抗生素a80577及其生產方法

2023-10-09 22:45:24 2

專利名稱：抗生素a80577及其生產方法
技術領域：
本發明涉及新的多醚類抗生素A80577及其產生這一抗生素的新菌株Actinomadura屬Verrucosospora種。A80577的結構如式Ⅰ所示
本發明還涉及A80577的醯酯和烷醚衍生物，以及A80577和這些衍生物的鹽。
本發明的另一方面是抗生素A80577的生產方法。該方法是在浸水需氧發酵條件下，在含有同源碳，氮，和無機鹽的培養基中，培養Actinomadura屬Verrucosospora種，或產生A80577的變種，突變體或重組體，直到產生抗生素A80577為止。從發酵肉湯和帶有機溶劑的菌絲體中提取A85077。通過諸如柱層析的技術分離A80577，並進一步純化之。
由於Actinomadura屬Verrucosospora種是新發現的菌株，所以本發明還提供了產生抗生素A80577的微生物或其變種，突變體或重組體的純生物學培養方法。
A80577是有用的抗菌劑。它改善反芻動物的進食利用率，並可用作反芻動物和單胃動物助長劑。另外，A80577具有殺寄生蟲作用，並可用作離子載體抗生素。因此，本發明還涉及用於增加反芻動物進食利用率的一種食用組合物，該組合物包括;動物飼料和有效量的抗生素A80577及其醯酯或烷醚衍生物，或A80577的鹽，或這些衍生物的鹽;本發明還涉及增加進食利用率的方法，該方法包括給動物口服有效量的前述化合物。
下圖是在氯仿中的紅外吸收圖譜

圖1A80577(鈉鹽)圖2A80577(鉀鹽)就獸醫領域而言，一直需要先進的抗生素。提高動物的助長作用是這類抗生素的理想特點之一。通過減少疾病以及增加進食利用率，可以收到助長效果。反芻動物(如牛)的助長具有特殊的意義。
反芻動物飼料中主要營養物(碳水化合物)的利用機理是眾所周知的。在動物瘤胃中的微生物降解碳水化合物，產生單糖，然後再把這些單糖轉化成丙酸酯化合物。丙酸酯化合物經微生物學途徑代謝，形成乙酸酯，丁酸酯或丙酸酯類，統稱為揮發性脂肪酸(VFA)。
VFA的相對利用效率與總體效率有關。因此，儘管採用乙酸酯和丁酸酯，但丙酸酯的利用率更高。產生丙酸酯的發酵率也大於丁酸酯或乙酸酯的發醇率。這就是額外利用率。因此，有益的化合物是通過刺激動物從代謝碳水化合物中產生更高比例的丙酸酯類，由此增加碳水化合物的利用率。
A80577是多醚抗生素族中的一個新成員。Westley已經把現有的多醚分門別類(JohnW.Westley「多醚抗生素天然存在的酸離子載體，Vol.2.Chemistry，」MarcelDekker，NewYork，1983;JournalofNaturalProducts，49(1)，35〔1986〕)。採用Westley系統，A80577是多醚族第四類新成員。該族包括在「J.Antibiotics，142(1982)」中介紹的tetronomycin，「J.Chem.Soc.，Chem.Comm.，1073(1981)」和美國專利4，279，849中介紹的M139603。
A80577(鈉鹽)具有有下列特徵收態白色結晶體(由丙酮-水結晶)mp(鈉鹽)276-278℃(鉀鹽)270-272℃分子量782〔質譜場解吸(FDMS)〕;760(酸式)。
〔α〕25D-89.03(C5，MeOH)非滴定基團(66%DMF)實驗分子式C42H63O12NaUVmax中性乙醇253nm(ε＝17，735)，289nm(ε＝10，003)酸式250nm(ε＝14，715)，298nm(ε＝7，971)鹼式208nm(ε＝192，222)，248nm(ε＝15，968)，286nm(ε＝9，665)IR(鈉鹽，CHCl3)3018，2966，2931，1750，1611，1453，1439，1219，1022，1012cm-1(見圖1)IR(鉀鹽，CHCl3)3023，3019，2967，2964，2930，2974，1750，1650，1451，1437，1224，1214，1210，1079，1059，1022，1012cm-1(1見圖2)。
溶解度略溶於水;溶於下列溶劑二甲亞碸，二甲基甲醯胺，低級醇類(如甲醇)酮類(如丙酮)，酯類(如乙酸乙酯)，囟代烷烴類(如氯仿)，烷烴類(如乙醚，苯，甲苯和溫熱的己烷)。
根據其物理特徵，可以確認A80577具有式Ⅰ所示的結構。正如其結構所示，A80577是帶電荷的分子，並可以形成鹽。A80577還有可至四個可酯化或可形成醚衍生物的羥基。A80577的醯酯和烷醚衍生物，以及A80577和上述衍生物的藥物上可以接受的鹽也可用作抗生素以及用作增加進食利用率的藥物。
本文所採用的「A80577化合物」一詞意指抗生素A80577(式Ⅰ)，抗菌素A80577的醯酯或烷醚衍生物，或者是抗生素A80577的藥物上可以接受的鹽或其醯酯或烷醚衍生物。
按本文所述，通過培養Actinomadura屬Verrucosospora種的產A80577菌株，製得抗生素A80577。在適宜的培養基中，於浸水需氧條件下產生該抗生素;可通過採用本領域公知的各種分離和純化方法，從所述培養基中回收該抗生素。
產A80577生物的培養基已有保藏，並已成為下述機構保藏培養基中的一部分MidwestAreaNorthernRegionalResearchCenter，AgriculturalResearchService，U.S.DepartmentofAgriculture，1815NorthUnuversityStreet，Peoria，Illinois61604，按照登記號NRRL18236，公眾可以容易地從該機構中得到它。
Lilly研究實驗室的FrederickP.Mertz對這一生物體進行了分類學研究。根據這些研究，該生物體屬於Actinomadura屬〔Lechevalier和Lechevalier，1970，InProuser，H.(ed)「放射線菌素」VEBGustavFischerVerlag，Jena，PP.393-405〕。
本文所遵循的是用於鑑定鏈黴菌屬的國際鏈黴菌屬工程(ISP)所推薦的方法〔E.B.Shirling和D.Gottlieb，「鏈黴菌屬鑑定方法」，Int.J.Syst.Bacteriol.16(3)，313-340(1966)〕。
用ISPNo.1(酵母胰腖肉湯)，ISPNo.6(酵母腖鐵瓊脂)，ISPNo.7(酪氨酸瓊脂)測定了黑色素產物。
在ISPNo.4(無機鹽-澱粉瓊脂)平皿上用碘試驗所存在的澱粉，由此測定澱粉水解。
用光學顯微來研究形態。採用電子掃描顯微鏡(SEM)研究芽飽表面修飾。
ICSS-NBS短心顏色曲線圖，標準樣品No.2106(NationalBureauofStandards，1958，U.S.DepartmentofCommerce.Washington.D.C.)和色澤協調手冊(4thed.，ColorStandardsDepartment，ContainerCorporationofAmerica，Chicago，Illinios，1958)用來分別確定反面和氣孢團顏色的名稱。
採用Becker等人的層析法確定整體細胞水解產物中的二氨基庚二酸(DAP)異構體和碳水化合物。該方法見〔B.Becker，M.P.Lechevalier，R.E.Gordon，和H.A.Lechevalier，「用整體細胞水解產物紙色譜法快速鑑定放射線菌屬和鏈黴菌屬」，Appl.Microniol，12，421-423(1964)〕和Lechevalier的〔M.P.Lechevalier，和H.Lechevalier「厭氧鏈黴菌屬分類中的標準化學組份」，Int.J.Sust.Bacteriol.20，435-443(1970)〕。
將抗生素敏感圓面襯墊在接過種的ISPNo.2瓊脂平板上，由此來測定對抗生素的耐藥性。
培養特徵A80577培養在複合的和限定的培養基上均生長良好。氣孢塊緩慢形成，其為白色。反面由黃白色變為淡黃色。未觀察到明顯的色素，除了在幾個介質上有淺的黃褐色色素外，未觀察到可溶色素。表Ⅰ給出了上述培養特徵。
表ⅠA80577的培養特徵，30℃，保溫18天。
G(生長)豐富G中等ISPR(反面)88.d.y.Czapek瓊脂R92.y白色No.2C(空白)痕跡a白色Am(氣菌絲體)中等a白色Sp(可溶色素)無至1.yBrSp無G中等G差ISPR92.y白色番茄醬燕麥R88.d.y.
No.3Am中等a白色片瓊脂Am差a白色Sp無Sp無G良好G良好ISPR92.y白色土豆蘿蔔R89.p.Y.
No.4Am良好a白色瓊脂Am良好a白色Sp無Sp無G豐富G差ISPR89.p.YJensenR92.y白色No.5Am良好a白色瓊脂Am差a白色Sp無Sp無G良好G良好ISPR90.gp.Y葡萄糖R89.p.Y.
No.7Am無天門冬醯氨Am良好a白色Sp無Sp無
G良好G只有痕跡R89.p.Y甘油甘氨酸R-No.172Am良好a白色Am-Sp無Sp無G無生長G豐富自來水R-酵母葡萄糖R87.m.Y.
瓊脂Am-瓊脂Am中等a白色Sp-Sp無至1.yBrG豐富EmersonR87.m.Y2脂Am痕跡a白色Sp無至1.yBr形態學特徵培養A80577產生大量的基質菌絲體。緩慢形成的需氧菌絲產生許多由緊密包裹的短鏈組成的群集體，並按照Rectus-flexibilis(RF)形態學排例。這種形態是典型的Actinomadura屬。芽孢的形狀呈球形，平均大小為0.8μm，並且芽孢表面具有獨特的顆粒外觀。每個孢子鏈所含孢子數少於10。
生理學特徵水解後的整體細胞經分析表明有新-二氨基庚二酸存在。在該整體細胞提取物中檢測出了Madurose。還檢測出了半乳糖，葡萄糖，甘露糖和核糖。細胞壁為Ⅲ型，糖式為B型。半乳糖是不典型的B糖式。
培養物A80577利用了下列碳水化合物核糖醇，D-和L-阿拉伯糖，纖維素二糖，半乳糖醇，乙醇，i-赤蘚醇，D-果糖，D-半乳糖，葡萄糖，甘油，糖原，i-肌醇，D-甘露糖醇，D-甘露糖，D-松三糖，D-密二糖，L-鼠李糖，D-核糖，蔗糖，D-海藻糖，D-木糖和丁酸鈉。而不能利用的有纖維素，糊精，菊粉，D-乳糖，D-麥芽糖，α-甲基-D-糖苷，D-棉子糖，水楊苷，山梨醇，L-山梨糖，木糖醇。不加碳水化合物的對照平皿維持最低生長。
A80577培養物在15-45℃的溫度範圍內生長，顯然，最佳生長溫度在30和37℃之間。A80577耐受NaCl的濃度高達4%，產生過氧化氫酶並還原硝酸鹽。它不能水解澱粉。
A80577對下述抗生素有抗性桿菌肽10單位，頭孢菌素I30μg，林可黴素2μg，竹桃黴素15μg，青黴素G10單位，利福平5μg，四環素30μg。它對下列抗生素敏感慶大黴素10μg，新黴素30μg，鏈黴素10μg，託普黴素10μg，萬古黴素30μg。
A80577的化學分類學性質和綜合培養及形態特徵均支持該菌株屬於Actinomadura屬Verrucosospora種。因此，把這一菌株分類為Actinomadura屬Verrucosospora種A80577。
與其他生物體一樣，產生A80577的培養物Actinomadura屬Verrucosospora種的特徵也要發生改變。採用本領域公知的技術可以獲得該菌株的重組體，突變體和變種。例如，通過用各種已知的物理和化學致變物(如紫外光，X射線，γ射線，化學物質，如N-甲基-N′-硝基-N-亞硝基胍)處理，可以得到突變體。持有產A80577特徵的該Actinomadura屬Verrucosospora種菌株的所有天然和誘發變體，突變體和重組體均屬於本發明的內容。
用於培植Actinomadura屬Verrucosospora種的培養基可以是為數眾多的培養基中的任何一個。但是為使生產經濟，收率高，易於分離產品，最好選擇某些培養基。例如，雖然也可使用赤糖糊糖漿(blackstrapmolasses)，澱粉等類似的糖，但大規模發酵中的優選碳水化合物源是葡萄糖。
儘管也可以使用其他氮源，但最好的氮源是酶水解的酪蛋白。
摻入培養基中的營養性無機鹽最好是慣用的、可得到下列離子的可溶性鹽Zn++，Na+，Mg++，Ca++，NH+，Cl-，CO＝2，SO＝4，NO-3和其他類似的離子。
培養基中還應該包括對生物體生長發育所必須的主要微量元素。這些微量元素通常以夾雜物的形式出現在培養基的其他取代成份當中，其含量足以滿足該生物體的生長需要。如果出現泡沫問題，可按照需要，在大規模發酵基中加入少量的(即0.2ml/L)抗發泡劑(如聚乙二醇)。
為了大量生產抗生素A80577，選用罐內浸氧發酵法。搖瓶培養可得到少量的A80577。
由於用生物孢子進行大罐接種，在抗生素生產中經常出現時間遲滯，因此，最好採用營養接種物。通過在少量的培養基上接種生物芽孢或菌絲體片斷，得到新鮮的生長活躍的生物培養體，由此製得營養接種物。然後將該營養接種物移至大罐中。該營養接種物基質可以採用與大規模發酵相同的基質，但也可以採用其他適宜的介質。
當生長溫度約為25℃至37℃時，Actinomadura屬產生A80577。生產A80577的最好溫度似乎是約30℃。
按照常規的浸水需氧培養方法，將無菌空氣從反應器底部通入反應器，同時用慣用的渦輪式攪拌葉輪攪拌該基質。一般吹氣速率和攪拌速率應維持溶解氧在30%的飽和水平或更高。
在發酵期間檢測肉湯樣品對某些已知敏感於該抗生素的生物之抗菌作用，可跟蹤抗生素A80577的生產情況。一種用於檢測A80577的試驗生物體是枯草桿菌ATCC6633。用瓊脂平板測試法可以方便地進行該生物測試。
按照該浸水需氧發酵條件下的生產方法，採用發酵領域中所使用的方法，可以從發酵基質中回收A80577。產A80577生物體在發酵期間所產生的抗菌活性存在於菌絲體和肉湯中。因此，通過最初將基質過濾，把肉湯與菌絲體塊分開，可達到A80577的最大回收。分別將經過濾的肉湯和菌絲體塊進一步純化，得到各自的A80577部份。可採用各種技術進行這一純化。
用於純化過濾肉湯的優選技術是將其調至約pH9，然後用適宜的溶劑，如，乙酸乙酯提取之。然後減壓下蒸掉提取溶劑，得到肉湯部分的A80577。
純化菌絲體塊的優選方法是用適宜的溶劑(例如丙酮)，抽提分離後的菌絲體濾塊。減壓蒸掉提取溶劑，得到濃縮水溶液。將該水溶液調至約pH9，用適宜的溶劑，如，乙酸乙酯，提取之。然後將提取溶劑減壓濃縮，得到菌絲體部分的A80577。
用類似的方法進一步純化肉湯部分和菌絲體部分A80577的混合物。優選的方法包括矽膠色譜法。
採用薄層色譜(TLC)或高效液相色譜(HPLC)法，可以完成抗生素A80577的分離。適宜的矽膠TLC溶劑體系是乙酸乙酯，乙酯乙酯∶乙腈∶氫氧化銨和甲苯∶乙腈∶乙酸。優選的矽膠溶劑體系是乙酸乙酯∶乙腈∶氨(90∶9∶1)，和甲苯∶乙腈∶乙酸(40∶59∶1)。使用聚醯胺板也很方便，其溶劑系統是丙酮∶水∶氨，優選比例為30∶69∶1。用枯草桿菌的生物自顯影法或其他方法(如香草醛-硫酸噴灑劑)可以檢測該抗生素。
另外，培養固體，包括基質組份和菌絲體都可不經提取或分離而作為A80577的來源使用，但最好先除去水。例如，A80577產生後，可以通過凍幹，滾筒乾燥，或共沸蒸餾及乾燥法將整個發酵肉湯乾燥。然後將經乾燥的肉湯直接混入進食預混物。
A80577的鹽以及其衍生物的鹽可用來分離和純化該抗生素。藥物上可以接受的鹽尤其有用。這些鹽的例子是A80577及其衍生物的鹼金屬和鹼土金屬鹽。
具有代表性的、適宜的A80577的鹼金屬和鹼土金屬鹽包括鈉鹽，鉀鹽，鋰鹽，銫鹽，銣鹽，鋇鹽，鈣鹽，鎂鹽。
就獸藥領域而言，眾所周知的是在用該抗生素治療動物時，抗菌素的劑型一般並不十分重要。在多數情況下動物的體內因素使原服用藥物的形式發生改變。因此，以鹽的形式服用並不種匾５淺鯰誥茫獎悖拘緣腦潁梢匝≡裱蔚男問健 按照製備陽離子鹽所採用的一般方法，可製得A80577的鹼金屬和鹼土金屬陽離子鹽。例如，將A80577的游離溶解在適宜的溶劑(如丙酮)中，加入藥1/2體積的水，用所期望的陽離子鹽的鹼(如NaOH，KOH)將該溶液調至約pH9至10。採用慣用方法(如過濾或蒸發溶劑)，可分離由此形成的鹽。
形成鹽的優選方法是將A80577(酸式)溶解在溶劑(如四氫呋喃)中;加入等量的水;用相應的陽離子鹼(如NaOH，KOH等)將該混合物調至pH10;然後用與水不混溶的溶劑(如乙醚或乙酸乙酯)提取即得。用水洗滌分離後的有機相，並濃縮至幹。殘留物用二噁烷凍幹。該鹽用適宜的溶劑(如丙酮)結晶。
A80577的烷基醚衍生物是式中由YR基團取代了一個或多個羥基的那些化合物，其中Y代表O或S;
R代表C1-6烷基，C1-4烷氧基-C2-5烷基，C1-4-烷氧羰基-C2-5烷基，氨基-C2-5烷基，巰基-C2-5烷基，羥基烷基，滷代烷基，或(R′)-苯基(CH2)n，其中R1代表C1-4烷基，C1-4烷氧基，或羥基，m代表0-2;n代表0-3。
術語「烷基」意指C1至C7直鏈或支鏈烷烴，最好是C1至C4烷烴，如甲基，乙基，丙基，異丙基，正丁基等。
術語「烷氧基」意指其中具有氧官能團取代的C1至C7低級烷基，如甲氧基，乙氧基，丙氧基，和類似基團。
術語「羥基烷基」或意指單羥基-C1-5烷基殘基，或者當Y是0時，意指2，3-二羥基丙-1-基殘基。
術語「滷代烷基」意指含1至3個滷原子取代的C2-5烷基殘基，所說滷原子選自溴，氯，氟。當所說烷基是二滷或三滷取代烷基時，滷素取代基必須是同一滷素。
優選的A80577醚衍生物是式中Y代表O，R代表C1-6烷基的那些化合物。A80577或其鹽與相應的伯醇或硫醇反應，即可製得上述醚衍生物。
以某些醇或硫醇作原料時，有必要在該反應中加入酸催化劑。適宜的催化劑包括鹽酸，硫酸，高氯酸，甲磺酸，苯磺酸，甲苯磺酸，二氧化硒，三氟化硼。
為加快反應可加入下列某一溶劑水，丙酮，苯，醚，四氫呋喃，二噁烷。儘管也可採用較高的溫度，但一般在室溫下進行反應。
A80577的醯酯衍生物是式中一個或多個羥基由式
取代的那些化合物，其中R1是C1-6烷基或氫。A80577與相應的酸酐或醯氯反應可製得A80577醯酯衍生物。只將A80577中多個羥基中的一個羥基酯化。在室溫下，A80577與相應的酸酐反應很容易製得這些酯。
儘管有時採用一般反應操作法即可，但要得到本發明化合物，還可能需要進一步純化。採用眾所周知的方法，例如柱色譜，薄層色譜，分級結晶等，即可完成這一純化。
A80577化合物能抑制使動物致病的菌的生長。表Ⅲ給出了最低抑制濃度(MIC)，在該濃度下A80577抑制某些生物。表Ⅲ中的MIC是通過慣用的瓊脂稀釋試驗確定的。
表ⅢA80577的抗菌作用(鈉鹽)受試生物MIC(mcg/mL)金黃色葡萄球菌X1.10.5金黃色葡萄球菌V410.5金黃色葡萄球菌X4000.5金黃色葡萄球菌S13E0.5表皮葡萄球菌EPI10.5表皮葡萄球菌2220.5生膿鏈球菌C2030.125肺炎鏈球菌Park10.125肺炎鏈球菌X660.5肺炎鏈球菌20410.5發否氏桿菌32-128其他草蘭氏陰性菌試驗＞128獸醫生物葡萄球菌屬＜0.05鏈球菌屬＜0.05出血敗血性巴斯德氏菌1.56溶血性巴斯德氏菌＞50支氣管敗血性博代氏桿菌＞50支原菌屬galliseticum0.78支原菌屬hyopneumoniae1.56大腸桿菌＞50鼠傷寒沙門氏菌＞50A80577化合物還具有抗厭氧菌的作用。表Ⅳ給出了由標準瓊脂稀釋實驗測定的、A80577抑制各種厭氧菌的MIC。保溫24小時後記錄最後讀數。
表Ⅳ厭氧菌分離體對A80577(鈉鹽)的敏感性厭氧菌MIC(mcg/mL)梭狀芽胞桿菌屬difficile2994＜0.5產氣莢膜梭狀芽胞桿菌81＜0.5敗血梭狀芽胞桿菌1128＜0.5Eubacteriumaerofaciens1235＜0.5發酵球菌asaccharolyticus1302＜0.5發酵球菌prevoti1281＜0.5厭氧發酵鏈球菌1428＜0.5中間發酵鏈球菌1624＜0.5丙酸菌屬痤皰菌79＜0.5胞弱擬桿菌111＞128胞弱擬桿菌1877＞128胞弱擬桿菌1936B＞128擬桿菌屬thetajotaomicron14384黑色素擬桿菌1856/281.0黑色素擬桿菌273616飧司魐ulgatis12114擬桿菌屬corrodens1874＞128共生梭〔形杆〕菌1470＜0.5梭桿菌屬necrophorum6054A＜0.5通過腹膜內注射給藥測定了A80577對大鼠的急性毒性，以LD50表示，為53.3gm/kg。
A80577化合物的另一重要性質是改善動物進食利用率的能力。例如，A80577化合物可以改善具有發達的瘤胃器官的反動物的進食利用率。
採用ArthurP.Raun在美國專利3，794，732(尤其參見實施例5)中所述方法，通過觀察瘤胃中丙酸酯化合物的產生及濃度水平可以測得進食利用率。表Ⅴ列出了A80577化合物對反芻動物進食利用率的影響。表ⅤA列出了A80577的劑量和產生丙酸酯類化合物之間的關係。表ⅤB列出了經A80577處理過的瓶中易揮發脂肪酸(VFA)與該試驗對照瓶中濃度的比例。
表ⅤA80577(鈉鹽)對反芻動物進食利用率的影響。
A丙酸酯產物，mM/d劑量，ppm觀察值中項標準差0269.61.40.041414.31.70.21414.81.41.01422.33.45.01421.82.7B處理組與對照組的比值劑量摩爾%摩爾%摩爾%VFA總量mcg/mL丙酸酯乙酸酯丁酸酯mM/L1.01.5320.8450.7540.8582.51.4590.8510.8270.8235.01.5620.7990.8390.77310.01.7090.7720.7280.876LSD雙盲t試驗;顯著性P＜0.01;C＞99%高於可信限度。
就增加丙酸酯而言，A80577化合物特別有效。因此，以約0.01mg/kg/天至約1.0mg/kg/天的比例給反芻動物口服該化合物時，可以改善進食利用率。優選的服用劑量是約0.06mg/kg/天至約0.35mg/kg/天。優選的服用方法是將該化合物與動物飼料混合。適用於增加反芻動物進食利用率的進食組合物一般包括飼料比例和0.5至50gA80577化合物/噸飼料，最好是2至15g/噸。
按照supra的描述，A80577化合物具有抗厭氧菌的作用，包括抗產氣夾膜桿菌。因此，可將A80577化合物用於治療(包括預防)雞，豬，牛，羊的腸炎。還能將A80577化合物用於治療反芻動物的腸原性毒血症。
可以通過口服或經胃腸道外給動物服用A80577化合物。服用A85077化合物最實用的途徑是將其配入飼料中。可以使用各種飼料，包括普通幹飼料，液體飼料，顆粒飼料。儘管優選服用方法是將它與動物飼料混合，但也可以以其他方法服用，例如，以片劑，獸用飲劑，大丸劑或膠囊劑服用。每個劑量單體中A80577化合物的含量應該與受治動物的適宜日劑量直接聯繫。
將藥物配進動物飼料的方法是眾所周知的。優選方法是先製備高濃度含藥預混合物，然後再將其用於製備藥用飼料。典型的預混合物中，每磅預混合物可以含有約1至約200g藥物。該預混合物既可以是液體，也可以是固體製劑。
用於動物的藥物最後配方應取決於欲服用藥物量。可採用配製，混合，制丸飼料的一般方法，製備含A80577化合物的飼料。
可以採用獸藥領域公知的方法將A80577化合物配製成適於胃腸道外給藥的製劑。含A80577化合物的有效的注射用組合物既可以是懸浮劑，也可以是溶液。就溶液劑而言，是將A80577化合物溶解在生理上可以接受的載體中。這類載體包括適宜的溶劑，必要的話，包括防腐劑(如苄醇)，和緩衝液。有用的溶劑包括例如，酒精，丙二醇，或者是惰性油，如，植物油或高精製礦物油。
採用非溶劑將該化合物與作為載體的添加劑混合製得注射用懸浮劑組合物。該非溶劑可以是水或乙二醇(如聚乙二醇)。
為了使該化合物在懸浮組合物中保持懸浮態，有必要加入適宜的生理上可以接受的添加劑。所述添加劑可以選自增稠劑，如羧甲基纖維素，聚乙烯吡咯烷酮，凝膠，藻酸鹽。許多表面活性劑也可以用來懸浮該類化合物。在液體非溶劑中可用作懸浮劑的有卵磷脂，烷基苯酚聚乙烯氧加成物，萘磺酸鹽，烷基苯磺酸鹽，聚氧乙烯脫水山梨醇酯。
能夠影響液體非溶劑的親水性，比重，表面張力的許多物質均有助於製備注射用懸浮劑。例如，矽氧烷抗泡沫劑，乙二醇，山梨醇和糖均可用作懸浮劑。
為對本發明的實施作更充分的說明，提供下列實施例實施例1A.Actinomadura屬Verrucosospora種的搖瓶發酵將保存於液氮中的凍幹丸狀或懸浮狀Actinomadura屬Verrucosospora種培養物用於接種含有下列組份的營養基質營養或種基質成份量(g/L)葡萄糖10.0可溶澱粉20.0酶水解酪蛋白＊5.0酵母提取物5.0CaCO31.0去離子水適量至1升＊N-ZAmineA，Humko-SheffieldChemical，Norwich，NJ.
將2.5%瓊脂加到該種基質中，製得斜面或平板。將接種過的斜面在30℃保溫約10至14天。用無菌工具在成熟的斜面培養物上劃線，使孢子鬆散，除去並浸解菌絲體襯墊。將由此得到的約1/4鬆散孢子和培養生長物用於接種50ml第一階段種基質。
在振蕩器上，將接種後的第一階段基質在250ml的Erlenmeyer燒瓶中，於30℃，保溫約72小時，同時使該振蕩器以250rpm，以兩英寸(5.08cm)的周長做圓周運動。
用該保溫過的第一階段基質91.00mL)接種具有下列組份的生產基質成份量(g/L)葡萄糖25.0赤糖糊糖漿15.0酶水解酪蛋白＊5.0MgSO4(無水) 3.0CaCO31.0自來水適量至1升＊N-ZAmineA在振蕩器上，將接種後的生產基質在250ml的廣口Erlenmeyer燒瓶中，於30℃保溫8至10天，同時，該振蕩器以250rpm，以兩英寸周長做圓周運動。
B.Actinomadura屬Verrucosospora種的罐發酵為了提供大量的接種，將如A節所述方法製備的10ml第一階段培養基質接種於400ml第二階段生長基質，該基質的成份與第一階段基質相同，將該第二階段營養基質在2升Erlenmeyer廣口瓶中，於30℃保溫48小時，以25rpm轉速在2英寸圓周內搖動。
將由此製得的保溫過的第二階段營養基質(400ml)用於接種過的100升無菌生產基質，後者除加入抗泡沫劑P-2000(0.1mL/L)和Sag471(0.2g/L)外，製備方法與A節所述相同。於30℃，在165升攪拌發酵罐內使該接種過的基質發酵4至5天。在該攪拌反應器中(200-250rpm)調節空氣流量(0.5-0.6v/v/m)，使溶水氧水平保持在室氣飽和度30%以上。
實施例2A80577鈉鹽的分離合併來自2份100L發酵液的發酵肉湯(187L)，並用3%HufloSupercel過濾。將菌絲體濾塊用40L丙酮提取兩次。合併丙酮提取液，減壓濃縮除去丙酮。將濃縮液(20升)與肉湯濾液(162升)合併，用50%NaOH將該溶液調至pH9.0，然後用125升乙酸乙酯提取之。將乙酸乙酯提取液減壓濃縮，殘留物於5℃放置結晶。依次用戊烷，乙腈，乙醚洗滌該結晶，真空乾燥，得到36.4g白色晶體狀A80577鈉鹽(m.p.275-278℃)。
將1.0g該結晶溶解在100ml丙酮中，加入100ml水，於5℃放置72小時讓其結晶。另加入100ml水∶丙酮(3∶1)使結晶完全。濾出結晶，乾燥，得到788mg純品(m.p.276-278℃)。
從上述合併洗液及母液中還可進一步回收A80577的鈉鹽，具體方法是將溶液濃縮至幹，溶解在250ml甲苯中，然後注入含有2升矽膠(GraceGrade62)甲苯浸溼的層析柱，該柱先用10升甲苯洗滌，然後依次用10升甲苯/乙醇(98∶2)和10升甲苯/乙醇(96∶4)洗脫，收集1升餾份。用TLC跟蹤該洗脫過程，並用枯草桿菌進行生物測定。合併含A80577的餾份13-18，減壓濃縮，用乙醚洗滌該殘留物，乾燥，得到2.3g非晶形A80577鈉鹽。
實施例3A80577游離酸的製備將A80577鈉鹽(1g)溶解在100ml丙酮中，加入0.1N的鹽酸(100ml)，將該溶液攪拌15分鐘，該溶液用乙酸乙酯(每次100ml)提取兩次，合併乙酸乙酯提取液，減壓濃縮至油狀殘留物，將該殘留物溶於二噁烷(50ml)中，冷凍乾燥，得到0.9gA80577酸。
實施例4A80577鉀鹽的製備將A80577(酸式，100mg)溶解在四氫呋喃(20ml)中，加入水(3ml)和2N的KOH(6ml)，將該混合物攪拌15分鐘，加入水(30ml)，該溶液用二乙醚(每次60ml)提取兩次，合併提取液，減壓下蒸發至幹。將殘留物溶解在二噁烷中，冷凍乾燥，得到100mgA80577鉀鹽(m.p.270-272℃)。
權利要求
1.生產式Ⅰ所示抗生素A80577的方法，式Ⅰ為
該方法包括在含同源碳、氮和無機鹽的培養基中，在浸水需氧發酵條件下，培養Actinomadura屬Verrucosospora種或其產A80577的變種、突變體或重組體，直到產生抗生素A80577為止。
2.按權利要求1所述方法，該方法包括從培養基中分離A80577的步驟。
3.按權利要求1或2所述方法，其中使用Actinomadura屬Verrucosospora種。
4.按權利要求1至3所述任一方法，該方法包括A80577與陽離子型鹼反應、形成相應鹽的步驟。
5.按權利要求4所述方法，其中陽離子型鹼是氫氧化鈉。
6.按權利要求4所述方法，其中陽離子型鹼是氫氧化鉀。
7.按權利要求1至4所述任一方法，該方法包括A80577或其鹽與伯醇或硫醇反應、形成相應的烷醚衍生物的步驟。
8.按權利要求1至3所述任一方法，該方法包括A80577與酸酐或醯氯反應、形成相應的醯酯衍生物的步驟。
9.按權利要求7或8所述方法，該方法包括所說衍生物與陽離子型鹼反應、形成相應鹽的步驟。
全文摘要
新的多醚類抗菌素A80577及其醯酯、烷醚衍生物和它們的鹽可用作抗菌劑，並能增加動物的進食利用率。本發明還提供了通過培養Actinomadura屬Verrucosospora種製備A80577的方法以及含有A80577化合物的組合物。
文檔編號C12P17/16GK1031253SQ8810604
公開日1989年2月22日 申請日期1988年8月12日 優先權日1987年8月13日
發明者羅伯特·L·哈米爾, 姚慈晃 申請人:伊萊利利公司