 400CAGAAGCAGT AGGACCAGAG GCCTTTGCAG ATGAAGATTT AGATGAAAGA 450GAGGTCCGGG GAATTGGTAA ATTTTTGCAC TCAGCAAAAA AATTTGGAAA 500AGCTTTTGTG GGAGAAATAA TGAATTCAAA ACGAGATGCA GAAGCAGTAG 550GACCAGAGGC CTTTGCAGAT GAAGATTTAG ATGAAAGAGA GGTCCGGGGA 600ATTGGTAAAT TTTTGCACTC AGCAAAAAAA TTTGGAAAAG CTTTTGTGGG 650AGAGATAATG AATTCAAAAC GAGATGCAGA AGCAGTAGGA CCAGAGGCCT 700TTGCAGATGA AGATTTAGAT GAAAGAGAGG TCCGGGGAAT TGGTAAATTT 750TTGCACTCAG CAAAAAAATT TGGAAAAGCT TTTGTGGGAG AGATAATGAA 800TTCAAAACGA GATGCAGAAG CAGTA 825(2)SEQ ID NO16的資料(A)長度275個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲結構線性(ii)分子類型蛋白質(vii)直接來源(B)克隆前爪蟾抗菌肽原基因(xi)序列描述SEQ ID NO16Pro Lys Ala Ser Ala Asp Glu Asp Met Asp Glu Arg Glu Val15 10Arg Gly Ile Gly Lys Phe Leu His Ser Ala Gly Lys Phe Gly15 20 25Lys Ala Phe Val Gly Glu Ile Met Lys Ser Lys Arg Asp Ala30 35 40Glu Ala Val Gly Pro Glu Ala Phe Ala Asp Glu Asp Leu Asp45 50 55Glu Arg Glu Val Arg Gly Ile Gly Lys Phe Leu His Ser Ala60 65 70Lys Lys Phe Gly Lys Ala Phe Val Gly Glu Ile Met Asn Ser75 80Lys Arg Asp Ala Glu Ala Val Gly Pro Glu Ala Phe Ala Asp85 90 95Glu Asp Leu Asp Glu Arg Glu Val Arg Gly Ile Gly Lys Phe100 105 110Leu His Ser Ala Lys Lys Phe Gly Lys Ala Phe Val Gly Glu115 120 125Ile Met Asn Ser Lys Arg Asp Ala Glu Ala Val Gly Pro Glu130 135 140Ala Phe Ala Asp Glu Asp Leu Asp Glu Arg Glu Val Arg Gly145 150Ile Gly Lys Phe Leu His Ser Ala Lys Lys Phe Gly Lys Ala155 160 165Phe Val Gly Glu Ile Met Asn Ser Lys Arg Asp Ala Glu Ala170 175 180Val Gly Pro Glu Ala Phe Ala Asp Glu Asp Leu Asp Glu Arg185 190 195Glu Val Arg Gly Ile Gly Lys phe Leu His Ser Ala Lys Lys200 205 210Phe Gly Lys Ala Phe Val Gly Glu Ile Met Asn Ser Lys Arg215 220Asp Ala Glu Ala Val Gly Pro Glu Ala Phe Ala Asp Glu Asp225 230 235Leu Asp Glu Arg Glu Val Arg Gly Ile Gly Lys Phe Leu His240 245 250Ser Ala Lys Lys Phe Gly Lys Ala Phe Val Gly Glu Ile Met255 260 265Asn Ser Lys Arg Asp Ala Glu Ala Val270 275(2)SEQ ID NO17的資料(i)序列特徵(A)長度25個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型DNA(vii)直接來源(B)克隆引物(xi)序列描述SEQ ID NO17CGGGATCCAT ATGCCCCCGG TCGAC 25(2)SEQ ID NO18的資料(i)序列特徵(A)長度25個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型DNA(vii)直接來源(B)克隆引物(xi)序列描述SEQ ID NO18CGGGATCCTC ATGATACCCG CGCAG 25(2)SEQ ID NO19的資料(i)序列特徵(A)長度54個鹼基對；(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型DNA(iv)反義不是(xi)序列描述SEQ ID NO19GGTAACAACC GTCCGGTTTA CATCCCGCAG CCGCGTCCGC CGCACCCGCG 50TACT 54(2)SEQ ID NO20的資料(A)長度18個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲結構線性(ii)分子類型蛋白質(vii)直接來源(B)克隆Apidaecin I(xi)序列描述SEQ ID NO20Gly Asn Asn Arg Pro Val Tyr Ile Pro Gln Pro Arg Pro Pro15 10His Pro Arg Ile15(2)SEQ ID NO21的資料(i)序列特徵(A)長度72個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型DNA(iv)反義不是(xi)序列描述SEQ ID NO21GGTATCGGTG CGCTGTCTGC GAAAGGTGCG CTGAAAGGTC TGGCGAAAGG 50TCTGGCGGAA CACTTCGCGA AC 72(2)SEQ ID NO22的資料
(A)長度24個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲結構線性(ii)分子類型肽(vii)直接來源(B)克隆Bombinin(xi)序列描述SEQ ID NO22Gly Ile Gly Ala Leu Ser Ala Lys Gly Ala Leu Lys Gly Leu15 10Ala Lys Gly Leu Ala Glu His Phe Ala Asn15 20(2)SEQ ID NO23的資料(i)序列特徵(A)長度108個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型DNA(iv)反義不是(xi)序列描述SEQ ID NO23AAATGGAAAT TCAAAAAAAT CGAAAAAGTT GGTCAGAACA TCCGTGACGG50TATCATCAAA GCGGGTCCGG CGGTTGCGGT TGTTGGTCAG GCGACCCAGA 100TCGCGAAA 108(2)SEQ ID NO24的資料
(A)長度36個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲結構線性(ii)分子類型肽(vii)直接來源(B)克隆Cecropin A(xi)序列描述SEQ ID NO24Lys Trp Lys Phe Lys Lys Ile Glu Lys Val Gly Gln Asn Ile15 10Arg Asp Gly Ile Ile Lys Ala Gly Pro Ala Val Ala Val Val15 20 25Gly Gln Ala Thr Gln Ile Ala Lys30 35(2)SEQ ID NO25的資料(i)序列特徵(A)長度57個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型DNA(iv)反義不是(xi)序列描述SEQ ID NO25GGTAAACCGC GTCCGTACTC TCCGCGTCCG ACCTCTCACC CGCGTCCGAT50CGCGGTT 57(2)SEQ ID NO26的資料(A)長度19個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲結構線性(ii)分子類型肽(vii)直接來源(B)克隆Drosocin(xi)序列描述SEQ ID NO26Gly Lys Pro Arg Pro Tyr Ser Pro Arg Pro Thr Ser His pro15 10Arg Pro Ile Ala Val15(2)SEQ ID NO27的資料(i)序列特徵(A)長度90個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型DNA(iv)反義不是(xi)序列描述SEQ ID NO27GCGTGCTACT GCCGTATCCC GGCGTGCATC GCGGGTGAGC GTCGTTACGG 50TACCTGCATC TACCAGGGTC GTCTGTGGGC GTTCTGCTGC 90(2)SEQ ID NO28的資料(A)長度30個胺基酸
(B)類型胺基酸(D)拓撲結構線性(ii)分子類型肽(vii)直接來源(B)克隆HNP-1(xi)序列描述SEQ ID NO28Ala Cys Tyr Cys Arg Ile Pro Ala Cys Ile Ala Gly Glu Arg15 10Arg Tyr Gly Thr Cys Ile Tyr Gln Gly Arg Leu Trp Ala Phe15 20 25Cys Cys30(2)SEQ ID NO29的資料(i)序列特徵(A)長度39個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型DNA(iv)反義不是(xi)序列描述SEQ ID NO29ATCCTGCCGT GGAAATGGCC GTGGTGGCCG TGGCGTCGT 39(2)SEQ ID NO30的資料(A)長度13個胺基酸(B)類型胺基酸
(D)拓撲結構線性(ii)分子類型肽(vii)直接來源(B)克隆Indolicidin(xi)序列描述SEQ ID NO30Ile Leu Pro Trp Lys Trp Pro Trp Trp Pro Trp Arg Arg15 10(2)SEQ ID NO31的資料(i)序列特徵(A)長度66個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型DNA(iv)反義不是(xi)序列描述SEQ ID NO31GGTATCGGCA AATTCCTGAA AAAGGCTAAG AAATTTGGTA AGGCGTTCGT 50TAAAATCCTG AAAAAG66(2)SEQ ID NO32的資料(A)長度22個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲結構線性(ii)分子類型肽(vii)直接來源(B)克隆爪蟾抗菌肽(xi)序列描述SEQ ID NO32Gly Ile Gly Lys Phe Leu Lys Lys Ala Lys Lys Phe Gly Lys15 10Ala Phe Val Lys Ile Leu Lys Lys15 20(2)SEQ ID NO33的資料(i)序列特徵(A)長度78個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型DNA(iv)反義不是(xi)序列描述SEQ ID NO33GGTACTGGTG CGGTTCTGAA AGTTCTGACC ACCGGTCTGC CGGCGCTGAT 50CTCTTGGATC AAACGTAAAC GTCAGCAG 78(2)SEQ ID NO34的資料(A)長度26個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲結構線性(ii)分子類型肽(vii)直接來源
(B)克隆Melittin(xi)序列描述SEQ ID NO34Gly Ile Gly Ala Val Leu Lys Val Leu Thr Thr Gly Leu Pro15 10Ala Leu Ile Ser Trp Ile Lys Arg Lys Arg Gln Gln15 20 25(2)SEQ ID NO35的資料(i)序列特徵(A)長度51個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型DNA(iv)反義不是(xi)序列描述SEQ ID NO35AAATGGTGCT TCCGTGTTTG CTACCGTGGT ATCTGCTACC GTCGTTGCCG 50T 51(2)SEQ ID NO36的資料(A)長度17個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲結構線性(ii)分子類型肽(vii)直接來源(B)克隆Tachyplesin I(xi)序列描述SEQ ID NO36Lys Trp Cys Phe Phe Val Cys Tyr Arg Gly Ile Cys Tyr Arg1 5 10Arg Cys Arg1權利要求
1.大量生產抗微生物肽的方法，該方法包括下列步驟(i)構建含有編碼具有至少兩個半胱氨酸殘基的帶負電的酸性肽的第一個基因和編碼帶正電的鹼性抗微生物肽的第二個基因的融合基因；(ii)用包括該融合基因的表達載體轉化宿主微生物；(iii)培養轉化的微生物以表達含有酸性肽和抗微生物肽的融合肽；和(iV)回收所表達的抗微生物肽。
2.根據權利要求1所述的方法，其中融合基因在酸性肽和抗微生物肽之間含有蛋白酶或一種化學物質的至少一個裂解位點。
3.根據權利要求1所述的方法，其中酸性肽的負電荷基本上中和抗微生物肽的正電荷。
4.根據權利要求1所述的方法，其中表達載體包括融合基因的多體。
5.根據權利要求1所述的方法，其中表達載體包括可操作連接到編碼融合肽的基因的啟動子，該融合肽含有中和抗微生物肽的正電荷並且至少具有兩個半胱氨酸殘基的酸性肽和一種抗微生物肽。
6.根據權利要求5所述的方法，其中該基因是多體的形式，該多體包括編碼中和抗微生物肽的正電荷和具有至少兩個半胱氨酸殘基的酸性肽的第一個基因和編碼帶正電荷的抗微生物肽的第二個基因，所述第二個基因融合到第一個基因。
全文摘要
本發明提供了大量生產抗微生物肽的方法，該方法包括下列步驟構建含有編碼具有至少兩個半胱氨酸殘基的帶負電的酸性肽的第一個基因和編碼帶正電的鹼性抗微生物肽的第二個基因的融合基因；用包括該融合基因的表達載體轉化宿主微生物；培養轉化的微生物以表達含有酸性肽和抗微生物肽的融合肽；和回收表達的抗微生物肽。根據本發明，通過與酸性肽融合可以急劇減少表達的抗微生物肽對宿主微生物的生長的抑制作用。因此，從重組微生物可以大規模製備抗微生物的肽，不管抗微生物肽的種類如何。
文檔編號C07K14/815GK1228121SQ98800710
公開日1999年9月8日 申請日期1998年5月28日 優先權日1997年5月28日
發明者金善昌, 李在鉉, 姜旻亨, 金政賢, 洪承緒, 李賢秀 申請人:株式會社三養吉尼克斯, 韓國科學技術院