一種殼聚糖季銨鹽及其應用的製作方法

2023-10-25 12:39:47 1

專利名稱：一種殼聚糖季銨鹽及其應用的製作方法
一種殼聚糖季銨鹽及其應用
技術領域：
本發明涉及醫用材料技術領域，具體地說，是關於一種殼聚糖季銨鹽及其應用。背景技術：
骨科內植物術後感染是此類手術嚴重併發症，由於大塊的金屬內植物的存在，此 類感染具有特殊性內植物周圍區域免疫力低下，致病菌很容易在內植物表面黏附繁殖形 成感染灶；甚至一些低毒力的條件致病菌也很容易引起該類疾病，如表皮葡萄球菌作為致 病菌在此類感染中的比例達32%。據統計，關節置換的感染率在0. 5-5%之間，而開放性骨 折的術後感染率更達5-33%，並且可以導致骨髓炎和敗血症。有報告稱全膝關節置換後， 感染是繼鬆動之後第二位的導致翻修的主要原因。由於接受骨科內植物手術的病人數巨大 (僅僅在美國，目前每年全髖和全膝關節成形術就超過了 50萬)，且術後感染的處理極為困 難，由此耗費的醫療資源巨大，據估計在美國內植物相關感染每年需增加10億美元的醫療 衛生支出。另外，隨著治療上長期大劑量廣譜抗生素的使用，致病菌耐藥的發生已成為常見 的現象，因此近些年人們已開始針對這種感染髮病的特殊性研發新一代的具有抗微生物性 的非抗生素類材料，如銀離子等。殼聚糖是一種可再生的來源廣泛的天然多糖，自然界含量豐富僅次於纖維素。隨 著對殼聚糖理化性質研究的不斷深入，已將其廣泛應用於食品、環保及醫療等領域。殼聚糖 在酸性環境下形成的NH3+因靜電力能與細菌細胞壁磷脂成分的磷醯基相互作用而具有抗 微生物的特性，並有許多研究報告殼聚糖對葡萄球菌、大腸桿菌及真菌等都具有一定的抗 菌作用；另外，因殼聚糖對成骨細胞具有良好的生物相容性，進來有許多研究致力於將其作 為骨組織工程支架的材料。但因其有限的抗微生物效應，在骨科內植物感染的防治領域的 應用僅僅具備一定的可能性，並已有相關的研究將其與一些抗菌性更強的材料複合後的應 用。研究發現殼聚糖季銨化以後，其抗菌性能增強。Tsurugai等發現N，N, N-三甲基 殼聚糖季銨鹽有抗大腸桿菌ATCC 25922和葡萄球菌屬ATCC149909的活性。含有N-長鏈 烷基殼聚糖的季銨鹽對芽孢子菌、大腸桿菌有抗菌作用。殼聚糖與碘代甲烷在三乙胺中反 應所得到的季銨鹽對G+有很強的抑制作用。可見抗大腸桿菌和金黃色葡萄球菌季銨化的 殼聚糖比非季銨化的殼聚糖抗菌活性強。關於殼聚糖季銨鹽化後與骨的生物相容性，目前 還未見報告。

發明內容本發明的目的是針對現有技術中的不足，提供一種殼聚糖季銨鹽。本發明的再一的目的是，提供一種殼聚糖季銨鹽的用途。為實現上述目的，本發明採取的技術方案是一種殼聚糖季銨鹽，所述的殼聚糖季銨鹽取代度為6% -44%。作為優選技術方案，所述的殼聚糖季銨鹽取代度為18%。
所述的殼聚糖季銨鹽是由殼聚糖和2，3-環氧丙基三甲基氯化銨合成的。為實現上述第二個目的，本發明採取的技術方案是殼聚糖季銨鹽在醫用材料加工中的應用。所述的殼聚糖季銨鹽可用於抗骨科內植物感染。所述的殼聚糖季銨鹽在骨科和顱面內植物的生物活性塗層中的應用。本發明利用前期殼聚糖和2，3-環氧丙基三甲基氯化銨合成三種取代度的殼聚糖 季銨鹽(HACC，6%，18%，44% )，研究其對標準菌株ATCC35984在鈦表面黏附和生物膜形成 的抑制作用，同時研究HACC的細胞毒性及對人骨髓間充質幹細胞(hMSCs)在鈦表面增殖分 化的影響。具體方法是三種殼聚糖季銨鹽分別用TSB細菌液體培養基配製溶液，用倍比稀 釋法分別測定不同取代度的HACC的最小抑菌濃度和最小殺菌濃度；用AlarmarBlue法檢 測HACC對鈦表面細菌代謝的影響；並用組織培養板法、螢光染色法及掃描電鏡觀察HACC對 鈦表面細菌形成生物膜的影響。分別用MTT法和鹼性磷酸酶染色法觀察HACC對hMSCs增 殖和分化的影響。結果=HACC對該菌的代謝增殖和形成生物膜的抑制效應隨取代度升高而 增強，且在較低的濃度就可有效地抑制鈦表面細菌生物膜的形成；另外，隨著取代度升高， 44%的HACC的細胞毒性逐漸增強且對hMSCs的增殖和分化的抑制也增強，而6%及18%的 HACC無細胞毒性且也不抑制hMSCs的增殖和分化。本發明優點在於在防止細胞黏附和生物膜形成的策略指導下，研製新一代的具 備良好生物相同性的塗層抗菌材料_殼聚糖季銨鹽，減少骨科內植物術後感染的風險並可 避免臨床抗生素濫用、抗生素耐藥菌的出現及抗生素的全身毒副作用。具體來說，選擇具有 天然價廉儲量豐富且具有良好生物相容性及一定的抗菌作用的殼聚糖為基礎，但因其有限 的抗菌效應，並不適於應用到臨床，本發明通過殼聚糖季銨化提高其抗菌性以達到抑制和 殺滅骨科內植物致病菌，防止微生物在內植物表面的大量定植，從根本上防止感染的發生。 另外，對於對骨科內植物來說，良好的骨整合對其功能的發揮也十分重要，因此本發明不僅 發明了取代度為6% -44%殼聚糖季銨鹽的抗感染效果外，還發明了其對細胞增殖和成骨 分化，以及對骨整合的影響，這樣能更全面地反映取代度為6% -44%殼聚糖季銨鹽的應用 效果。取代度為6% -44%殼聚糖季銨鹽可望作為塗層材料抗骨科內植物感染，或作為骨的 替代材料、傷口敷料等發揮作用。

附圖1 :1/1殼聚糖季銨鹽取代度的滴定檢測曲線。附圖2 不同取代度HACC對表皮葡萄球菌代謝抑制率的影響，($) (#) ( Y)分別表 示取代度為6%，18%和44% HACC在相應的濃度下對表皮葡萄球菌代謝抑制率和空白對照 組比較有顯著性增強。附圖3 =TCP法定量觀察HACC對表皮葡萄球菌生物膜形成的影響，($) (#) ( Y)分 別表示取代度為6%，18%和44% HACC在相應的濃度下對表皮葡萄球菌生物膜形成的量和 空白對照組比較有顯著性抑制。附圖4 培養24h螢光顯微鏡觀察鈦板表面細菌生物膜形成的大體情況(活菌為 綠色，死菌為紅色)，a，b，c，d 為 6% HACC, e, f，g，h 為 18% HACC, i, j, k, 1 為 44% HACC ； 濃度依次為 Oug/ml，4ug/ml，32ug/ml，256ug/ml。
附圖5 培養24h掃描電鏡觀察鈦板表面細菌生物膜形成的大體情況，a, b，c，d為 6% HACC，e，f，g，h 為 18% HACC，i，j，k，l % 44% HACC ；濃度依次為 Oug/ml, 4ug/ml, 32ug/ ml,256ug/ml。附圖6 =HACC的細胞毒性以及HACC對hMSCs增殖結果圖。附圖7 hMSCs在添加HACC的培養基中培養14d後鹼性磷酸酶(ALP)染色的結果。附圖8 hMSCs在添加HACC的培養基中培養28d後茜素紅染色的結果。附圖9 取代度為6%，18%，44%殼聚糖季銨鹽與取代度為37%，56%，81 %殼聚 糖季銨鹽的抑菌效應和生物相容性的曲線。附圖10 取代度為6%，18%，44%殼聚糖季銨鹽與殼聚糖的抑菌效應和生物相容 性的曲線。
具體實施方式
下面結合附圖對本發明提供的具體實施方式
作詳細說明。實施例1一，材料與方法(一 )實驗材料及儀器材料殼聚糖季銨鹽(HAAC，DS37. 3 %, 56. O %, 81. 5 % )由殼聚糖(Mw = 2. OX 105，脫乙醯度91. 83%，浙江玉環海洋生物化學有限公司)和2，3-環氧丙基三甲基 氯化銨(純度96%，山東三貢化工有限公司)合成，大豆蛋白胰蛋白腖培養基(Trypticase Soy Broth, TSB，英國OXOID公司)，其他試劑均為市售分析純試劑。儀器超淨工作檯，BIO-HAZARD, VCM-420,中國臺灣；電子分析天平，METTLER TOLEDO, AB204-E，瑞士；電磁攪拌器，STUART，SM24，英國；低溫離心機，UNIVERSAL, 32R, HETTICH，德國；酶聯免疫檢測儀，MULTISKAN, ASCENT, VI. 22，美國。6% HACC純化殼聚糖與2，3_環氧丙基三甲基氯化銨按(n(CS)/n(GTMAC)= 2/l(mol/mol))的比例合成；18 % HACC純化殼聚糖與2，3-環氧丙基三甲基氯化銨按 (n(CS)/n(GTMAC) = 1/1 (mol/mol))的比例合成；44% HACC純化殼聚糖與2，3-環氧丙基 三甲基氯化銨按(n(CS)/n(GTMAC) = 1/3 (mol/mol))的比例合成。合成後的取代度由殼聚 糖季銨鹽用0. lmol/L AgNO3溶液電導滴定曲線計算HACC。具體過程如下(HACC的製備依據文獻報導的殼聚糖季銨鹽合成方法並有所改 進在裝有攪拌器和回流冷凝管的150ml三頸瓶中加入4. Og純化殼聚糖、3. 6g的2，3-環 氧丙基三甲基氯化銨(n(CS)/n(GTMAC) = 1/1 (mol/mol))和60ml蒸餾水。油浴80°C，恆 速攪拌，反應36h。反應結束，產物用透析膜(截留分子量14000)透析純化，用0. lmol/L AgNO3檢測透析液至無白色沉澱時，透析完畢。將透析袋內液體旋蒸濃縮後，凍幹得到粉末 狀殼聚糖季銨鹽樣品。用同樣方法分別以η (CS) /n (GTMAC) = 2/1，1/3 (mol/mol)的投料比來製備殼聚糖 季銨鹽，以期獲得不同取代度的殼聚糖季銨鹽。見表1。HACC取代度測定準確稱取純化後的樣品，用0. lmol/L AgNO3溶液電導滴定樣品中Cl—，按下式計算 HACC的取代度。圖1為1/1殼聚糖季銨鹽樣品的電導滴定曲線，體系電導率發生轉折時消
權利要求
一種殼聚糖季銨鹽，其特徵在於，所述的殼聚糖季銨鹽取代度為6％ 44％。
2.根據權利要求1所述的殼聚糖季銨鹽，其特徵在於，所述的殼聚糖季銨鹽取代度為 18%。
3.根據權利要求1或2所述的殼聚糖季銨鹽，其特徵在於，所述的殼聚糖季銨鹽是由殼 聚糖和2，3-環氧丙基三甲基氯化銨合成的。
4.根據權利要求1或2所述的殼聚糖季銨鹽，其特徵在於，所述的殼聚糖季銨鹽在醫用 材料加工中的應用。
5.根據權利要求4所述的應用，其特徵在於，所述的殼聚糖季銨鹽可用於抗骨科內植 物感染。
6.根據權利要求4所述的應用，其特徵在於，所述的殼聚糖季銨鹽在骨科和顱面內植 物的生物活性塗層中的應用。
全文摘要
本發明涉及一種殼聚糖季銨鹽及其應用，所述的殼聚糖季銨鹽取代度為6％-44％。作為優選技術方案，所述的殼聚糖季銨鹽取代度為18％。本發明還提供了殼聚糖季銨鹽的新用途。本發明不僅發明了取代度為6％-44％殼聚糖季銨鹽的抗感染效果，還發明了其對細胞增殖和成骨分化、以及骨整合的影響，這樣更全面地反映了取代度為6％-44％殼聚糖季銨鹽的應用效果。取代度為6％-44％殼聚糖季銨鹽可望在骨科關節假體、釘板及髓內釘等各種金屬內植物表面塗層發揮其抗感染作用，另外也可以作為骨的替代材料、傷口敷料等發揮作用。
文檔編號C08B37/08GK101935364SQ200910195678
公開日2011年1月5日 申請日期2009年9月15日 優先權日2009年9月15日
發明者彭兆祥, 湯亭亭, 汪靈, 郭聖榮 申請人:上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院;上海交通大學