一種從麝鼠香中製備具有抗血栓形成活性的物質的方法以及由該方法獲得的物質的製作方法

2023-10-25 19:10:22 3

專利名稱：一種從麝鼠香中製備具有抗血栓形成活性的物質的方法以及由該方法獲得的物質的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種從麝鼠香中製備抗血栓形成劑的方法，以及由該方法 獲得的具有高效能的抗血栓形成劑。更具體地說，本發明涉及一種從麝鼠 香中製備抗血栓形成劑的方法，以及由該方法獲得的具有高效能的抗血栓 形成劑，該方法包括，用有機溶劑處理麝鼠香以獲得有機溶劑提取物，進 行兩次正相柱層析和一次反相柱層析以獲得多個級分，並且測量每一級分 的凝血酶時間。
背景技術：
麝鼠(OwtorazA"/7/cw)為哺乳動物，屬於齧齒目鼠科，為橢圓形， 身長約35cm，尾長25cm，重約lkg。麝鼠通常鄰近充滿雜草的沼澤和湖泊。 麝鼠在春天至深秋活動，冬天活動有限。麝鼠為食草動物，但也吃魚或水 生動物。麝鼠實行單配偶，並且具有良好的繁殖能力。雌性麝鼠4月至9 月繁殖， 一年產2或3窩。雄性麝鼠通過副生殖腺從位於下腹部的兩個香 囊分泌麝香，這是它要繁殖的性興奮的徵兆。麝鼠香是一種呈膚色的液體， 具有甘甜的氣味，而一隻雄性麝鼠平均一年產5至8g麝鼠香。
麝鼠香的組成和藥理作用，與麝鹿的麝香相似。因此，將其作為一種 替代來源於麝鹿的麝香的藥用原料是值得關注的。
直到最近，大多數的天然麝香是從麝鹿中獲得的，並且作為藥用原料。 然而，在CITES (瀕危野生動植物種國際貿易公約)條約中，將麝鹿列為 瀕危動物，並將其指定為一級保護動物，因此屠殺和繁殖麝鹿以獲取麝香 都是被禁止的。因此，利用從麝貓中獲得的麝貓香作為藥用原料，但是所 能得到的量非常少，並且自從麝貓被認為是SARS的來源，目前麝貓已被 屠殺和消毒。
因此，麝鼠具有發展成為家畜產業的一種新的動物來源的高潛力。更 進一步地，由於麝鼠香與來源於麝鹿的麝香具有相似的藥理作用，它具有
4發展成為替代來源於麝鹿的麝香的藥用原料，以及發展成為化妝品和香料 的高潛力。
同時，阿司匹林公知具有抗血栓形成作用，能預防心力衰竭/血液凝結， 減弱心臟病發作時的心臟損傷，並且它能有效地減輕例如與負重練習相關 的肌肉痛的疼痛，消除輕傷的疼痛、治療炎症、緩解發熱、消除頭痛、消 除膝蓋和肩部的慢性痛等等。然而，阿司匹林具有缺點，它會稀釋血液， 從而導致出血性卒中的風險，並且會降低消化能力，長期施用會導致胃痙 攣。此外，兒童和青少年施用阿司匹林，會患上致命的雷耶症候群(一種 在嬰兒中常見的腦損傷)。
施用抗血栓形成劑，以預防心血管疾病，例如心力衰竭、中風等等，
上市藥物例如Plavix片(Sanofi-Aventis)、 Asprinprotect片(Bayer)、培達 片(Otsuka Pharm.)、 Disgren膠囊(Myoung-In Pharmaceutical Co., Ltd)、 Opalmon片(Dong A Pharmaceutical Co" Ltd.)等等，在韓國，2006-2007 年間被開具抗血栓形成劑處方的患者中有超過半數施用這些藥物。
因為Plavix片的專利到期，含有200mg雙嘧達莫和25mg阿司匹林的 組合藥物AggrenoxR (Behringer Ingelheim)變得備受關注。AggrenoxR比阿 司匹林更有效，並且其對中風恢復患者有顯著療效。
然而，沒有任何從麝鼠香中分離具有抗血栓形成活性的物質的研究
發明內容
技術問題
本發明人致力於從麝鼠香中分離具有有效的抗血栓形成活性的物質， 己經發現了具有比阿司匹林更高的抗血栓形成活性的物質。
本發明的一個目的，是提供一種從麝鼠香中製備高效的抗血栓形成劑 的方法。
本發明的另一個目的，是提供一種包含該抗血栓形成劑的抗血栓形成 組合物。 技術方案
第一方面，本發明提供了一種從麝鼠香中製備抗血栓形成劑的方法， 該方法包括以下步驟
用選自乙醇、甲醇、己垸和乙酸乙酯的有機溶劑處理麝鼠香， 行振搖提取，離心有機溶劑提取物，獲得上清液(第1步)；
對上清液進行第1次正相柱層析，獲得各級分(第2步)；對各級分進行薄層層析以確定級分的物質圖譜，並且將其分組(第3
步)；
測量所劃分的各組的凝血酶時間，並且選擇出顯示最強抗血栓形成活性的一組(第4步)；
對選擇出的組進行第2次正相柱層析，獲得各級分(第5步)；對各級分進行薄層層析以確定級分的物質圖譜，並且將其分組(第6
步)；
測量所劃分的各組的凝血酶時間，並且選擇出顯示最強抗血栓形成活性的一組(第7步)；
對選擇出的組進行第3次反相柱層析，獲得各級分(第8步)；
對各級分進行反相薄層層析以確定級分的物質圖譜，並且將其分組(第
9步)；以及
測量所劃分的各組的凝血酶時間，並且選擇出顯示最強抗血栓形成活
性的一組(第10步)。
第二方面，本發明提供了一種由上述方法獲得的抗血栓形成劑，其具
有凝血酶時間超過40秒的高效能。
第三方面，本發明提供了一種治療血栓形成的組合物，該組合物包含根據第二實施方案的具有高效能的抗血栓形成劑。
在下文中，進一步詳細描述本發明。
首先，淨取麝鼠香，並且保存於陰冷的房間。收集的麝鼠香用選自乙醇、甲醇、己垸和乙酸乙酯的有機溶劑處理，進行振搖提取，離心，獲得上清液，作為有機溶劑提取物。為了達到提取
效果，100重量份的麝鼠香優選使用10至20重量份的有機溶劑。
離心後的殘渣再用相同的溶劑處理，進行振搖提取，離心，獲得上清
液，與上述步驟中製備的上清液一起作為有機溶劑提取物。
為達到最大的提取效果，採用振搖提取，但不限於以150至200rpm振
搖20至24小時。特別地，轉速低於150rpm振搖力弱，轉速高於200rpm
則損傷儀器，這都不是優選的。振搖提取優選重複三次或更多。
為得到最多的沉澱，在提取效果和經濟因素方面最優選的是，離心採用但不限於以8,000至20，000rmp離心10至20分鐘。
關於第2步，對有機溶劑提取物進行第1次正相柱層析，獲得柱級分。柱填料採用正相矽膠(230至400目)，作為流動相的有機溶劑包括但不限於己垸和極性高於己垸的另一種溶劑的溶劑組合，例如，己垸和乙酸乙酯、己垸和氯仿、己烷和丙酮、己烷和乙腈、乙酸乙酯和乙醇、或乙酸乙酯和甲醇，其中所述溶劑的組合比例由400:1增至1:1以獲得眾多級分。
關於第3步，第2步中所獲得的各級分進行薄層層析以確定級分的物質圖譜，並且將其分組。在展開效果(提取效果)方面優選的是，薄層層析的展開劑為10:1至10:2的己烷:乙醚，或3:1至3的己垸:乙酸乙酯。
各級分的物質圖譜的形成通過下列三個步驟按順序進行
a) 將各級分暴露於短波長(254nm)燈和長波長(365nm)紫外燈，鑑別物質圖譜；
b) 用10%硫酸處理薄層層析板，加熱以顯示著色的點，再一次鑑別物質圖譜；以及
c) 根據步驟a)和b)所鑑別的圖譜，將具有相似移動距離的物質分組。
關於第4步，測量第3步中所劃分的各組的凝血酶時間，並且選擇顯示最強抗血栓形成活性的一組。凝血酶時間是指直至纖維蛋白原凝塊形成的時間，ia不限於此。例如，用Thrombitimer2 (Behnk Elektronik，德國)計數的加入凝血酶(T46481KU-59NIH單位/mg)和纖維蛋白原後直至形成纖維蛋白原凝塊的時間。
關於第5步，用第4步中所選擇的具有最高抗血栓形成活性的組進行第2次正相柱層析，獲得柱級分。在提取效果和經濟因素方面優選的是，柱填料採用正相矽膠(230至400目)，並且如上所示，作為流動相的溶劑選自己烷和乙酸乙酯、己垸和氯仿、己垸和丙酮、己垸和乙腈、乙酸乙酯和乙醇、乙酸乙酯和甲醇等等，其中所述溶劑的組合比例由70:1增至1:1。
關於第6步，第5步中所獲得的各級分進行薄層層析以確定級分的物質圖譜，並且將其分組。如上所示，薄層層析的展開劑為10:1至10:2的己垸:乙醚，或3:1至3的己烷:乙酸乙酯。
各級分的物質圖譜的形成通過下列三個步驟按順序進行
a)將各級分暴露於短波長(254nm)燈和長波長(365nm)紫外燈，鑑別物質圖譜；
b) 用10%硫酸處理薄層層析板，加熱以顯示著色的點，再一次鑑別物質圖譜；以及
c) 根據步驟a)和b)所鑑別的圖譜，對具有相似移動距離的物質分組。
關於第7步，測量第6步中所劃分的各組的凝血酶時間，並且選擇顯示最強抗血栓形成活性的一組。凝血酶時間是指纖維蛋白原凝塊形成的時間，但不限於此。例如，用Thrombitimer2 (Behnk Elektronik,德國)計數的加入凝血酶(T46481KU-59NIH單位/mg)和纖維蛋白原後，直至形成纖維蛋白原凝塊的時間。
關於第8步，對所選擇的組進行第3次反相柱層析，獲得柱級分。在提取效果和經濟因素方面優選的是，柱填料採用反相矽膠(63至212)，作為流動相的溶劑為選自乙腈、甲醇、乙醇和丙酮的有機溶劑與水混合而成，其中所述有機溶劑與水的組合比例由20:1增至1:1。
關於第9步，對第8步中所獲得的各級分進行反相薄層層析以確定其物質圖譜，並且將其分組。薄層層析的展開劑為40:1至60:1的乙腈:水，或1:1至2:1的乙酸乙酯:甲醇。
如上所示，各級分的物質圖譜的形成通過下列三個步驟按順序進行
a) 將各級分暴露於短波長(254nm)燈和長波長G65nm)紫外燈，鑑別物質圖譜；
b) 用10%硫酸處理薄層層析板，加熱，顯色，再一次鑑別物質圖譜；
並且
c) 根據步驟a)和b)鑑別的圖譜，將具有相似移動距離的物質分組。關於第10步，測量第9步中所劃分的各組的凝血酶時間，並且選擇顯
示最強抗血栓形成活性的組。
凝血酶時間是指直至纖維蛋白原凝塊形成的時間，但不限於此。例如，用 Thrombitimer2 ( Behnk Elektronik，德國)計數的加入凝血酶(T46481KU-59NIH單位/mg)和纖維蛋白原後直至形成纖維蛋白原凝塊的時間。
如圖8所示，在稀釋50倍的情況下，所獲得的抗血栓形成劑每0.002mg具有至少40秒的凝血酶時間，與阿司匹林每O.lmg具有15秒凝血酶時間
8相比，其顯示了超過三倍的顯著優良的抗血栓形成效果，。
雖然該抗血栓形成劑的確切結構還未確定，但假定其屬於具有25個碳原子、48個氫原子和2個氧原子的脂肪酸類。
此外，本發明提供了一種治療血栓形成的組合物，該組合物包含具有高效能的抗血栓形成劑。將已知的具有抗血栓形成作用的作為藥物的常規成分與該組合物混合，可以預期在治療血栓形成方面具有協同作用。有益效果
如上所述，本發明提供了一種從麝鼠香中獲得的、與阿司匹林相比具有高效能的抗血栓形成劑，以及一種包含該抗血栓形成劑的用於治療血栓形成的組合物，因此，這可以增加麝鼠香的附加價值。


圖1表示從麝鼠香中獲得溶劑提取物的流程圖。圖2表示從麝鼠香中分離抗血栓形成物質的流程圖。圖3表示第1次正相柱層析所獲得的級分的薄層層析結果，其中該結果分組。
圖4表示在圖3中顯示的第1次正相柱層析所獲得的級分的凝血酶時間的圖表。
圖5表示在圖4中顯示的Bl-5級分的第2次正相柱層析所獲得的級分的薄層層析結果，其中該結果分組。
圖6表示在圖5中顯示的第2次正相柱層析所獲得的級分的凝血酶時間的圖表。
圖7表示在圖6中顯示的B2-6級分的第3次反相柱層析所獲得的級分的反相薄層層析結果，其中該結果分組。
圖8表示在圖7中顯示的第3次柱層析所獲得的級分的凝血酶時間的圖表。
本發明的最佳實施方式材料
本發明所必須使用的麝鼠香，是從釜山大學附屬的麝鼠機構(muskrat-run)的麝鼠中獲取的。正相柱所用的柱填料為Merck (德國)矽膠(230至400目，美國試驗與材料協會)，並且反相柱所用的柱填料為Wako(日本)RP-18 (63至212口)矽膠。Thrombitimer2 (Behnk Elektronik，德
國)用於計數凝血酶時間，以確定柱層析所獲得的各級分的抗血栓形成活性。
實施例l:麝鼠香的乙醇提取物
參見圖1，麝鼠香採用有機溶劑進行連續提取，所述麝鼠香淨取自麝鼠並保存於陰冷房間。
具休地，將40g麝鼠香加入錐形瓶中，向其中加入乙醇(麝鼠香重量的5倍，200ml)，並且以150rpm振搖混合物24小時，以20，000rpm離心，
獲得上清液。
殘渣中加入相等量的乙醇重複進行乙醇提取，得到除了上述乙醇提取物之外的另一乙醇提取物。
殘渣中加入200ml乙酸乙酯，按照乙醇提取中所示方法，收集乙酸乙酯提取物。殘渣中進一步加入200ml己垸，按照乙醇提取中所示方法，收集己垸提取物。
本發明的實施方式
實施例2:麝鼠香乙醇提取物的第1次正相柱層析和薄層層析參見圖2，實施例1中獲得的乙醇提取物經由第1次正相柱層析進行細分。
柱填料為正相矽膠(230至400目)，並且作為流動相的溶劑為己烷和乙酸乙酯，其中所述溶劑的組合比例由400:1增至1:1，獲得116個級分。
採用薄層層析鑑別各級分的物質圖譜，所用展開溶劑為己烷和乙醚(10:1.5)。
通過短波紫外燈(254nm)和長波紫外燈(365nm)進一步鑑別各級分的圖譜。用10。%硫酸處理薄層層析板並加熱後，通過著色的點再一次鑑別圖譜。
根據上述鑑別圖譜，將各級分劃分成具有相似移動距離的7組，即Bl-l至Bl-7組，如圖3所示。
研究這7組的抗血栓形成活性。按照Choi等人，Kor. J. Pharmacogn. 26, 154-158， 1995和Son等人，Kor. J. Pharmacogn. 34(1):52-61， 2004中描述的方法，通過計數凝血酶時間測量其 活性。
具體地，用Thrombitimer2 (Behnk Elektronik,德國)測量凝血酶時間， 將固定濃度的樣品溶於10口 二甲亞碸(DMSO)，將該溶液和50口硼酸鹽 緩衝液(pH7.8)加入試管中，再將1單位/50口的凝血酶(T46481KU-59NIH 單位/mg固體，Sigma Co.， USA)與該溶液混合，混合物於37匸加熱5分鐘， 加入200口的纖維蛋白原(0.33%, Sigma Co.，USA)，計數直到出現凝結的 吋間。
與柱分離的級分相比，將用於溶解樣品的水和二甲亞碸作為對照組， 阿司匹林(Sigma Co., USA)作為試驗對照組。
通過計數凝血酶時間測量抗血栓形成活性，並且計算至少3次實驗的 平均值。該結果顯示在圖4中。
Bl-5組顯示了高於阿司匹林的抗血栓形成活性。
實施例3:第1級分的第2次正相柱層析和薄層層析
參見圖2，在實施例2中Bl-5組顯示了高於阿司匹林的抗血栓形成活 性，該組通過第2次正相柱層析進行細分。
作為流動相的溶劑為己烷和乙酸乙酯，其中所述溶劑的組合比例由 70:1增至1:1，獲得172個級分。
按照實施例2中所示的方法，鑑別以上獲得的各級分的圖譜，並且將 結果列於圖5中。按照移動距離將各級分劃分成9組(B2-l至B2-9)，並 且用於測量抗血栓形成活性。
按照實施例2中的方法測量第2次正相柱所獲得的物質的抗血栓形成 活性，並且如圖6所示，在稀釋250倍的情況下，B2-6組物質顯示了高於 阿司匹林超過2倍的抗血栓形成活性。
實施例4:第2級分的第3次反相柱層析和薄層層析 參見圖2，在實施例3中B2-6組顯示了高於阿司匹林的抗血栓形成活 性，該組通過反相柱層析進行細分。
用作填料的是反相矽膠(63至212口)，作為流動相的溶劑是乙腈和7jC，
ii其中所述溶劑的組合比例由20:1增至1:0，獲得234個級分。
採用反相薄層層析鑑別各級分的物質圖譜，並且通過短波紫外燈 (254nm)和長波紫外燈(365nm)鑑別各級分的圖譜。用10%硫酸處理薄 層層析板並加熱後，然後通過著色的點再一次鑑別圖譜。
根據上述所鑑別圖譜，將各級分劃分成具有相似移動距離的7組，即 B3-l至B3-7組，如圖7所示。
按照實施例2所示方法測量抗血栓形成活性，如圖8所示，B3-4和B3-5 組顯示了高於阿司匹林的抗血栓形成活性。值得注意的是，在稀釋50倍的 情況下，每0.002mg B3-4和B3-5組的樣品顯示至少40秒的凝血酶時間， 與阿司匹林每O.lmg具有15秒凝血酶時間相比，其顯示了超過三倍的顯著 優良的抗血栓形成效果。
工業應用性
本發明提供了一種從麝鼠香中獲得的、與阿司匹林相比具有高效能的 抗血栓形成劑，以及一種包含該抗血栓形成劑的抗血栓形成組合物，因此， 這可以增加麝鼠香的附加價值。
權利要求
1、一種從麝鼠香中製備抗血栓形成劑的方法，其包括下列步驟用選自乙醇、甲醇、己烷和乙酸乙酯的有機溶劑處理麝鼠香，進行振搖提取，離心有機溶劑提取物，獲得上清液(第1步)；對上清液進行第1次正相柱層析，獲得各級分(第2步)；對各級分進行薄層層析以確定其物質圖譜，並且將其分組(第3步)；測量所劃分的各組的凝血酶時間，並且選擇顯示最強抗血栓形成活性的一組(第4步)；對所選擇的組進行第2次正相柱層析，獲得各級分(第5步)；對各級分進行薄層層析以確定其物質圖譜，並且將其分組(第6步)；測量所劃分的各組的凝血酶時間，並且選擇顯示最強抗血栓形成活性的一組(第7步)；對所選擇的組進行第3次反相柱層析，獲得各級分(第8步)；對各級分進行反相薄層層析以確定其物質圖譜，並且將其分組(第9步)；以及測量所劃分的各組的凝血酶時間，並且選擇顯示最強抗血栓形成活性的一組(第10步)。
2、 權利要求l的方法，其中第l步振搖提取中，每100重量份的麝 鼠香使用10至20重量份的有機溶劑。
3、 權利要求1的方法，其中第1步中的振搖提取以150至200rpm 振搖20至24小時。
4、 權利要求1的方法，其中第1步中的離心以8,000至20,000rmp 離心10至20分鐘。
5、 權利要求l的方法，其中離心後的殘渣再用與之前振搖提取步驟 所用的相同的溶劑進行處理，然後離心提取物，獲得上清液，與之前提 取步驟中製備的上清液一起用於第2步驟。
6、 權利要求1的方法，其中第2步中第1次正相柱層析採用正相矽 膠(230至400目)，並且作為流動相的有機溶劑組合選自己垸和乙酸乙酯、己烷和氯仿、己垸和丙酮、己垸和乙腈、乙酸乙酯和乙醇、或乙酸乙酯和甲醇，其中所述溶劑的組合比例由400:1增至1:1。
7、 權利要求1的方法，其中第3和6步中用於薄層層析的展開劑為 10:1至10:2的己烷:乙醚，或3:1至3:2的己垸:乙酸乙酯。
8、 權利要求1的方法，其中第9步中用於薄層層析的展開劑為40:1 至60:1的乙腈:水，或1:1至2:1的乙酸乙酯:甲醇。
9、 權利要求1的方法，其中第3、 6和9步中各級分的物質圖譜的 形成通過下列三個步驟進行a) 將各級分暴露於短波長(254nm)燈和長波長(365nm)紫外燈， 鑑別物質圖譜；b) 用10%硫酸處理薄層層析板，加熱以顯示著色的點，再一次鑑別 物質圖譜；以及c) 根據步驟a)和b)所鑑別的圖譜，將具有相似移動距離的物質 分組。
10、 權利要求1的方法，其中第4、 7或10步中的凝血酶時間是通 過計數加入Thrombitimer2產品的凝血酶和纖維蛋白原後直至形成纖維蛋 白原凝塊的時間測量的。
11、 權利要求1的方法，其中第5步第2次正相柱層析採用正相矽 膠(230至400目)，並且作為流動相的有機溶劑組合選自己烷和乙酸乙 酯、己垸和氯仿、己烷和丙酮、己烷和乙腈、乙酸乙酯和乙醇、或乙酸 乙酯和甲醇，其中所述溶劑的組合比例由70:1增至1:1。
12、 權利要求1的方法，其中第8步反相柱層析採用反相矽膠(63 至212口)，並且作為流動相的溶劑組合由選自乙腈、甲醇、乙醇和丙酮 的有機溶劑與水組成，其中所述溶劑的組合比例由20:1增至1:1。
13、 一種根據權利要求1至12任一項方法製備的抗血栓形成劑，其 中該抗血栓形成劑具有大於40秒的凝血酶時間。
14、 一種包含權利要求13的抗血栓形成劑的用於治療血栓形成的組 合物。
全文摘要
本文公開了一種從麝鼠香中製備抗血栓形成劑的方法，以及由該方法獲得的具有高效能的抗血栓形成劑。其中，抗血栓形成劑的製備方法包括用乙醇處理麝鼠香，獲得乙醇提取物；採用遞增的己烷和乙酸乙酯組合比例進行兩次正相柱層析，獲得多個級分；進行薄層層析，並採用紫外燈和10％硫酸鑑別各級分的物質圖譜，將具有相似移動距離的物質分組；測量每一組的凝血酶時間，分離具有高效的抗血栓形成活性的一組；採用遞增的乙腈和水組合比例進行一次反相柱層析，獲得多個級分；並且從中分離具有高效能的抗血栓形成劑物質。本發明提供了一種從麝鼠香中獲得的具有高效能的抗血栓形成劑，這增加了麝鼠香的附加價值。
文檔編號A61K35/48GK101641107SQ200780046591
公開日2010年2月3日 申請日期2007年12月17日 優先權日2006年12月16日
發明者全尚珢, 姜韓錫, 崔勇株, 李宰浩, 申澤順, 金勇均, 金根基, 金研玖 申請人:瑪斯科蘭德有限公司