人類成體幹細胞分化成胰島素分泌細胞的方法
2023-10-25 12:09:42 3
專利名稱:人類成體幹細胞分化成胰島素分泌細胞的方法
技術領域：
本發明涉及誘導人類成體幹細胞分化成胰島素分泌細胞。
背景技術：
I型糖尿病，也被稱為胰島素依賴性糖尿病，特徵在於胰島素產生β細胞的損失，通常由在胰腺中胰島的自體免疫攻擊產生，導致胰島素的缺乏。胰島素在體內血糖水平的動態平衡上扮演關鍵角色。當胰島素缺乏或以低量產生時，血糖水平增加，導致各種器官例如腎、神經、視網膜等中的併發症。I型糖尿病的治療大多數依賴於胰島素的使用，需要在患者的一生中注射。胰島素的使用不是對I型糖尿病的根本治療。另一方面，使用外來胰腺或β細胞的移植治療I型糖尿病。然而，該方法受許多由於來自外來胰腺的外科手術移植導致的組織學上的限制。例如，移植的細胞可能被接收者的自體免疫反應 幹擾。近年來，許多研究已經聚焦於使用幹細胞開發用於糖尿病的治療，其中胚胎和成體幹細胞是有代表性的。研究已經報導胚胎幹細胞能夠離體(ex vivo)分化成胰島素產生細胞，其被發現當移植到糖尿病小鼠時治療高血糖[Fujikawa T，Oh SH, Pi L，HatchHM,Shupe T, Petersen BE(2005)Teratoma formation leads tofailure of treatment fortype I diabetes using embryonic stemcell-derived insulin-producing cells. AmJ Pathol 166，1781-1791 ;D』 Amour KA, Bang AG，Eliazer S，Kelly 0G, AgulnickAD，Smart NG, Moorman MA, Kroon E，Carpenter MK, Baetge EE (2006)Production ofpancreatic hormone-expressing endocrine cellsfrom human embryonic stem cells.Nat Biotechnol 24，1392-1401]。然而，胚胎幹細胞具有當移植時引起癌症產生的極大臨床問題[Kroon E，Martinson LA，Kadoya K，Bang AG，Kelly 0G, Eliazer S，Young H，Richardson M，Smart NG，Cunningham J，Agulnick AD，D』 Amour KA，Carpenter MK，BaetgeEE(2008)Pancreatic endoderm derived from human embryonic stem cellsgeneratesglucose-responsive insulin-secreting cells in vivo. Nat Biotechnol. 26，397-398]。
已有報導外胚層袓細胞能夠分化成胰島素產生細胞[HOTi Y，GuX, Xie X，andKim SK. (2005)Differentiation ofinsuI in-producing cells from human neuralprogenitor cells. PLoS Med. 2，103]並且胰管上皮細胞能夠分化成與胰腺中胰島的那些相同的結構[Bonner-Weir S，Taneja MiWeir GC, Tatarkiewicz K，Song KH, Sharma A andO』Neil JJ(2000)Invitro cultivation of human islets from expanded ductal tissue.Proc Natl Acad Sci USA. 97，7999-8004]。前者在的不利之處在於胰島素產生細胞獲自胎兒腦細胞，其可能在接受者中誘導腫瘤[Amariglio NiHirshberg A，Scheithauer BW, CohenY， LoewenthalR, Trakhtenbrot L， Paz N， Koren-Michowitz M， Waldman D， Leider-TrejoL，Toren A，Constantini S，Rechavi G. Donor-derived brain tumor following neuralstem ce11transplantation in an ataxia telangiectasia patient. PLoS Med. 2009 Feb17；6(2) :el000029]。後者的不利之處在於僅非常受限量的幹細胞能夠從胰管組織中獲得。此外，報導當胚胎幹細胞在包含胰島素的培養基中誘導分化時，從分化細胞分泌的胰島素實際上為取自培養基的胰島素，這被分裂成胰島素和C-肽的前肽沒有分泌的事實證明[Rajagopal J,Anderson WJ,Kume S,Martinez 01,andMelton DA(2003)Insulin stainingof ES cell progeny frominsulin uptake. Science. 299,363 ；Hansson M, Tonning A,Frandsen U, Petri A, Rajagopal J, Englund MC, Heller RS, Hakansson J, Fleckner J,Skold HN, melton K, Semb H, and SerupP(2004)Artifactual insulin release fromdifferentiatedembryonic stem cells. Diabetes 53,2603-2609]。因此，近年來已經進行許多嘗試以在不存在胰島素下誘導分化胚胎幹細胞。如以下表I中總結的，在胰島素樣生長因子(insulin-line growthfactors)或β細胞素(betacellulin)的存在下幹細胞分化成胰島素產生細胞方面已有報導。如上所述，種族問題和癌症產生，使得難以利用胚胎幹細胞治療糖尿病。此外，僅顯著低水平的胰島素和C-肽由於來自基於人類皮膚成纖維細胞或間充質幹細胞的多潛能幹細胞的分化而產生。表I
對幹細胞離體分化成胰島素產生細胞的研究
IiS分泌的胰島素~分泌的C-肽參考文獻
胚胎幹細胞-5ng/ug DNAJiang et al. ,20071)
皮膚成纖維細胞O. 15ng/ug DNA Tateishi et al. ,20082)
~間充質幹細胞1.291mU/L163ng/LLi et al. ,20083)
liJiang J, Au Μ, Lu K, Eshpeter A, Korbutt G, Fisk G, Majumdar AS(2007)Generation of insulin-producing islet-1ikeclusters from human embryonic StemCells. Stem Cells 25,1940-1953.
2)Tateishi K, He J, Taranova 0, Liang G, D，Alessio AC, Zhang Y(2008)Generation of insulin-secreting islet-1ikeclusters from human skinfibroblasts. J Biol Chem. 283，31601-31607.
3)Li L, Li F, Qi H, Feng G,Yuan K, Deng H, Zhou H. (2008) Coexpression of Pdxland betacellulin in mesenchymal StemCells could promote the differentiation ofnestin-positiveepithelium-like progenitors and pancreatic islet-likespheroids.Stem Cells Dev. 17,815-823。
發明內容
在本發明中完結的精深全面的研究由本發明人進行，涉及用於I型糖尿病的細胞治療。該研究導致以下發現當在各種已知在培養基中對分化成β細胞有效的細胞因子和生長因子的存在下進行時，並且其中培養基的葡萄糖濃度從高水平改變為低水平時，人類成體幹細胞的孵育允許成體幹細胞分化成高度有效的胰島素產生細胞。
因此，本發明的目的在於提供用於使成體幹細胞分化成胰島素分泌細胞的方法。
根據以下詳細描述連同附圖，將更清楚地理解本發明的上述和其它目的、特徵和其它優點，其中
圖I為源自眼睛周圍的皮下層的幹細胞在各種條件下被誘導分化成胰島素分泌細胞三周後，顯示細胞形態的光學顯微照片；
圖2為源自眼睛周圍的皮下層的幹細胞在各種條件下被誘導分化成胰島素分泌細胞三周，並且暴露於25mM葡萄糖2小時後，顯示通過酶聯免疫吸附檢測測定的分泌的胰島素的量的條形圖；
圖3為源自眼睛周圍的皮下層的幹細胞在各種條件下被誘導分化成胰島素分泌細胞三周，並且暴露於25mM葡萄糖2小時後，顯示通過酶聯免疫吸附檢測測定的分泌的C-肽的量的條形圖；
圖4為源自眼睛周圍的皮下層的幹細胞在各種條件下被誘導分化 成胰島素分泌細胞三周後，顯示通過免疫細胞化學檢測測定的胰島素、胰島素原、CK19和C-肽的表達的光學顯微照片；
圖5是源自眼睛周圍的皮下層的幹細胞被誘導分化成胰島素分泌細胞三周後，顯示從所述獲得的細胞分離的β細胞的特性基因的表達的瓊脂糖凝膠照片；
圖6為源自眼睛周圍的皮下層的幹細胞被誘導分化成胰島素分泌細胞三周後，顯示獲得的細胞的對胰島素產生β細胞特異的二硫腙(dithizone)染色的顯微照片；
圖7為源自眼睛周圍的皮下層的幹細胞在各種條件下被誘導分化成胰島素分泌細胞三周，並且暴露於25mM葡萄糖2小時後，顯示通過酶聯免疫吸附檢測測定的分泌的胰島素的量的條形圖；以及
圖8為源自眼睛周圍的皮下層的幹細胞在各種條件下被誘導分化成胰島素分泌細胞三周，並且暴露於25mM葡萄糖2小時後，顯示通過酶聯免疫吸附檢測測定的分泌的C-肽的量的條形圖。
具體實施方式
本發明主要通過兩個試驗實現一個檢查胰島素樣生長因子對分化的影響，另一個在β細胞素(代替激活素Α)的存在下進行分化。
根據其一方面，本發明提供離體下成體幹細胞分化成胰島素分泌細胞的方法，包括在包含20-30mM葡萄糖、補充有5-20 %胎牛血清、I-IOnM激活素A、5_20nM胰高血糖素樣肽-I和10-30ng/ml成纖維細胞生長因子_2的培養基中培養成體幹細胞4_10天，然後在包含4-7mM葡萄糖、補充有5-20%胎牛血清、5-20mM煙醯胺、I-IOnM激活素A、5_20nM胰高血糖素樣肽-I和10-100ng/ml胰島素樣生長因子的培養基中培養10-20天。
具體地，在存在細胞因子和生長因子包括成纖維細胞生長因子_2、煙醯胺、胰高血糖素樣肽-I、激活素A、胰島素樣生長因子等的培養基中，將從眼睛周圍的皮下脂肪組織分離的人類成體幹細胞誘導分化成胰島素分泌細胞，以用於治療I型糖尿病，所述培養基具有從第一培養基的高濃度至第二培養基的低濃度的葡萄糖的轉變。
把該兩步培養法應用到三組。如之前由本發明人於2007年5月提交的韓國專利申請No. 2007-44663所公開的，對照用包含20_30mM葡萄糖、存在煙醯胺，激活素A和胰高血糖素樣肽-I (NAG)的培養基處理4-10天，隨後在包含4-7mM葡萄糖、存在相同的細胞因子的培養基中孵育10-20天[NAG組]。對於第二組，在包含4-7mM葡萄糖以及胎牛血清、煙醯胺、激活素A、胰高血糖素樣肽-I和胰島素樣生長因子-I的培養基中進行10-20天的第二孵育之前，其初步處理在包含20-30mM葡萄糖以及胎牛血清、激活素A、成纖維細胞生長因子-2和胰高血糖素樣肽-I的培養基中進行4-10天[NAGI1組]。關於第三組，其分化以與第二組相同的方式誘導，除了在第二步使用胰島素樣生長因子-2代替胰島素樣生長因子-I之外。
根據其另一方面，本發明提供成體幹細胞離體分化成胰島素分泌細胞的方法，其特徵在於使用β細胞素(已知對分化有效)和Β27添加劑(Β27 supplement)(已知用作血清添加劑(serum supplement))以建立用於高效地分化和胰島素分泌的條件(實施例7)。
為了使成體幹細胞分化，具體地，在包含20_30mM葡萄糖(高葡萄糖培養基)、補充有B27添加劑，成纖維細胞生長因子-2和表皮生長因子的培養基中進行孵育1-7天，然後在具有相同濃度的葡萄糖、補充有胎牛血清，激活素A，成纖維細胞生長因子-2和胰高血糖 素樣肽-I的培養基中培養1-7天。
其後，在包含4_7mM葡萄糖(低葡萄糖培養基)、存在細胞因子和生長因子包括胎牛血清、激活素A、成纖維細胞生長因子-2，胰高血糖素樣肽-I的培養基中培養細胞1-7天，最後在包含4-7mM葡萄糖補充有胎牛血清、β細胞素、煙醯胺和胰高血糖素樣肽-I的培養基中培養10-20天。
在本發明中可用的為DMEM(Dulbecco改良的Eagle培養基)或DMEM/F12 (I I的 Dulbecco 改良的 Eagle 培養基營養混合物(Nutrient mixture)F-12)。
以下將給出誘導成體幹細胞分化成胰島素分泌細胞的詳細描述。
從眼睛或頰周圍的皮下層外科手術地獲得的脂肪用I型膠原酶在37°C下處理30min，然後離心。這樣獲得的細胞團在補充有胎牛血清的培養基中培養以提供成體幹細胞。
為了分化成胰島素分泌細胞，將幹細胞在分化誘導培養基中培養15-30天。首先，將它們在膠原包被的培養皿中在補充有5-20%胎牛血清、5-20nM胰高血糖素樣肽-I、I-IOnM激活素A和10-30ng/ml成纖維細胞生長因子_2的高葡萄糖培養基中孵育4_10天。其後，將它們轉移到補充有5-20%胎牛血清、5-20mM煙醯胺、5-20nM胰高血糖素樣肽-I、I-IOnM激活素A和10-100ng/ml胰島素樣生長因子的低葡萄糖培養基中，然後孵育10-20天。
孵育完成15-30天時，在暴露到高葡萄糖培養基(進行2小時)之前，將細胞在低葡萄糖培養基中用牛血清白蛋白(BSA)處理10-15小時。這樣最後獲得的培養物使用酶聯免疫吸附檢測定量分析胰島素和C-肽。發現與非分化條件(陰性對照)相比，本發明中定義的分化條件以提高的量誘導胰島素和C-肽的分泌。儘管在NAGIl組(補充有胰島素樣肽-I)和NAG組之間在胰島素和C-肽的分泌上沒有差異，使用胰島素樣肽-2(NAGI2組)允許胰島素的分泌比使用胰島素樣肽-KNAGIl組)高8倍，C-肽高6倍。在胰島素樣肽-2存在下分化的細胞的遺傳分析指出，當它們的分化在第一步的培養基中誘導時，ND (神經分化因子Uneuro Dl))、PC (激素原轉化酶)l/3、PC2、NGN3、Glut (葡萄糖轉運體)l、Glut 2、pax4,pdxl—已知作為對胰腺的β細胞特異的基因-開始表達；以及在第二步的培養基中的孵育期間nkx 6-1和胰島素基因表達。同樣，所述細胞通過免疫化學染色測定觀察到表達CK19、胰島素原、胰島素和C-肽，並且被二硫腙，一種對胰腺的β細胞特異的染料，強烈地染色。
因此，根據本發明使成體幹細胞分化成胰島素分泌細胞的方法基本上由兩步培養法組成，其中首先在存在成纖維細胞生長因子_2、激活素A和胰高血糖素樣肽-I的高葡萄糖培養基中，然後在存在煙醯胺、激活素A、胰高血糖素樣肽-I和胰島素樣生長因子-2的低葡萄糖培養基中，誘導成體幹細胞經受分化，在胰島素分泌的效率上其優於NAG組使用的方法，所述NAG組使用的方法在2007年5月提交的韓國專利申請No. 2007-44663中公開。
作為選擇，根據本發明有效的胰島素分泌細胞能夠如下從成體幹細胞分化。
在包含20-30mM葡萄糖、O. 5X-4X B27添加劑、10_30ng/ml成纖維細胞生長因子_2和10-30ng/ml表皮生長因子的高葡萄糖培養基中將成體幹細胞培養1_7天，然後在包含20-30mM葡萄糖、5-20 %胎牛血清、I-IOnM激活素A、5_20nM胰高血糖素樣肽-I和10_30ng/ ml成纖維細胞生長因子-2的高葡萄糖培養基中1-7天，然後在包含4-7mM葡萄糖、5-20%胎牛血清、I-IOnM激活素A、5-15nM胰高血糖素樣肽-I和10_30ng/ml成纖維細胞生長因子-2的低葡萄糖培養基中1-7天，最後在包含5-20%胎牛血清、5-20mM煙醯胺、l-10ng/mlβ細胞素、和5-20ηΜ胰高血糖素樣肽-I的低葡萄糖培養基中10-20天。
在β細胞素的存在下分化後，發現分化的細胞(BTC)比NAG組各自高6倍地產生膜島素和C-妝。
因此，在存在Β27添加劑和β細胞素(分別代替胎牛血清和激活素Α)的情況下分化的細胞，能夠比NAG組更有效地分泌胰島素。
通過以下實施例可以獲得本發明的更好理解，所述實施例用於舉例說明，但不解釋為本發明的限制。實施例I幹細胞的分離
在整形外科醫院在患者的允許下外科手術地從眼睛周圍的皮下層切離的脂肪組織，用O. 075% I型膠原酶溶液在37°C下處理30min，然後用與膠原酶溶液相同體積的補充有胎牛血清的培養基終止酶活性。離心後，這樣形成的細胞團用培養基洗滌兩次，並在補充有10%胎牛血清的DMEM-LG中孵育。實施例2幹細胞培養
在分化誘導培養基中將獲得的幹細胞培養21天。為此，首先，將細胞以5xl03細胞/孔的密度接種在膠原包被的48孔板，在孵育(進行7天)之前，向所述膠原包被的48孔板添加包含25mM葡萄糖、補充有10%胎牛血清、4nM激活素A、10nM胰高血糖素樣肽-I和20ng/ml成纖維細胞生長因子_2的培養基(DMEM-HG)。其後，將細胞在包含5. 5mM葡萄糖，補充有10 %胎牛血清、IOmM煙醯胺、4nM激活素A、IOnM胰高血糖素樣肽_1和50ng/ml胰島素樣生長因子-I或胰島素樣生長因子-2的培養基(DMEM-LG)中進一步培養另外14天。
孵育期間，每隔3-4天將培養基用新培養基更換。總共孵育3周之後，如下檢查細胞的分化。實施例3分化後細胞的形態學變化
將幹細胞從眼睛周圍的皮下脂肪分離並培養，監視其形態學變化。儘管在無生長因子和細胞因子的培養基中孵育後在形態學上保持不變，但當它們用生長因子和/或細胞因子例如煙醯胺，激活素A和胰高血糖素樣肽-I或胰島素樣生長因子-I或-2處理時，觀察到所述幹細胞經受形態學變化為圓形(圖I)。誘導分化3周時，細胞在形態學上變圓，形成細胞簇。實施例4胰島素和C-肽分泌的檢查
3周的培養結束後，將細胞用補充有O. 5%牛血清白蛋白的低葡萄糖培養基(DMEM-LG)處理12小時。然後，將細胞暴露於DMEM-HG 2小時並使用酶聯免疫吸附檢測定量分析分泌的胰島素(圖2)。同樣，隨胰島素從胰島素原剪接的C-肽的量也使用酶聯免疫吸附檢測測定(圖3)。為了胰島素和C-肽兩者的酶聯免疫吸附檢測，使用商業上購自Mercodia, Sweden的試劑盒。將濃度為已知的標準溶液和如上獲得的培養物以25 μ L每孔的量平板接種在用人胰島素或C-肽包被的96孔微孔板上，其後將針對胰島素或C-肽的抗體添加到板上並孵育I小時。隨後，與TMB底物溶液孵育30分鐘，緊接著進行吸光度測定。胰島素或C-肽都不從未誘導分化的細胞中分泌，而發現使用本發明兩步法培養的組產生胰島素和C-肽兩者。具體地，測定在胰島素樣肽-2存在下培養的組(NAGI2組)比NAG組胰島素分泌約高8倍，C-肽約高6倍。實施例5對胰島素分泌細胞特異的蛋白質的表達
在胰島素樣肽-2的存在下將從眼睛周圍的皮下脂肪獲得的幹細胞誘導分化，其已通過酶聯免疫吸附檢測測定被證明最有效，之後使用免疫細胞化學檢測就CK19、胰島素、C-肽和胰島素原(細胞外分泌前保持未分裂)的表達，檢測所得的胰島素分泌細胞(圖4)。分化持續3周後，將細胞暴露到高濃度的葡萄糖2小時，在4°C下用4%多聚甲醛固定90分鐘，用磷酸鹽緩衝生理鹽水洗滌3次。將細胞用3%過氧化氫處理10分鐘以除去內源性過氧化物酶，然後與補充有2 %牛血清白蛋白的PBS在室溫下一起孵育60min以阻斷背景信號。細胞培養物與在PBS中的針對人CK19 (I 400)、C-肽(I 500)、胰島素(I 500)·和胰島素原(I 500)的一抗的稀釋液在4°C下反應12小時。對於陰性對照，使用無一抗的PBS0將它們各自用生物素綴合的二抗和過氧化氫綴合的抗生蛋白鏈菌素(streptavidin)處理20min，然後用3，3』_ 二氨基聯苯胺(DAB)著色。與其中未誘導分化的對照相比，用全部煙醯胺、激活素A和胰高血糖素樣肽處理的組觀察到CK19、C-肽、胰島素和胰島素原全部具有顯著增加的表達水平(圖4)。實施例6參與胰島素分泌的基因的表達
使用逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)，就胰島素分泌細胞的特性基因的表達，檢查在源自眼睛周圍的皮下層的幹細胞誘導分化後第7，14和21天取得的細胞。
最初，總RNA從分化細胞分離。將ImL Tri-reagent加入試管中的細胞，並與200 μ L氯仿徹底地混合,然後在室溫下孵育15min。在14，OOOrpm下離心15min後,將這樣形成的上清液轉移到新試管並與異丙醇混合。在14，OOOrpm下離心IOmin形成團，然後向其添加75%乙醇。該懸浮液再次在14，OOOrpm下離心lOmin。抽除(drawn off)上清液，將殘餘的75%乙醇蒸發，其後將殘留物溶解於無菌的去離子水，在65°C下孵育5min以洗脫RNA。該RNA通過在UV分光光度計中在260nm下讀取吸光度來定量分析。將7. 5 μ g的總RNA與Ix反應緩衝液，ImM dNTP, O. 5mg/ml寡脫氧胸腺核苷酸(oligo-dT)，20U RNA酶抑制劑和20U M-MuLV逆轉錄酶混合，並且在42°C下孵育(進行60min)之前添加無菌的去離子水以形成50 μ L的終體積。
在包含Ix Taq緩衝液、2mM MgCl2、0. 25U Taq聚合酶和IOpmol引物的混合溶液中進行PCR，其中所述引物序列的各cDNA與如表2中所示的各基因互補。
通過在94°C下預變性5min來開始PCR，進行35個如下循環在94°C下變性30sec，在各自溫度下退火30sec，在72°C下延伸30sec，然後在72°C下後延伸5min。將這樣獲得的15yL各PCR產物隨6x上樣緩衝液(loading buffer) (0. 25%溴酚藍，(λ 25% 二甲苯藍，40%庶糖)一起加載到2%瓊脂糖凝I父,在100V電場的存在下運彳丁 30min。電泳完成後，將凝膠用溴化乙錠染色，並在UV透照儀(Vilber loumat, FRANCE)上觀察。確定各基因的表達水平，並與作為對照的甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)比較。為了比較分析，數據從三次測定中獲得。
在RT-PCR中用於擴增胰島素分泌細胞的各特徵基因的引物序列，其名稱以及PCR產物的大小列於以下表2。表2
退火
大小
基因引物溫度注釋
(bp)
(dC)
5』 -acaactttggtatcgtggaa-3』 (SEQ ID NO. I)
GAPDH456 53 NM—002046
5』 -aaattcgttgtcataccagg-3』 (SEQ ID NO. 2)
5』 -aaccaacacctgtgcggctc-3』 (SEQ ID NO. 3)
胰島素320 59 J00265
5，-aagggctttattccatctctctcg-3』 (SEQ ID NO. 4)
5』 -cgtgaactccttgaactgagcag-3』 (SEQ ID NO. 5) ngn3211 61 AF234829
5，-tggcactcctgggacgagtttc-3，(SEQ ID NO. 6)
5』 -cccatggatgaagtctacg-3』 (SEQ ID NO. 7) pdxl262 54 NM—000209
5，-gtcctcctcctttttccac-3』 (SEQ ID NO. 8)
5 』-gaataccccccagagaccttttc-3 』 (SEQ ID NO. 9)
GK182 61 M90299
5， -ggtttcttcctgagccagcg-3』 (SEQ ID NO.10)
5』 -agcatcaatgtcctctcaacttcc-3』 (SEQ ID NO.II)
Isll493 57 NM—002202
5， -tgtttggcaaggcaatgacc-3， (SEQ ID NO.12)
5， -acacgagacccactttttccg-3， (SEQ ID NO.13)
Nkx6.I336 59 NM—006168
5， -tgctggacttgtgcttcttcaac-3， (SEQ ID NO.14)
5， -agctttgcagttggtggaat-3』 (SEQ ID NO.15)
Glut 2300 57 NM—000340
5』 -aataagaatgcccgtgacga-3』 (SEQ ID NO.16)
5』 -cagaaccaggacatgccc-3』 (SEQ ID NO. 17)
ND216 60 NM—002500
5』 -atcaaaggaagggctggtg-3』 (SEQ ID NO.18)
膜同血糖 5，-atgaacgaggacaagcgc-3』 (SEQ ID NO. 19)
236 57 NM—002054
素5，-gtaacgaaccgaccactt-3，(SEQ ID NO. 20)
權利要求
1.將人類成體幹細胞離體分化成胰島素分泌細胞的方法，包括 在包含20-30mM葡萄糖、補充有5-20%胎牛血清、I-IOnM激活素A、5-20nM胰高血糖素樣肽-I和10-30ng/ml成纖維細胞生長因子_2的培養基中培養成體幹細胞4_10天；和在包含4-7mM葡萄糖、補充有5-20 %胎牛血清、5_20mM煙醯胺、I-IOnM激活素A、5-20nM胰高血糖素樣肽-I和10-100ng/ml胰島素樣生長因子的培養基中培養所述培養的幹細胞10-20天。
2.根據權利要求
I所述的方法，其中所述胰島素樣生長因子為胰島素樣生長因子_2。
3.將人類成體幹細胞離體分化成胰島素分泌細胞的方法,包括順序地培養成體幹細胞 在包含20-30mM葡萄糖，補充有B27添加劑、10_30ng/ml成纖維細胞生長因子_2和10-30ng/ml表皮生長因子的培養基中1-7天； 在包含20-30mM葡萄糖，補充有5-20%胎牛血清、I-IOnM激活素A、5_20nM胰高血糖素樣肽-I和10-30ng/ml成纖維細胞生長因子_2的培養基中1_7天； 在包含4-7mM葡萄糖，補充有5-20%胎牛血清、I-IOnM激活素A、5_20nM胰高血糖素樣肽-I和10-30ng/ml成纖維細胞生長因子_2的培養基中1_7天；以及 在包含4-7mM葡萄糖，補充有5-20%胎牛血清、5-20mM煙醯胺、l-10ng/ml β細胞素和5_15ηΜ胰高血糖素樣肽的培養基中10-20天。
專利摘要
公開了將人類成體幹細胞分化成胰島素分泌細胞的方法。將從眼睛周圍的皮下脂肪組織分離的人類成體幹細胞，在存在細胞因子和生長因子包括B27添加劑，成纖維細胞生長因子-2，表皮生長因子，煙醯胺，胰高血糖素樣肽-1，激活素A，胰島素樣生長因子，β細胞素等的培養基中，誘導分化成胰島素分泌細胞，所述培養基具有從高濃度至低濃度的葡萄糖轉變。具有高水平產生胰島素和C-肽的能力，所述胰島素分泌細胞可以為用於1型糖尿病的優良治療物。
文檔編號GKCN101724602 B發布類型授權 專利申請號CN 200910207018
公開日2013年1月9日 申請日期2009年10月23日
發明者金海權, 姜賢美 申請人:孔喜淑導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan專利引用 (2), 非專利引用 (2),