血漿中5種黃酮和4種生物鹼的檢測方法
2023-10-09 13:01:39 1
血漿中5種黃酮和4種生物鹼的檢測方法
【專利摘要】本發明公開了同時測定血漿中漢黃芩素、白楊素、千層紙素A、柚皮素、橙皮素、小檗鹼、黃連鹼、藥跟鹼和巴馬亭的分析方法，以及在藥代動力學中的應用。該分析方法具有良好的專屬性、精密度和準確度較高，線性範圍較寬，可用於中藥組合物的體內藥代動力學測定。
【專利說明】血漿中5種黃酮和4種生物鹼的檢測方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及醫藥、化學領域，具體涉及液相色譜串聯質譜法定量檢測血漿樣本中漢黃芩素、白楊素、千層紙素A、柚皮素、橙皮素、小檗鹼、黃連鹼、藥跟鹼和巴馬亭的方法。
【背景技術】
[0002]質譜是以分子量測定為基礎的分析方法，近年來，其與高效液相色譜法(HPLC)或毛細管電泳法(CE)等分離機制的聯用不僅提高了其抗雜質幹擾的能力和節省了分析時間，而且大大提高了測定的靈敏度。軟電離技術，如電噴霧離子化技術(ESI)的發展，則擴大了分子量檢測的範圍。此外，電噴霧離子化技術可在大氣壓下進行，方便與液相色譜儀連結，使液相色譜質譜聯用技術(LC/MS)成為了一種高靈敏度、高選擇性且快速分析的技術，其能在短時間之內，同時實現分析物的分離與結構鑑定。通過液相色譜質譜聯用技術(LC/MS/MS)能更清楚地了解藥物在動物活體內的藥物動力學規律，從而讓研究人員能夠更好地掌握藥物的藥理作用。另外還可以省去複雜、繁瑣且耗時的樣本前處理工作。
[0003]糖敏靈丸是在臨床驗證的有效方開鬱清胃顆粒基礎上加減變化與劑型改革而成。糖敏靈丸由黃連、大黃、黃芩、白芍、柴胡、枳實、山楂、烏梅、半夏、天花粉共十味常用中藥組成，具有開鬱清胃、滋陰降火、通腑瀉濁之功效。臨床觀察證實其對II型糖尿病的血糖有明顯的改善作用，尤其是對體型偏胖的早中期II型糖尿病患者效果更加顯著。同時，藥理實驗揭示糖敏靈能顯著增強高熱量飼料誘導的胰島素抵抗模型糖尿病大鼠和自發性II型糖尿病大鼠的胰島素敏感性。
[0004]漢黃芩素、白楊素、千層紙素A、柚皮素、橙皮素、小檗鹼、黃連鹼、藥跟鹼和巴馬亭是糖敏靈中的9種有效成份，但是目前還沒有可以同時檢測血漿樣本中這9種成份的方法。
【發明內容】
[0005]本發明提供了一種液相色譜串聯質譜法定量檢測血漿樣本中漢黃芩素、白楊素、千層紙素A、柚皮素、橙皮素、小檗鹼、黃連鹼、藥跟鹼和巴馬亭的方法。
[0006]根據本發明，檢測方法包括步驟(I)樣品的製備和步驟(2)檢測，其特徵在於步驟
(I)樣品製備採用包括以下步驟的方法:
[0007]a.向待測樣品中依次加入有機溶劑、內標溶液和強酸，並混勻；
[0008]b.加入一倍以上體積提取溶劑，混勻；
[0009]c.離心，收集上清液，並蒸乾；
[0010]d.步驟c的乾燥物重新溶解，離心，取上清液。
[0011]優選的，步驟a中所述內標為大豆苷元和四氫巴馬亭。
[0012]本發明選擇大豆苷元和四氫巴馬亭兩個內標，其中大豆苷元與漢黃芩素、白楊素、千層紙素A、柚皮素、橙皮素均為黃酮類成分，質譜響應強度相當；四氫巴馬亭與小檗鹼、黃連鹼、藥跟鹼和巴馬亭均屬於生物鹼類成分，質譜響應強度相當。為提高方法的準確度，選擇兩個內標，以大豆苷元對5個黃酮進行校準，以四氫巴馬亭對4個生物鹼進行校準，使該分析方法更為合理可靠。
[0013]本發明的方法，其中步驟a所述的有機溶劑包括但不限於甲醇、乙醇、乙酸乙酯、氯仿、乙醚、丙酮、二氯甲烷和乙醚混合溶液。優選的，步驟a中所述有機溶劑為甲醇。
[0014]本發明的方法，其中步驟a所述的酸性物質是強酸，包括但不限於鹽酸、硫酸、高氯酸，磷酸，甲酸，乙酸等。優選的，步驟a中所述酸性物質為鹽酸。
[0015]本發明的方法，其中步驟a所述的提取溶劑包括但不限於乙酸乙酯、氯仿、乙醚、丙酮、二氯甲烷和乙醚混合溶液。優選的，步驟b中所述提取溶劑為丙酮。
[0016]試驗分別考察了沉澱蛋白法、不同有機溶劑(乙酸乙酯、氯仿、乙醚、丙酮、二氯甲烷和乙醚混合溶液)液液萃取法，結果表明，甲醇沉澱蛋白法與丙酮液液萃取法的提取回收率高於其他方法。考慮到沉澱蛋白法處理後的樣品中雜質較多，因此選擇丙酮液液萃取法。又考察了酸化對樣品提取回收率的影響，結果表明，樣品中黃酮類成分經一定濃度酸化後提取率增加。因此，選擇0.5M鹽酸酸化，丙酮液液萃取的血漿樣品預處理方法。
[0017]優選的，步驟d重新溶解所用溶劑為乙腈-水。
[0018]根據本發明，液相色譜條件如下:色譜柱為反相色譜柱，流動相為0.01%-0.5%甲酸水-乙臆，體積比為10:90-90:1O0
[0019]優選的，流動相為0.1%甲酸水-乙腈，體積比為30:70。
[0020]試驗表明:以乙腈為有機相，在水相系統中加入一定量的甲酸，既可以提高待測物在正離子模式下的質譜響應，又可以改善峰形與分離效果。
[0021]根據本發明，質譜採用電噴霧離子化源，電離模式為正離子選擇反應監測。
[0022]質譜檢測分別比較了正、負兩種掃描模式，5種黃酮和4種生物鹼在ESI源正離子模式下響應強度高於負離子模式。
[0023]根據本發明，質譜噴霧電壓為4000V，白楊素、漢黃芩素、千層紙素A、柚皮素、橙皮素、大豆苷元、黃連鹼、藥跟鹼、巴馬亭、小檗鹼、四氫巴馬亭的碰撞誘導裂解電壓分別為35eV,25eV,25eV,25eV,27eV,25eV,29eV,33eV,30eV,32eV,27eV。
[0024]本發明附加的方面和優點將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過本發明的實踐了解到。
[0025]試驗一血漿樣品中5種黃酮和4種生物鹼分析方法的建立
[0026]LC-MS/MS 條件
[0027]色譜柱:ZORBAXSB-C18(150X 2.1mm, 5 μ m，Agilent)
[0028]預柱-Security Guard-C18 (4.0mmX 3.0mm 1.d, 5 μ m, Phenomenex)
[0029]流動相:7jC(含 0.1% 甲酸)-乙腈(30:70，v/v)
[0030]柱溫:25°C
[0031]流速:200μ L.mirf1
[0032]離子源:電噴霧離子化源(ESI)
[0033]電離模式:正離子模式
[0034]MS/MS:選擇反應監測(SRM)。用於定量分析的離子反應分別為m/z255 — 153 (白楊素)，m/z 285 — 270 (漢黃岑素和千層紙素A), m/z273 — 153 (柚皮素)，m/z303 — 153 (橙皮素)，m/z 255 — 199 (內標，大豆苷元)，m/z 320 — 292 (黃連鹼)，m/z338 — 322 (藥跟鹼)，m/z352 — 336 (巴馬亭)，m/z 336 — 320 (小檗鹼)，m/z 356 — 192 (內標，四氫巴馬亭)。
[0035]質譜參數:噴霧電壓:4000V;離子源電壓:10eV;毛細管溫度:350 °C ;鞘氣:N2 (35psi);輔助氣:N2 (15psi);碰撞氣體壓力:Ar 1.0mTorr (lTorr=133.3Pa);白楊素、漢黃芩素、千層紙素A、柚皮素、橙皮素、大豆苷元、黃連鹼、藥跟鹼、巴馬亭、小檗鹼、四氫巴馬亭的碰撞誘導裂解(CID)電壓分別為 35eV，25eV，25eV，25eV，27eV，25eV，29eV，33eV，30eV，32eV,27eV:掃描時間:0.5s。
[0036]溶液的製備
[0037](I)標準系列溶液的配製取漢黃芩素、白楊素、千層紙素A、柚皮素、橙皮素和小檗鹼適量，精密稱定，分別置於IOmL量瓶中，甲醇溶解並稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為1.014mg.mL \ 0.595mg.mL \ 0.507mg.mL \ 0.503mg.mL S 0.499mg.mL S 0.505mg.mL 1的對照品溶液A> ;取黃連鹼、藥跟鹼和巴馬亭適量，精密稱定，分別置於IOOmL量瓶中，甲醇溶解並稀釋至刻度，搖勻，得濃度分別為0.0498mg.mL—1，0.050Img.mL—1，0.0494mg.mL—1的對照品溶液(Tl。分別精密量取對照品溶液Α~Ι各適量，置IOOmL量瓶中，用甲醇稀釋製成混合對照品儲備液，其中各成分的濃度分別為:漢黃芩素(50.TOyg-mL-1),白楊素(1.190 μ g.ml/1),千層紙素 A (5.070 μ g.ml/1),柚皮素(5.030 μ g.ml/1),橙皮素(4.990 μ g.ml/1)，小檗鹼(5.050 μ g.ml/1)，黃連鹼(0.4980 μ g.ml/1)，藥跟鹼(0.2505 μ g.mL-1)，巴馬亭(0.4446 μ g.mL-1)。精密量取儲備液適量，用甲醇定量稀釋製成系列標準溶液，見表1。
[0038]表1標準曲線的製備
[0039]
【權利要求】
1.一種液相色譜串聯質譜法定量檢測血漿樣本中漢黃芩素、白楊素、千層紙素A、柚皮素、橙皮素、小檗鹼、黃連鹼、藥跟鹼和巴馬亭的方法，包括步驟(I)樣品的製備和步驟(2)檢測，其特徵在於步驟(I)樣品製備採用包括以下步驟的方法: a.向待測樣品中依次加入有機溶劑、內標溶液和酸性物質,並混勻； b.加入一倍以上體積提取溶劑，混勻； c.離心，收集上清液，並蒸乾； d.步驟c的乾燥物重新溶解，離心，取上清液。
2.如權利要求1所述的方法，其特徵在於步驟a中所述內標為大豆苷元和四氫巴馬亭。
3.如權利要求1所述的方法，其特徵在於步驟a中所述有機溶劑為甲醇。
4.如權利要求1所述的方法，其特徵在於步驟a中所述酸性物質為鹽酸。
5.如權利要求1所述的方法，其特徵在於步驟b中所述提取溶劑為丙酮。
6.如權利要求1所述的方法，其特徵在於步驟d重新溶解所用溶劑為乙腈-水。
7.如權利要求1所述的方法，其特徵在於液相色譜條件如下:色譜柱為反相色譜柱，流動相為0.01%-0.5%甲酸水-乙腈，體積比為10: 90-90: 10。
8.如權利要求7所述的方法，其特徵在於所述流動相為0.1%甲酸水-乙腈，體積比為30: 70。
9.如權利要求1所述的方法，其特徵在於質譜採用電噴霧離子化源，電離模式為正離子選擇反應監測。
10.如權利要求9所述的方法，其特徵在於質譜噴霧電壓為4000V，白楊素、漢黃芩素、千層紙素A、柚皮素、橙皮素、大豆苷元、黃連鹼、藥跟鹼、巴馬亭、小檗鹼、四氫巴馬亭的碰撞誘導裂解電壓分別為 35eV, 25eV, 25eV, 25eV, 27eV, 25eV, 29eV, 33eV, 30eV, 32eV, 27eV。
【文檔編號】G01N30/02GK103575814SQ201210258903
【公開日】2014年2月12日 申請日期:2012年7月24日 優先權日:2012年7月24日
【發明者】佟玲, 周水平, 朱永宏, 馬曉慧, 靳元鵬 申請人:天士力製藥集團股份有限公司