一種儀器部件和採用該儀器部件檢測分析物的存在的方法

2023-09-27 06:29:35 1

專利名稱：一種儀器部件和採用該儀器部件檢測分析物的存在的方法
技術領域：
本發明一般地涉及一種包括適合用於親和柱的剛性載體的儀器部件、親和柱以及包含與分析柱(例如，高壓液相色譜(HPLC)柱)流體聯通的親和柱的儀器。本發明還涉及採用該儀器部件檢測一種或多種分析物的存在的方法。
背景技術：
用於分析潛在地含有一種或多種分析物的試樣的儀器部件和方法是公知的。然而，目前樣品分析技術需要以下功效之一或多項(1)單獨或彼此組合使用、能減少樣品製備步驟或減少樣品操作步驟的儀器部件；(2)能減少樣品製備步驟和減少樣品操作步驟的方法；(3)單獨或彼此組合使用、能高度精確地分析複雜試樣中給定分析物的儀器部件，同時極少受來自以下因素的幹擾(i)複雜試樣內的非-分析物組分(即，非標的分析物的材料與儀器中使用的一種或多種配體(之間)不希望的結合)，以及(ii)標的分析物與非儀器中所用配體的反應活性部位不希望的結合；(4)單獨或彼此組合使用、能高度精確地分析複雜試樣中特異分析物(例如，具有雌激素活性的分析物)的儀器部件，同時極少受來自以下因素的幹擾(i)複雜試樣內非-分析物組分(即，非標的分析物的材料與儀器中使用的一種或多種配體不希望的結合)，以及(ii)標的分析物與非儀器中所用配體的反應活性部位不希望的結合；以及(5)與分析柱在線或流體聯通地使用親和柱的能力。
發明概述本發明涉及一種包括適用於親和柱的剛性載體的儀器部件、包含剛性載體的親和柱以及包含與分析柱(例如，高壓液相色譜(HPLC)柱)流體聯通的親和柱的儀器。該儀器部件可用於從各種各樣複雜混合物中俘獲並定量化一種或多種分析物。
在本發明的一種實施方案中，該儀器部件包含適用於親和柱的剛性載體。本發明的一種範例剛性載體包含大量無機顆粒，其中每個顆粒包含(i)無機基材；(ii)某種改性基材表面，它減少非分析物材料對無機基材的非特異結合(即，非標的分析物材料的非特異結合)和配體-特異性分析物材料對無機基材的非特異結合(即，標的分析物與由一種或多種配體提供的反應活性部位以外的其它反應活性部位的非特異結合)；以及(iii)結合在無機基材上的一種或多種配體，其中該一種或多種配體包含單克隆抗-黃麴黴毒素B1抗體、單克隆抗-黃麴黴毒素G1抗體、單克隆抗-黃麴黴毒素Q1抗體、單克隆抗-黃麴黴毒素B2抗體、單克隆抗-黃麴黴毒素G2抗體、單克隆抗-雙酚A抗體、單克隆抗-2，4-二氯苯氧基乙酸抗體、單克隆抗-2，4，5-三氯苯氧基乙酸抗體、單克隆抗-4-氯-2-甲基乙酸抗體、單克隆抗-4-(2，4-二氯苯氧基)丁酸抗體、單克隆抗-雌酮抗體、單克隆抗-17-β-雌二醇抗體、單克隆抗-17-α-乙炔基雌二醇抗體、單克隆抗-乳鐵蛋白抗體、單克隆抗-睪酮抗體、單克隆抗-去甲睪酮抗體、單克隆抗-苯基脲抗體、單克隆抗-烯菌酮抗體、單克隆抗-葉酸抗體、單克隆抗-維生素B12(氰鈷銨)抗體、單克隆抗-殺螟松抗體、單克隆抗-毒死蜱抗體、單克隆抗-嘧啶磷抗體、抗-兒茶酚胺抗體、重組人雌激素受體(hER)及其組合。在本發明範例實施方案中，無機顆粒包含無機金屬氧化物顆粒，例如，二氧化矽或矽膠顆粒。
本發明還涉及包含剛性載體材料的親和柱。在本發明範例實施方案中，該親和柱包含具有一定柱體積的柱結構；以及位於柱結構的柱體積內的剛性載體，其中剛性載體包含大量無機顆粒，其中每個顆粒包含(i)無機基材；(ii)減少非分析物材料和配體-特異性分析物材料在無機基材上的非特異結合的改性基材表面；以及(iii)一種或多種結合在無機基材上的配體，其中一種或多種配體包含單克隆抗-黃麴黴毒素B1抗體、單克隆抗-黃麴黴毒素G1抗體、單克隆抗-黃麴黴毒素Q1抗體、單克隆抗-黃麴黴毒素B2抗體、單克隆抗-黃麴黴毒素G2抗體、單克隆抗-雙酚A抗體、單克隆抗-2，4-二氯苯氧基乙酸抗體、單克隆抗-2，4，5-三氯苯氧基乙酸抗體、單克隆抗-4-氯-2-甲基乙酸抗體、單克隆抗-4-(2，4-二氯苯氧基)丁酸抗體、單克隆抗-雌酮抗體、單克隆抗-17-β-雌二醇抗體、單克隆抗-17-α-乙炔基雌二醇抗體、單克隆抗-乳鐵蛋白抗體、單克隆抗-睪酮抗體、單克隆抗-去甲睪酮抗體、單克隆抗-苯基脲抗體、單克隆抗-烯菌酮抗體、單克隆抗-葉酸抗體、單克隆抗-維生素B12(氰鈷銨)抗體、單克隆抗-殺螟松抗體、單克隆抗-毒死蜱抗體、單克隆抗-嘧啶磷抗體、抗-兒茶酚胺抗體、重組人雌激素受體(hER)及其組合。
本發明另外還涉及包含與分析柱流體聯通的親和柱的儀器，其中親和柱包含剛性載體，它(i)能耐受最高約200bar的柱壓力，和(ii)具有一種或多種結合在其上的配體，其中一種或多種配體能選擇性地結合到給定樣品溶液內的一種或多種分析物上。在一種範例實施方案中，儀器的親和柱包含本發明的剛性載體材料。
本發明還涉及製備剛性載體、免疫親和柱以及包含免疫親和柱的儀器的方法，以及採用剛性載體、免疫親和柱以及儀器檢測在給定樣品中一種或多種分析物的存在的方法。本發明方法可用於分析潛在地含有至少一種分析物的試樣。
在本發明的一種範例實施方案中，本發明涉及製造包含無機基材的剛性載體材料的方法。在一種範例方法中，該方法包括以下步驟(1)在無機基材表面的至少第一部分上固定R基團，其中R基團的反應活性小於固定步驟之前的無機基材表面上任何官能團的；(2)在無機基材表面的至少第二部分上固定一種或多種連接基，其中一種或多種連接基包含醛官能團；以及(3)在一種或多種連接基上選擇性地結合一種或多種配體。
在本發明一種範例實施方案中，本發明涉及分析潛在地含有至少一種分析物的試樣的方法。在一種範例實施方案中，分析潛在地含有至少一種分析物的試樣的該方法包括以下步驟(a)向包含剛性載體的親和柱中引入試樣，其中剛性載體包含大量無機顆粒，其中每個顆粒包含(i)無機基材；(ii)減少非分析物材料和配體-特異性分析物材料在無機基材上的非特異結合的改性基材表面；以及(iii)一種或多種結合在無機基材上的配體，其中一種或多種配體包含單克隆抗-黃麴黴毒素B1抗體、單克隆抗-黃麴黴毒素G1抗體、單克隆抗-黃麴黴毒素Q1抗體、單克隆抗-黃麴黴毒素B2抗體、單克隆抗-黃麴黴毒素G2抗體、單克隆抗-雙酚A抗體、單克隆抗-2，4-二氯苯氧基乙酸抗體、單克隆抗-2，4，5-三氯苯氧基乙酸抗體、單克隆抗-4-氯-2-甲基乙酸抗體、單克隆抗-4-(2，4-二氯苯氧基)丁酸抗體、單克隆抗-雌酮抗體、單克隆抗-17-β-雌二醇抗體、單克隆抗-17-α-乙炔基雌二醇抗體、單克隆抗-乳鐵蛋白抗體、單克隆抗-睪酮抗體、單克隆抗-去甲睪酮抗體、單克隆抗-苯基脲抗體、單克隆抗-烯菌酮抗體、單克隆抗-葉酸抗體、單克隆抗-維生素B12(氰鈷銨)抗體、單克隆抗-殺螟松抗體、單克隆抗-毒死蜱抗體、單克隆抗-嘧啶磷抗體、抗-兒茶酚胺抗體、重組人雌激素受體(hER)及其組合。
分析潛在地含有至少一種分析物的試樣的範例方法還可包括以下步驟(a)令試樣接觸剛性載體和其上的配體；(b)清洗掉剛性載體上的任何未結合到配體上的試樣組分；(c)向親和柱中引入洗脫液以便使洗脫液接觸結合在剛性載體上的配體上的一種或多種分析物；(d)令洗脫液保持與剛性載體接觸一段時間以便形成潛在地包含一種或多種分析物的洗脫樣品；以及(e)分析在分析柱上的內容物以確定一種或多種分析物在試樣中的存在。
在另一種範例實施方案中，本發明涉及一種分析潛在地含有至少一種具有雌激素活性的化合物的試樣的方法，其中該方法包括以下步驟向親和柱中引入試樣，其中親和柱包含具有結合在其上的一種或多種配體的剛性載體，其中一種或多種配體能選擇性地結合到具有雌激素活性的一種或多種化合物上。
本發明進一步涉及分析洗脫樣品的方法，其中該方法包括將洗脫樣品從親和柱轉移到分析柱的步驟，其中親和柱與分析柱流體聯通，以及分析分析柱的內容物以確定一種或多種分析物在洗脫樣品中的存在的步驟。例如，洗脫樣品可含有真菌毒素、葉酸、維生素B12(氰鈷銨)或其組合。
在一種範例實施方案中，分析洗脫樣品的方法包括分析潛在地含有至少一種真菌毒素的洗脫樣品，其中該方法包括將將洗脫樣品從親和柱轉移到分析柱的步驟，其中親和柱與分析柱流體聯通，以及分析分析柱的內容物以確定至少一種真菌毒素在洗脫樣品中的存在的步驟。
在另一種範例實施方案中，分析洗脫樣品的方法包括分析潛在地含有葉酸、維生素B12(氰鈷銨)或其組合的洗脫樣品，其中該方法包括將洗脫樣品從親和柱轉移到分析柱的步驟，其中親和柱與分析柱流體聯通，以及分析分析柱的內容物以確定葉酸、維生素B12(氰鈷銨)或二者在洗脫樣品中的存在的步驟。
本發明的這些以及其它特徵和優點在研讀了下面公開的實施方案和所附權利要求的詳細描述之後自會瞭然。
附圖簡述下面將參考附圖進一步描述本發明，附圖中

圖1畫出本發明範例儀器的示意圖；圖2畫出本發明範例親和柱；圖3畫出本發明另一種範例儀器，顯示樣品加載到樣品迴路期間流體穿過儀器的流動；圖4畫出樣品注入親和柱期間圖3的範例儀器；圖5畫出樣品被從親和柱洗脫期間圖3的範例儀器；以及圖6畫出樣品檢測期間圖3的範例儀器。
發明詳述本發明涉及一種儀器部件，包括(i)適用於親和柱的剛性載體，(ii)包含剛性載體的親和柱，(iii)包含本發明剛性載體和/或親和柱與分析柱，例如，高壓液相色譜(HPLC)柱的組合的儀器，以及(iv)包含與分析柱，例如，高壓液相色譜(HPLC)柱流體聯通的親和柱的儀器。本發明還涉及製造該儀器部件之一或多種的方法，以及使用該儀器部件之一或多種分析試樣(包括潛在地含有一種或多種分析物的複雜混合物)的方法。本發明還涉及使用儀器部件之一或多種以從各種複雜混合物中俘獲和/或定量化一種或多種分析物的方法。
本發明一種範例儀器10表示在圖1中。範例儀器10包括親和柱11、分析柱12、檢測器13、第一泵14、第二泵15、第一閥門16、第二閥門17、試樣進口20、第一緩衝液進口21、洗脫緩衝液進口22、第一廢液出口23以及親和柱廢液出口24。在本發明的一種要求的實施方案中，親和柱11和分析柱12通過偶聯器(未畫出)彼此連接以便使親和柱11與分析柱12流體聯通。這裡所使用的術語「與...流體聯通」描述本發明的一種實施方案，其中離開親和柱的洗脫樣品經過親和柱與分析柱之間的偶聯器直接流入到分析柱中。此種結構(本文也稱其為「在線組態」)消除了在親和柱與分析柱之間處理和/或存儲洗脫樣品的需要。
在本發明其它實施方案中，親和柱11和分析柱12彼此不流體聯通。在此種實施方案中，離開親和柱的洗脫樣品可被收集和/或儲存起來以備將來使用(即，用於未來向分析柱12中的引入)。此種結構在本文亦稱作「離線組態」。
如上所示，本發明範例儀器10可包含多個部件。各個部件的描述和單獨或組合使用各個部件的方法將在下面給出。
I.儀器部件本發明儀器可包含但不限於，以下部件之一或多種。
A.親和柱本發明涉及親和柱，例如，圖1所示範例親和柱11，它包含一個或多個以下部件。本文所使用的術語「親和柱」包括具有以下部件之一或多種的柱，包括諸如免疫親和柱之類的親和柱。
1.柱結構本發明親和柱包含具有要求尺寸、柱體積和結構整體性的柱結構。就典型而言，柱結構包含管式結構，在管式結構的兩端具有可拆卸端蓋。端蓋與管式結構構成防漏密封以防止物料不可心地從管式結構中流走。一種本發明範例親和柱11表示在圖2中。
如圖2所示，範例親和柱11包含管式結構110，它具有第一端111和第二端112。端蓋113和114分別在第一和第二端111和112構成防漏密封。端蓋113和114在範例親和柱11的儲存期間特別有用，這樣防止(i)範例親和柱11內物料的洩漏和/或(ii)物料在範例親和柱11內變幹。範例親和柱11還包含位於範例親和柱11柱腔32內的剛性載體材料30和第一緩衝液31(如下所述)。
管式結構110可由各種不同材料製成並具有耐受管式結構110內較高壓力的壁結構。可心的是，管式結構110具有耐受最高約6000psi(400bar)，更可心地約3000psi(200bar)～約4500psi(300bar)恆定壓力的結構整體性。適合構成管式結構110的材料包括但不限於，聚合物，例如，聚醚醚酮(PEEK)和聚丙烯；金屬如不鏽鋼；以及無機材料如玻璃。在本發明的一種要求的實施方案中，管式結構110包含聚醚醚酮(PEEK)。
管式結構110的尺寸可隨多種因素變化，包括但不限於，顆粒尺寸和幾何參數、流動速率、注入體積、要求的板數等。就典型而言，管式結構110具有圓形斷面面積、介於約2mm～約20mm的外徑和介於約1mm～約10mm的內徑，以及介於約2mm～約250mm的總長。在本發明一種要求的實施方案中，管式結構110具有圓形斷面面積，約11mm的外徑、約4.6mm的內徑和約50mm的總長。
用於管式結構110的端蓋113和114一般由PEEK製成，其尺寸與管式結構110的端部構成防漏密封。
要指出的是，雖然具有圓形斷面面積的管式結構是要求的，但具有其它斷面面積的管式結構也在本發明範圍內。適合各種不同管式結構的斷面構型包括但不限於，方形、矩形、三角形、橢圓形、五角形和六角形斷面構型。
2.剛性載體材料本發明還涉及適合用於親和柱的剛性載體材料，例如，圖2所示範例剛性載體材料30。本發明剛性載體材料包含以下部件之一或多種。
a.無機基材適用於本發明的無機基材包括作為色譜介質銷售的產品。該無機基材可採用技術上公知的方法製備。該無機基材給一種或多種加載到該無機基材表面的附加組分提供支撐。一般而言，無機基材是無機氧化物，更適合地是無機金屬氧化物、矽酸鹽或矽鋁酸鹽或受控多孔玻璃。無機金屬氧化物更可心。適合用於本發明的無機氧化物通常具有能與其它化學官能團鍵合或起反應的游離羥基基團。可心的是，無機氧化物具有約1～約10個羥基基團每平方納米固體無機氧化物。
合適的無機金屬氧化物包括但不限於，二氧化矽如色譜級二氧化矽或矽膠，氧化鋁、二氧化矽-氧化鋁、氧化鋯、鋯酸鹽、受控多孔玻璃或氧化鈦。在本發明的一種要求的實施方案中，無機金屬氧化物是二氧化矽、更可心地，色譜級二氧化矽或矽膠。磁響應無機金屬氧化物，例如，公開在WO 98/31461(在此將其公開內容全文收作參考)中的矽質氧化物-塗布的磁性顆粒，也可用於本發明。混合的無機金屬氧化物，例如，二氧化矽和氧化鋁的複合凝膠，或共沉澱物，也可使用。
固體無機金屬氧化物可具有顆粒、纖維片狀物或其組合的物理形式。可心的是，固體無機金屬氧化物處於具有基本球形的粒狀或顆粒的物理形式。不論物理形式如何，固體無機金屬氧化物通常具有最多約100μm的最長尺寸(即，長度、寬度或直徑)。當固體無機金屬氧化物包含大量具有基本球形的顆粒時，該大量顆粒可心地具有約1μm～約100μm的平均顆粒直徑。在本發明的一種要求的實施方案中，固體無機金屬氧化物包含大量具有基本球形形狀的二氧化矽或矽膠顆粒，其中大量二氧化矽或矽膠顆粒的平均顆粒直徑介於約15μm～約20μm。
各種各樣市售供應的固體無機金屬氧化物可用於本發明。合適的固體無機金屬氧化物包括但不限於，由Grace Vydac(Columbia，MD)以商品名DAVISIL市售供應的二氧化矽顆粒，例如，DAVISILXWP(超寬孔隙)二氧化矽介質，具有無規形狀，平均孔隙尺寸介於約500埃～約3000埃，可心地介於約500埃～約1500埃，或者VYDAC二氧化矽，具有近似球體的形狀並且平均孔隙尺寸為約300埃。在本發明的一種要求的實施方案中，VYDAC二氧化矽，具有近似球體形狀並且初始平均孔隙尺寸為約300埃，經改性以增加平均孔隙尺寸至約800埃以後使用。
b.改性無機基材表面對上述無機基材的表面實施處理或改性，以便在無機基材上減少非分析物材料的非特異、非選擇性結合和/或吸附(即，非標的分析物材料的非特異結合)和配體-特異性分析物材料的非特異、非選擇性結合或吸附(即，標的分析物與由一種或多種配體提供的反應活性部位以外的其它反應活性部位的非特異結合)。獲得的改性基材表面具有(i)較小的對非分析物材料(即，除標的分析物以外的材料)的親和力，由於在無機表面存在著相對惰性的R基團，以及(ii)受控數量的用於，直接或通過連接基，將一種或多種配體(如下所述)選擇性地結合到無機基材表面的反應活性部位。用於選擇性地結合到一種或多種配體上的反應活性部位的數量導致一種或多種感興趣的分析物與固定在無機基材表面上的一種或多種配體之間選擇性地受控結合。
該改性基材表面包含固定在無機表面表面的至少一部分上的相對惰性R基團。本文所使用的術語「相對惰性R基團」用於描述被固定在無機基材表面上的R基團，其中R基團的反應活性小於原來(即，未改性的)無機基材表面的。例如，當無機基材包含二氧化矽顆粒時，被固定在無機表面表面的至少一部分上的相對惰性R基團的反應活性小於存在於原來或未改性二氧化矽表面上的羥基基團的。
相對惰性R基團可利用各種各樣的技術固定在無機表面表面的至少一部分上，包括但不限於，本文所描述的技術，以及在美國專利申請序列號09/929,621，題為″SOLID COMPOSITIONS FORSELECTIVE ADSORPTION FROM COMPLEX MIXTURES″，2001-08-14提交，中描述的技術，在此將其主題全部收作參考。
在本發明的一種範例實施方案中，相對惰性R基團被固定到無機表面表面的至少一部分上，其中相對惰性R基團包含R10表面部分。合適的R10表面部分包括但不限於，-CH2OH、-CH(OH)2、-CH(OH)CH3、-CH2CH2OH、-C(OH)2CH3、-CH2CH(OH)2和-CH(OH)CH2(OH)。在本發明的一種範例實施方案中，R10表面部分包括-CH2OH、-CH(OH)CH3、-CH2CH2OH或-CH(OH)CH2(OH)。在本發明的一種要求的實施方案中，R10表面部分包括-CH2OH、-CH(OH)CH3或-CH2CH2OH，更可心地，R10表面部分包括-CH2OH。
部分R10位於無機物質的至少一個表面上。所謂「位於」指的是，R10可直接固定到初始無機物質的表面的官能團上。R10可位於存在於無機物質周邊的表面區域上，或者可位於存在於孔隙內的表面區域上，該孔隙伸入到無機物質內部並在該物質的周邊上具有(孔隙)敞口。
R10也可這樣「位於」無機物質的表面，即，通過二價部分或原子(-X-)形成通式為-X-R10的基團從而固定在無機物質表面上。在該實施方案中連接R10的二價部分或原子在該物質與反應物起反應之前不存在於初始無機物質的組合物中。該部分或原子可源於用於產生R10的反應物，例如，來源於矽烷反應物的殘餘金屬原子(例如，矽原子)。該殘餘部分或原子直接固定到無機基材上，但可心的是，通過無機基材表面上的羥基基團。此反應物中的-X-基團隨反應物之不同而不同，但可以是金屬原子也可以是其它化學部分。例如，X可由金屬原子如矽、鋁、鋯之類衍生而來。選擇的無機基材也可能確定-X-及其所聯繫的反應物的選擇。一般而言，任何含-X-的反應物都將是能與無機基材上的反應活性官能團起反應的反應物。在無機氧化物的情況下，合適的反應物通常是能與羥基基團起反應的那些。
反應化合物，例如，能在無機基材上生成R10的那些，的化學方面在技術上是公知的，例如，Smith，Organic Synthesis，John Wiley Sons，1994；March，Advanced Organic Chemistry，John Wiley Sons，Fourth Edition，1992；Larock，Comprehensive OrganicTransformations，John Wiley Sons，Second Edition，1999；Greene等，Protective Groups in Organic Synthesis，John Wiley Sons，ThirdEdition，1999；Brook，Silicon in Organic，Organometallic，和PolymerChemistry，John Wiley Sons，2000；Hermanson等，ImmobilizedAffinity Ligand Techniques，1992；Weetall，″Covalent CouplingMethods for Inorganic Support Materials″，in Methods in Enzymology，vol.XLIV，編著K.Mosbach，pp.134-148，1976；Abbott，美國專利4298500；和Arkles，美國專利5371262；在此將這些文獻中的每一篇的公開內容全部收作參考。例如，包含位於無機基材表面上的R10基團的剛性載體可由反應物或塗布劑如帶有R10前體基團的烷氧基矽烷、二烷氧基矽烷或三烷氧基矽烷來製備。例如，乙醯氧基甲基可以是羥甲基的前體基團。隨後，令塗布劑與無機物質的表面起反應，然後使前體水解以生成具有被固定的R10基團的無機物質。
改性基材表面還包含用於選擇性地結合到一種或多種配體(如下所述)上的受控數量反應活性部位。反應活性部位可直接在無機基材的表面上，或者可通過固定在無機基材表面上的連接基形成。配體可採用技術上公知的方法(例如，Hermanson等，Immobilized Affinity LigandTechniques，Academic Press，1992，以及前面有關固定R10部分所援引的其它參考文獻)直接固定在無機基材的表面。例如，配體可通過與表面官能團(即，反應活性部位)，例如，羥基，起反應而固定在初始無機氧化物上。
替代地，配體可通過固定在無機基材表面的連接基(即，替代的活性反應部位)而固定在無機基材上。連接基可以是二價化學基團，任選地是取代的。該任選取代的二價化學基團可包含n個-R-基團，其中n是-R-基團的數目，n是至少為1的整數，優選不大於30，更優選不大於15。更典型的是，二價化學基團為約1～約30個原子，優選約1～約20個原子，更優選約5～約15個原子長，從配體量到無機物質。化學基團-R-可選自-C(R1)H-、-C(R2)＝C(R3)-和-C≡C-，其中R1、R2和R3彼此獨立地是氫、烷基、取代的烷基、環烷基、取代的環烷基、鏈烯基、取代的鏈烯基、環烯基、取代的環烯基、炔基、取代的炔基、環炔基、取代的環炔基、芳基、取代的芳基、芳烷基或取代的芳烷基，所述-R-基團任選用-O-、-S-、羰基、硫羰基、-OC(O)-、-C(O)O-、-SC(O)-、-C(O)S-、-OC(S)-、-C(S)O-、-C(S)S-、-SC(S)-、-N(R4)-、-N(R4)C(O)-、-C(O)N(R4)-、-C(R5)＝N-、-N＝C(R5)-、-C(R5)＝NO-、-ON＝C(R5)-、-P-、-P(OH)O-、亞芳基、取代的亞芳基、亞環烷基、取代的亞環烷基、亞環烯基、取代的亞環烯基、二價雜環基或二價取代的雜環基替代，其中R4和R5彼此獨立地是氫、烷基、取代的烷基、環烷基；取代的環烷基、鏈烯基、取代的鏈烯基、環烯基、取代的環烯基、炔基、取代的炔基、環炔基、取代的環炔基、芳基、取代的芳基、芳烷基或取代的芳烷基。化學基團的例子是包含n個-R-基團的「烴基」，並且其中n如上所述，至少一個-R-基團是-CH2-並且(n-1)個-R-基團任選地被上面提到的R基團，例如，-O-、-S-等替代。
連接基與無機基材的反應化學在文獻中有充分描述(參見Hermanson等人，Immobilized Affinity Ligand Techniques，1992和Weetall，Methods in Enzymology，vol.XLTV，pp.134-148，1976)。關於連接基和無機基材具體的反應化學取決於使用的無機基材和連接基。同樣，連接基與配體之間的反應化學取決於所採用的連接基和配體。適宜連接基/配體偶聯化學的具體例子描述在美國專利申請09/929,621，題為″SOLID COMPOSITIONS FOR SELECTIVEADSORPTION FROM COMPLEX MIXTURES″，2001-08-14提交，在此將其主題內容全部收作參考。正如在，例如，美國專利申請序列號09/929,621中公開的，配體可通過配體和/或連接基上的氨基、巰基、羰基或羧基基團，或者活性氫原子偶聯到連接基上。
在本發明的一種範例實施方案中，一種或多種配體通過在其上具有至少一個醛官能團的連接基被偶聯到無機基材上。該醛官能團可用於結合到配體、固定在無機基材上的第一連接基，或二者。在本發明的一種要求的實施方案中，一種或多種配體通過第一和第二連接基而偶聯到無機基材上，其中第一連接基結合在無機基材上，而第二連接基則結合在第一連接基上。在本發明的一種要求的實施方案中，第一連接基包含氨基官能矽氧烷，例如，氨基丙基三甲氧基矽烷，而第二連接基包含二醛，例如，戊二醛。在這一實施方案中，游離醛部分被用於將配體結合到無機基材上。本發明這一範例實施方案描述在下面的實施例1中。
在製造具有改性基材表面的本發明剛性載體中，其中剛性載體包含連接基團，形成連接基團以及將R10基團加到無機物質上的順序可以變化。R10基團可以在連接基固定上以後在無機表面上生成，或者R10可在無機基材與連接基起反應之前生成。替代地，可先生成和/或固定R10或者連接基或二者的前體，然後，再由前體起反應生成最終R10和/或連接基。
連接基在改性無機表面上的濃度可以變化。在本發明的某些實施方案中，配體包含大蛋白分子，它可「遮蓋」剛性載體表面面積的大區域。結果，連接基部位在剛性載體表面上的濃度就不需要比較高。該濃度可根據所考慮的配體/分析物絡合物的尺寸來優化。確定R10和配體濃度的因素包括但不限於，R10基團和配體的本性、無機物質上的反應活性部位濃度、連接基基團的濃度，以及分析物的本性。
一般而言，R10的濃度可介於約1～約10個基團每平方納米(nm2)剛性載體表面面積，基於按BET測定的表面面積。在某些實施方案中，配體濃度主要取決於使用該組合物時要回收的分析物。如上面所指出，配體濃度也可取決於任何任選使用的連接基的濃度。然而，一般地，配體濃度可介於0.04～約4個基團每平方納米。另外，給定的配體不總是按照1∶1的化學式量比固定在連接基上。在某些實施方案中，例如，當配體是由大蛋白分子製備時，配體可由幾個連接基基團固定。在採用較小配體的其它實施方案中，採用數量少於化學式量的配體，同時將任何未反應的連接基基團「封堵」起來以避免當採用本發明分離時起幹擾作用。
R10和配體或任選連接基的數量也可用在初始無機物質上有多少官能團與(i)R10基團和(ii)配體和/或任選連接基起反應或用其覆蓋來表示。例如，在無機基材上，約50％～約99％的反應活性部位，例如，表面羥基基團，可覆蓋以R10表面部分，同時約50％～約1％的反應活性部位可覆蓋以配體和/或任選連接基。
在本發明的某些實施方案中，在無機基材表面，約70％～約95％反應活性部位覆蓋以R10表面部分，同時約30％～約5％反應活性部位覆蓋以配體和/或任選連接基。
c.配體本發明剛性載體材料還包含一種或多種結合在上面描述的無機基材上的配體。該一種或多種配體可直接固定在無機基材上的反應活性部位上，或者任選地通過固定在無機基材上的連接基，正如上面所描述的。該配體可以是任何分子或分子片段，只要能結合到另一部分或分子-基分析物上，例如，通過疏水相互作用、共價鍵合或庫侖相互作用的結合。此類配體乃是分離工業技術人員熟知的。生物分離工業中使用的典型配體包括但不限於，生物素、抗生物素蛋白、鏈黴抗生物素蛋白、天然和非天然蛋白、肽、抗原和核酸。在本發明中，配體優選是受體或抗體。
適合用於本發明的配體包括任何配體，只要選擇性地結合在給定分析物上。適合用於本發明的配體的非限制性例子包括但不限於，單克隆抗-黃麴黴毒素B1抗體、單克隆抗-黃麴黴毒素G1抗體、單克隆抗-黃麴黴毒素Q1抗體、單克隆抗-黃麴黴毒素B2抗體、單克隆抗-黃麴黴毒素G2抗體、單克隆抗-雙酚A抗體、單克隆抗-2，4-二氯苯氧基乙酸抗體、單克隆抗-2，4，5-三氯苯氧基乙酸抗體、單克隆抗-4-氯-2-甲基乙酸抗體、單克隆抗-4-(2，4-二氯苯氧基)丁酸抗體、單克隆抗-雌酮抗體、單克隆抗-17-β-雌二醇抗體、單克隆抗-17-α-乙炔基雌二醇抗體、單克隆抗-乳鐵蛋白抗體、單克隆抗-睪酮抗體、單克隆抗-去甲睪酮抗體、單克隆抗-苯基脲除莠劑抗體(例如，溴谷隆、醚磺隆、醚苯磺隆和/或氟磺隆的單克隆抗體)、單克隆抗-烯菌酮抗體、單克隆抗-葉酸抗體、單克隆抗-維生素B12(氰鈷銨)抗體、單克隆抗-有機磷殺蟲劑抗體(例如，殺螟松、毒死蜱和/或嘧啶磷的單克隆抗體)、抗-兒茶酚胺抗體(例如，腎上腺素、去腎上腺素和/或多巴胺的單克隆抗體)、重組人雌激素受體(hER)及其組合。
如下表1所示，各種各樣配體可用於俘獲給定的分析物。
表1.要檢測的範例配體和分析物


上面的範例配體可從許多來源購得。合適的市售供應用於本發明的配體包括但不限於下表2中所示配體。
表2.範例市售供應的配體


在本發明的一種要求的實施方案中，配體包含能從複雜混合物中選擇性地結合真菌毒素的抗體。在這一實施方案中，配體可心地包含單克隆抗-黃麴黴毒素B1抗體、單克隆抗-黃麴黴毒素G1抗體、單克隆抗-黃麴黴毒素Q1抗體、單克隆抗-黃麴黴毒素B2抗體、單克隆抗-黃麴黴毒素G2抗體，或其組合。另外，在這一實施方案中，複雜混合物可包括但不限於，堅果或堅果產品、穀類、乾果、草本植物、香料、咖啡、可可、椰子、動物飼料、植物油、啤酒、水、生物學流體等。
在本發明另一要求的實施方案中，配體包含能從複雜混合物中選擇性地結合葉酸、維生素B12(氰鈷銨)或二者的抗體。在這一實施方案中，配體可心地包含單克隆抗-葉酸抗體、單克隆抗-維生素B12(氰鈷銨)抗體，或其組合。另外，在這一實施方案中，複雜混合物可包括但不限於，食物樣品(例如，嬰兒配方物、寵物飼料、運動飲料和維生素片劑)、生物學樣品(例如，動物組織、生物學樣品等)。
在本發明又一種實施方案中，配體包含天然雌激素受體、重組雌激素受體或其任何衍生物，重組蛋白和/或任何其它模仿能從複雜混合物中選擇性地結合一種或多種內分泌幹擾劑的受體生物活性部分的配體。術語「內分泌幹擾劑」用來指一類被懷疑幹擾人類和野生生物的內分泌系統的化合物。「內分泌幹擾劑」(亦稱作「外源雌激素」)幹擾荷爾蒙平衡並在人和動物及其後代體內具有不利效應。公知的範例內分泌幹擾劑包括但不限於，雙酚A、雌酮、17-α-雌二醇、17-β-雌二醇、17-α-乙炔基雌二醇、烷基酚、二乙基己烯雌酚、甲氧滴滴涕、玉米赤黴烯酮、染料木黃酮、o，p′-DDT、p，p′-DDT和鄰苯二甲酸丁基苄基酯。然而，有許多據信是未知的內分泌幹擾劑，潛在地幹擾人類和野生生物的正常內分泌系統的機能。因此，本發明這一實施方案可能對於識別複雜混合物中一種或多種已知或未知內分泌幹擾劑是有用的。在這一實施方案中，複雜混合物可包括但不限於，人和牛生物學流體(例如，血清和尿)、自來水、地下水、工藝水、環境樣品(像一般地，土地、汙泥、地表水，以及特殊地，包含可能的藥物汙染物的地表水)、工業化學製劑、由於化學品從包裝材料洩漏而汙染的食品，以及包裝材料。
在這一實施方案中，配體可心地包含雌激素受體。該雌激素受體配體從複雜混合物中提取具有雌激素活性的化合物，而同時對於混合物中不具有雌激素活性的化合物又基本上沒有親和性。本文所使用的術語「具有雌激素活性的化合物」指的是被定義為內分泌幹擾劑的化合物(例如，幹擾負責維持體內穩態和調節生長過程的體內天然荷爾蒙的生產、釋放、運輸、代謝、結合、作用和消除的外源試劑(Kavlock等，″Research needs for the risk assessment of health and environmentaleffects of endocrine disruptorsA report of the U.S.EPA-sponsoredworkshop.″Environ.Health Perspect.104 Suppl 4715-740(1996))並且描述於Endocrine Disruptor Knowledge Base(EDKB)，可從以下FDA公眾網站獲得http://edkb.fda.gov。適用於本發明使用的雌激素受體配體包括天然人雌激素受體、重組人雌激素受體(hER)或其衍生物、模擬雌激素受體的生物活性部分的重組蛋白或其衍生物，或任何選擇性識別對其生物學活性而言為內分泌幹擾劑的化合物的配體。可心的是，雌激素受體配體包含重組人雌激素受體(hER)。
在本發明的另一種要求的實施方案中，配體包含能從複雜混合物中選擇性地結合一種或多種類固醇激素的抗體。類固醇激素包括但不限於，雌二醇、雌酮、乙炔基雌二醇、睪酮和去甲睪酮。在這一實施方案中，複雜混合物可包括但不限於，自來水、地下水、工藝水、環境樣品(像一般地，土地、汙泥、地表水，以及特殊地，包含可能的藥物汙染物的地表水)、藥物製劑、人和動物生物學流體(例如，血清和尿)，以及其它生物學樣品(例如，動物組織、生物學樣品等)。
本發明親和柱可心地具有儘可能小的分析物俘獲能力。給定親和柱要求的分析物俘獲能力可隨多種因素變化，包括但不限於，分析物的含量和類型、現有試樣大小、測定裝置的靈敏度和檢測極限等。就典型而言，本發明親和柱能俘獲最高約500皮可摩爾(pMol)給定分析物。可心的是，親和柱能俘獲約50pMol～約1000pMol給定分析物。
3.緩衝液本發明親和柱還可包含緩衝液，例如，圖2所示範例第一緩衝液31。合適的第一緩衝液給親和柱內的剛性載體材料提供貯存和/或使用親和柱期間的非反應性保護介質。適合用於本發明的第一緩衝液包括但不限於，磷酸鹽緩衝的鹽水(PBS)緩衝液，或含有約0.02wt％疊氮化鈉的PBS緩衝液。具體第一緩衝液包括但不限於，0.01M磷酸鹽+0.15M NaCl緩衝液，pH值為約7.0。
典型地，第一緩衝液的pH值為約6.0-約8.0。可心地是，第一緩衝液的pH值為約6.8-約7.4。更可心的是，pH值為約7.0-約7.4，還更可心的是pH值為約7.0。
可心的是，第一緩衝液在裝有如上所述剛性載體材料的親和柱貯存期間包含含有約0.02wt％疊氮化鈉的PBS緩衝液。親和柱可心地貯存在約+4℃～約+8℃的PBS緩衝液中。另外，第一緩衝液可心地在裝有剛性載體材料的親和柱使用期間包含pH值為約7.0的PBS緩衝液。
B.分析柱本發明儀器還可包含一種或多種分析柱，如圖1所示範例分析柱12。每個分析柱可用於俘獲存在於洗脫樣品中的一種或多種分析物。任何市售供應的分析柱皆可與任何上面描述的儀器部件組合用於本發明。
合適的市售供應的分析柱包括但不限於，由Grace GmbH Co.KG(Worms，德國)以商品名GENESIS和DENALITM售的分析柱，例如，GENESIS C8 e/c，具有各種不同尺寸，包括5μm，4.6×250mm；和5μm，4.6×150mm；GENESISC18，具有各種不同尺寸，包括4μm，4.6×250mm；和DENALITMC18，具有各種不同尺寸，包括5μm，4.6×150mm；由Grom Analytik+HPLC公司(Rottenburg-Hailfingen，德國)以商品名GROM-SiL銷售的分析柱，例如，GROM-SiL ODS型柱，具有各種不同尺寸，包括5μm，4.6×150mm；和由Amersham Biosciences(Uppsala，瑞典)以商品名Mono S銷售的陽離子交換柱，例如，Mono S hr5/5，具有各種不同尺寸，包括10μm，1mL。
在本發明的一種要求的實施方案中，分析柱連接到親和柱上，從而使親和柱與分析柱流體聯通。在這一實施方案中，可心的是，由材料製成分析柱的管式結構並具有足以耐受較高管式結構內壓力(即，最高約6000psi(400bar)，更可心的是約3000psi(200bar)～約4500psi(300bar))的壁結構。合適的管式結構材料包括上面描述的用於形成本發明親和柱的管式結構的材料。
就典型而言，該分析柱構成液相色譜裝置如高壓液相色譜(HPLC)裝置的一部分。適合本發明使用的液相色譜設備包括但不限於以下市售供應的液相色譜設備，例如Shimadzu(Columbia，MD)，AgilentTechnologies(Wilmington，DE)，Applied Biosystems(Fostercity，CA)，Dionex Corporation(Sunnyvale，CA)，Varian Inc.(Palo Alto，CA)，和Waters Inc.(Milford，MA)。
C.檢測器本發明儀器還可包含一種或多種檢測器，例如，在圖1中所示範例檢測器13。檢測器可用於檢測和定量化移動相樣品中分析物的存在。任何市售供應的檢測器皆可在本發明中與任何上面描述的儀器部件組合使用。
合適的市售供應的檢測器包括但不限於，由Shimadzu Inc.(Columbia，MD)銷售的紫外-可見光檢測器，例如，系列SPD10 UV/Vis檢測器，或者其它類型檢測器，例如但不限於，螢光檢測器、折光指數檢測器、物質-選擇性檢測器和電化學檢測器，這些都有市售供應，例如但不限於由以下公司獲得Agilent Technologies(Wilmington，DE)，Applied Biosystems(Fostercity，CA)，Dionex Corporation(Sunnyvale，CA)，Varian Inc.(Palo Alto，CA)，和Waters Inc.(Milford，MA)。可心的是，該檢測器包含操作在約230nm～約400nm波長的紫外-可見光檢測器。例如，以下範例波長可用於本發明紫外-可見光，在230nm；紫外-可見光，在240nm(烯菌酮)；和紫外-可見光，在361nm(維生素B12)。
D.偶聯器本發明儀器還可包含親和柱與一個或多個分析柱之間的偶聯器。任何傳統上用於色譜法中的偶聯材料皆可用於本發明。就典型而言，該偶聯器包含由塑料、金屬或玻璃管構成的低死體積連接。在親和柱與分析柱流體聯通的本發明實施方案中，偶聯器由各種材料製成並且壁結構應足以耐受在偶聯器內的相對高壓(即，最高約6000psi(400bar)，更可心地，約3000psi(200bar)～約4500psi(300bar))。
E.泵本發明儀器還可包含一種或多種泵，例如，在圖1中表示的範例第一泵14和第二泵15。每臺泵提供穿過上面描述的儀器部件的流體流動。任何市售供應的泵皆可在本發明中與任何上面描述的儀器部件組合使用。
合適的市售供應的泵包括但不限於可獲自以下的泵Shimadzu(Columbia，MD)，Agilent Technologies(Wilmington，DE)，Applied Biosystems(Fostercity，CA)，Dionex Corporation(Sunnyvale，CA)，Varian Inc.(Palo Alto，CA)，和Waters Inc.(Milford，MA)。
可心的是，泵包含由Agilent Technologies(Wilmington，DE)以商品名1100系列銷售的具有至少3通路的可編程低或高壓力梯度泵，例如，四級(quaternary)1100型泵。
在本發明的一種要求的實施方案中，第一泵用於提供第一緩衝液和試樣穿過親和柱的流體流動，而第二泵則用於提供洗脫緩衝液和洗脫樣品穿過分析柱的流體流動。
F.閥本發明儀器還可包含一種或多種閥，例如，在圖1中所示範例第一閥16和第二閥17。每個閥各自控制流體穿過上面描述的儀器部件的流動。任何市售供應的閥皆可在本發明中與任何上面描述的儀器部件組合使用。
合適的市售供應閥包括但不限於，由VICI Valco Instruments Co.，Inc.(Houston，TX)或VWR International Ltd.(Dorset，UK)銷售的閥。可心的是，閥包含可編程2-位置6-路閥(這裡稱作可編程6-路閥)，由VWR International Ltd.(Dorset，UK)以商品名RHEODYNE銷售，例如，型號7725樣品注入器。
在本發明的一種要求的實施方案中，採用第一可編程6-路閥控制第一緩衝液和/或試樣穿過親和柱的流體流動，並用第二可編程6-路閥控制洗脫緩衝液和洗脫樣品穿過分析柱的流體流動。
II.製造儀器部件的方法本發明還涉及製造上面描述的儀器部件的方法。剛性載體材料可，例如，按照上面的描述和下面的實施例製造。大致地，製造本發明剛性載體材料的方法包括以下步驟(1)對無機基材外表面實施改性以便減少非分析物材料在無機基材上的非特異、非選擇性結合和/或吸附；和(2)令一種或多種配體選擇性地結合到無機基材表面。
如上所述，無機基材表面的改性步驟包括(i)令相對惰性的R基團固定到無機基材表面的至少一部分上，並任選地(ii)固定一種或多種連接基到無機基材表面的至少一部分上。固定相對惰性的R基團到無機基材表面的至少一部分上的步驟可發生在固定一種或多種連接基到無機基材表面的至少一部分上這一任選步驟之前或以後。令一種或多種配體選擇性地結合到無機基材表面的步驟可包括(i)令受控數量的一種或多種配體直接結合到無機基材表面的反應活性部位上，或者(ii)令受控數量的一種或多種配體結合到從無機基材表面伸出的一種或多種連接基上。當受控數量的一種或多種配體直接結合到無機基材表面的反應活性部位上時，該一種或多種配體選擇性地結合到無機基材表面的步驟可發生在將相對惰性的R基團固定到無機基材表面的至少一部分上這一步驟之前或以後。
在本發明的一種要求的實施方案中，製造剛性載體材料的方法包括以下步驟(1)令R基團固定到無機基材表面的至少第一部分上，其中R基團的反應活性小於固定步驟之前的無機基材表面上任何官能團的；(2)令一種或多種連接基固定到無機基材表面的至少第二部分上；以及(3)令一種或多種配體選擇性地結合到一種或多種連接基上。
步驟(1)和(2)可按照任何順序實施。可心的是，一種或多種連接基包含氨基取代的矽氧烷與二醛的組合。更可心的是，一種或多種連接基包含氨基丙基三甲氧基矽烷與戊二醛的組合。
本發明親和柱可採用以下步驟製備(1)密封管式結構的第一端；(2)以剛性載體材料，例如，上面描述的剛性載體材料中的任何一種，至少部分地充填管式結構的柱腔；(3)以第一緩衝液至少部分地填充管式結構的柱腔以包封剛性載體材料；並且，任選地，(4)密封管式結構的另一端(即，第二端)。可貯存親和柱以備將來使用，或者可隨後將其連接到包含上面描述的儀器部件之一或全部的儀器上。
III.分析樣品的方法本發明進一步涉及分析潛在地包含一種或多種感興趣的分析物的試樣的方法。在本發明的一種範例實施方案中，該方法包括以下步驟(a)將試樣引入到包含剛性載體的親和柱中，其中剛性載體包含大量無機金屬氧化物顆粒，其中每個顆粒包含(i)金屬氧化物基材；(ii)改性基材表面，該表面減少，在無機基材上，非分析物材料的非特異性結合(即，非標的分析物材料的非特異結合)和配體-特異性分析物材料的非特異性結合(即，標的分析物與由一種或多種配體提供的反應活性部位以外的其它反應活性部位的非特異性結合)；以及(iii)結合在無機基材上的一種或多種配體。
本發明分析試樣的方法可採用各種不同配體，包括但不限於，單克隆抗-黃麴黴毒素B1抗體、單克隆抗-黃麴黴毒素G1抗體、單克隆抗-黃麴黴毒素Q1抗體、單克隆抗-黃麴黴毒素B2抗體、單克隆抗-黃麴黴毒素G2抗體、單克隆抗-雙酚A抗體、單克隆抗-2，4-二氯苯氧基乙酸抗體、單克隆抗-2，4，5-三氯苯氧基乙酸抗體、單克隆抗-4-氯-2-甲基乙酸抗體、單克隆抗-4-(2，4-二氯苯氧基)丁酸抗體、單克隆抗-雌酮抗體、單克隆抗-17-β-雌二醇抗體、單克隆抗-17-α-乙炔基雌二醇抗體、單克隆抗-乳鐵蛋白抗體、單克隆抗-睪酮抗體、單克隆抗-去甲睪酮抗體、單克隆抗-苯基脲抗體、單克隆抗-烯菌酮抗體、單克隆抗-葉酸抗體、單克隆抗-維生素B12(氰鈷銨)抗體、單克隆抗-殺螟松抗體、單克隆抗-毒死蜱抗體、單克隆抗-嘧啶磷抗體、抗-兒茶酚胺抗體、重組人雌激素受體(hER)及其組合。
該分析試樣的方法還可包括以下步驟(b)令試樣接觸剛性載體和其上的配體；(c)清洗掉剛性載體上的任何未結合到配體上的試樣組分；(d)向親和柱中引入洗脫液以便使洗脫液接觸結合在剛性載體上的配體上的一種或多種分析物；(e)令洗脫液保持與剛性載體接觸一段時間以便形成潛在地包含一種或多種分析物的洗脫樣品；以及(f)分析分析柱的內容物以確定一種或多種分析物在試樣中的存在。
圖3～6畫出在採用一種或多種上面描述的儀器部件分析試樣的範例方法中的各個步驟。如圖3～6所示，範例儀器40包含親和柱41、分析柱42、檢測器43、第一泵44、第二泵45、第一閥46、第二閥47、試樣迴路48、試樣進口50、第一緩衝液進口51、洗脫緩衝液進口52、第一廢液出口53和親和柱廢液出口54。在本發明這一實施方案中，親和柱41和分析柱42彼此流體聯通。另外，試樣迴路48被用來在試樣與流經親和柱41的第一緩衝液合併前暫時儲存試樣。
圖3畫出試樣加載步驟期間的範例儀器40。試樣被加載到試樣進口50中。如圖3所示，在此步驟期間，可編程6-路第一閥46處於「位置A」，而可編程6-路第二閥47處於「位置B」，這允許(i)試樣從試樣進口50流到試樣迴路48中，以及(ii)第一緩衝液流過親和柱41。可能的試樣可包含上面提到的複雜混合物中的分析物中的任何一種。可用於範例儀器40中的合適的第一緩衝液包括上面描述的第一緩衝液中的任何一種。
在單獨的步驟中，試樣如圖4所示流過親和柱41。在此步驟期間，可編程6-路第一閥46處於「位置B」而可編程6-路第二閥47處於「位置A」，這允許(i)試樣與第一緩衝液從試樣迴路48流到並穿過親和柱41，(ii)流體從試樣進口50流到第一廢液出口53，以及(iii)洗脫緩衝液從洗脫緩衝液進口52流過分析柱42，而不流過親和柱41。
在此步驟期間，可以使用各種不同洗脫緩衝液。合適的洗脫緩衝液隨著洗脫緩衝液穿過親和柱41流動而有效地釋放結合在剛性載體材料上的分析物。適合用於本發明的洗脫緩衝液包括但不限於，0.1M甘氨酸，pH2.5，5M NaCl，10mM磷酸鹽，pH7.2，3.5M MgCl2，10mM磷酸鹽，pH7.2，2～8M脲，2M鹽酸胍，3～5M硫氰酸鹽，10％二烷，50％乙二醇，含乙腈的水溶液，及其組合。具體洗脫緩衝液包括但不限於，35％(v/v)乙腈/65％(v/v)水洗脫緩衝液(例如，用於雙酚A、17-α-雌二醇、17α-乙炔基雌二醇、睪酮和去甲睪酮)；10％(v/v)乙腈/90％(v/v)水洗脫緩衝液(例如，用於氯苯氧基乙酸除莠劑)；0.01MHCl+0.15M NaCl緩衝液(例如，用於乳鐵蛋白和維生素B12)；以及10％(v/v)甲醇在0.01M HCl+0.15M NaCl中的洗脫緩衝液(例如，用於烯菌酮)。
在圖5中所示另一單獨的步驟中，洗脫緩衝液流過親和柱41和分析柱42。在此步驟期間，可編程6-路第一閥46處於「位置B」，而可編程6-路第二閥47處於「位置B」，這允許(i)流體從第一緩衝液進口51流到親和柱廢液出口54，(ii)流體從試樣進口50流到第一廢液出口53，以及(iii)洗脫緩衝液從洗脫緩衝液進口52流經親和柱41，然後直接到分析柱42中。
在圖6所示的另一種分開的步驟中，移動相溶液流經分析柱42。在此步驟期間，可編程6-路第一閥46處於「位置B」，而可編程6-路第二閥47處於「位置A」，這允許(i)流體從第一緩衝液進口51經過親和柱41流到親和柱廢液出口54，(ii)流體從試樣進口50流到第一廢液出口53，以及(iii)移動相溶液從洗脫緩衝液進口52經分析柱42到流檢測器43。
各種不同移動相溶液可用於本發明。合適的移動相溶液隨著移動相溶液穿過分析柱42流過而有效地釋放被結合在分析柱42內的載體結構上的分析物。適合用於本發明的移動相溶液包括但不限於，含甲醇或乙腈的水溶液、鹽酸溶液、甲醇/鹽酸溶液、磷酸鹽/氯化鈉溶液、乙酸鈉溶液、甲醇/乙酸鈉溶液、乙腈/鹽酸溶液和甲醇/鹽酸/氯化鈉溶液，及其組合。
適合用於本發明的具體移動相溶液包括但不限於，45％(v/v)乙腈/55％(v/v)水移動相溶液(例如，用於雙酚A分析物)；0.01M HCl移動相溶液(例如，用於氯苯氧基乙酸除莠劑分析物)；60％(v/v)甲醇在0.01M HCl中的移動相溶液(例如，用於氯苯氧基乙酸除莠劑分析物)；70％(v/v)乙腈/30％(v/v)水(例如，用於17-α-雌二醇，17-α-乙炔基雌二醇、睪酮和去甲睪酮)；0.10M磷酸鹽+1.5M NaCl(pH7.0)移動相溶液(例如，用於乳鐵蛋白)；50mM乙酸鈉(pH6.0)移動相溶液(例如，用於苯基脲除莠劑)；55％(v/v)甲醇在50mM乙酸鈉(pH6.0)中的移動相溶液(例如，用於苯基脲除莠劑)；64％(v/v)乙腈在0.01M HCl中的移動相溶液(例如，用於烯菌酮)；以及30％(v/v)甲醇/70％(v/v)0.01M HCl+0.15M NaCl移動相溶液(例如，用於維生素B12)。
在本發明的一種要求的實施方案中，分析樣品的方法包括分析洗脫樣品的方法，其中該方法包括將洗脫樣品從親和柱轉移到分析柱的步驟，其中親和柱與分析柱流體聯通，以及分析分析柱的內容物以確定一種或多種分析物在洗脫樣品中的存在的步驟。例如，該分析洗脫樣品的方法可用於分析潛在地包含一種或多種選自以下分析物的樣品黃麴黴毒素B1、黃麴黴毒素g1、黃麴黴毒素Q1、黃麴黴毒素B2、黃麴黴毒素G2、雙酚A、2，4-二氯苯氧基乙酸、2，4，5-三氯苯氧基乙酸、4-氯-2-甲基乙酸、4-(2，4-二氯苯氧基)丁酸、雌酮、17-β-雌二醇、17-α-乙炔基雌二醇、乳鐵蛋白、睪酮、去甲睪酮、溴谷隆、醚磺隆、醚苯磺隆、氟磺隆、烯菌酮、葉酸、維生素B12(氰鈷銨)、殺螟松、毒死蜱、嘧啶磷、腎上腺素、去腎上腺素、多巴胺，一種內分泌幹擾劑(例如，具有雌激素活性的化合物)，及其組合。
在這一實施方案中，在分析洗脫樣品的方法中，親和柱與分析柱流體聯通，該方法還可包括下列步驟之一或多步(1)向裝有能耐受最高約200bar柱壓力的剛性載體的親和柱中引入試樣，其中剛性載體上具有結合在其上的一種或多種配體，其中一種或多種配體能選擇性地結合一種或多種分析物；(2)令試樣與剛性載體和其上的配體接觸；(3)清洗掉剛性載體上除一種或多種分析物以外的任何試樣組分；(4)將洗脫液引入到親和柱中，以便使洗脫液接觸結合在剛性載體上的配體上的一種或多種分析物；以及(5)令洗脫液保持與剛性載體接觸一段時間以便形成洗脫樣品。就典型而言，洗脫液與剛性載體維持接觸介於約5min～約15min的時間。
在分析洗脫樣品的一種範例方法中，該方法包括分析潛在地包含真菌毒素的洗脫樣品的方法。在這一範例實施方案中，該方法包含將洗脫樣品從親和柱轉移到分析柱的步驟，其中親和柱與分析柱流體聯通，以及分析分析柱的內容物以確定至少一種真菌毒素在洗脫樣品中的存在的步驟。洗脫樣品可接受分析以確定黃麴黴毒素B1、黃麴黴毒素g1、黃麴黴毒素Q1、黃麴黴毒素B2、黃麴黴毒素G2或其組合的存在。
在分析洗脫樣品的另一種範例方法中，該方法包括分析潛在地包含葉酸、維生素B12(氰鈷銨)或其組合的方法，其中該方法包含將洗脫樣品從親和柱轉移到分析柱的步驟，其中親和柱與分析柱流體聯通，以及分析分析柱的內容物以確定葉酸、維生素B12(氰鈷銨)或二者在洗脫樣品中的存在的步驟。
本發明還涉及分析試樣的方法，其中試樣潛在地包含至少一種具有雌激素活性的化合物。在這一實施方案中，該方法包含將試樣引入到裝有其上結合了一種或多種配體的剛性載體的親和柱中，其中一種或多種配體能選擇性地結合一種或多種具有雌激素活性的化合物，例如天然人雌激素受體、重組人雌激素受體(hER)或其衍生物、模擬雌激素受體的生物學活性部分的重組蛋白或其衍生物，或任何選擇性識別對其生物學活性而言為內分泌幹擾劑的化合物的配體。在一種要求的實施方案中，一種或多種配體包含重組人雌激素受體(hER)。
分析潛在地包含至少一種具有雌激素活性的化合物的試樣的範例方法還可包括以下步驟之一或多步(1)令試樣接觸剛性載體和其上的配體；(2)清洗掉剛性載體上不表現出雌激素活性的任何試樣組分；(3)將洗脫液引入到親和柱中，以便使洗脫液接觸結合在剛性載體上的配體上的一種或多種具有雌激素活性的化合物；(4)令洗脫液保持與剛性載體接觸一段時間以便形成含具有雌激素活性的化合物的洗脫樣品；以及(5)分析分析柱的內容物以確定一種或多種具有雌激素活性的化合物在洗脫樣品中的存在。
在這一實施方案的一種要求的變體中，剛性載體能耐受最高約200bar的柱壓，並且親和柱與分析柱流體聯通。
本發明親和柱可反覆使用。因此，上述範例方法中任何一種可進一步包括以下步驟之一或多步(1)以第一緩衝液衝洗親和柱；以及(2)向親和柱中引入第二試樣。
本發明已在上面做了描述並將在下面以實施例的方式做進一步說明，但這些實施例從任何意義上都不應被視為構成對本發明範圍的限制。相反，應當清楚地理解，可以訴諸各種各樣其它實施方案、修改及其等價物，本領域技術人員在研讀了這裡的描述以後自然明了，所有這些都不偏離本發明精神和/或所附權利要求的範圍。
實施例1包含單克隆抗-維生素B12抗體的剛性載體的製備一種範例剛性載體按如下所述製備。500g甲苯和1.52g 3-氨基丙基三乙氧基矽烷的溶液加入到1000mL圓底燒瓶中。100g預先在200℃烘烤過2h的具有800埃擴大的平均孔隙尺寸(平均顆粒尺寸介於約15～約20μ)的Grace Vydac二氧化矽被加入到圓底燒瓶中。將圓底燒瓶置於加熱罩內並安裝冷凝器。將加熱罩固定在軌道搖動器頂部，後者將操作在115rpm速度下。在整個反應期間將N2通過圓底燒瓶和冷凝器以帶走空氣。
圓底燒瓶的物料在沸騰(～110℃)下加熱4h。樣品經過濾並以2×100mL甲苯洗滌，在115℃乾燥，隨後在150℃烘烤2h。所獲得的樣品被貼上中間體A的標籤。
-C3H6NH2基團在二氧化矽上的濃度是0.54，根據二氧化矽載體的表面面積(BET)(43m2/g)，中間體的碳含量(LECO)(0.41％)計算。參見ASTM D5373(關於煤的)和ASTM 5291。
400mL 1M NaCl與中間體A在燒杯內進行混合併以磁攪拌子攪拌。初始pH值是4.79。滴加1M HCl直至pH達到2.0。將pH在2.0維持15min。隨後，樣品進行過濾並以5×100mL去離子水洗滌，在115℃乾燥，隨後在200℃烘烤2h。該樣品被貼上中間體B的標籤。
400g甲苯和48.78g乙醯氧基甲基三乙氧基矽烷與中間體B在圓底燒瓶中進行混合。將圓底燒瓶放在安裝了冷凝器的加熱罩內。將加熱罩固定在操作在115rpm速度下的軌道搖動器頂部。在整個反應期間將N2通過圓底燒瓶和冷凝器以帶走空氣。樣品在沸騰(～110℃)下加熱24h，過濾並以3×100mL甲苯洗滌，在115℃乾燥，隨後在150℃烘烤2h。該樣品被貼上中間體C的標籤。
在下一個反應步驟中，20g中間體C被加入到80mL 0.1M鹽酸中並沸騰4h。濾出二氧化矽並以60mL去離子水洗滌4次。該樣品被貼上中間體D的標籤。
20g中間體D和300mL偶聯緩衝液(0.1M Na2PO4+0.15M NaCl；pH＝7.0)在1000mL燒杯內進行混合併攪拌5min。樣品進行過濾從而得到溼濾餅。隨後，在燒杯中加入57.53g 50wt％戊二醛和2.89gNaCNBH3，隨後加入中間體D的溼濾餅。樣品攪拌4h，過濾，以400mL偶聯緩衝液洗滌並在400mL偶聯緩衝液內再調漿從而獲得新樣品，後者經過濾，以200mL偶聯緩衝液洗滌並在200mL偶聯緩衝液內再調漿2次。該再洗滌並再調漿的樣品進行過濾，隨後以400mL偶聯緩衝液洗滌。該樣品被貼上中間體E的標籤。
1.5g偶聯緩衝液和250μL單克隆抗-維生素B12抗體(產品號V9505，由Sigma-Aldrich(St.Louis，MO銷售)濃度為約10～15mg抗體每毫升)加入到10mL圓底燒瓶中。在該燒瓶中加入160mg NaCNBH3和1g中間體E並在搖動器上混合4h。樣品過濾，並以10mL偶聯緩衝液洗滌4次。隨後，在10mL圓底燒瓶中加入1.5g偶聯緩衝液、160mg NaCNBH3和50mg乙醇胺，隨後在搖動器上混合4h。樣品過濾並以10mL偶聯緩衝液洗滌4次。獲得的剛性載體材料被置於含0.02％疊氮化鈉的PBS緩衝液內並在4℃下儲存。
實施例2檢測維生素B12的親和柱的製備一種範例親和柱通過在4.6×50mm內徑親和柱中充填實施例1製備的剛性載體材料而製成。充填的柱隨後灌注以含0.02wt％疊氮化鈉的磷酸鹽緩衝液(pH7.4)。獲得的範例親和柱在4℃溫度下儲存。
實施例3含維生素B12的組合物的分析實施例2的範例親和柱被偶聯到類似於圖3所示範例儀器40的儀器上。該儀器包含高效液相色譜(HPLC)(型號1100系列，AgilentTechnologies，Wilmington，DE)。利用配備了200μL樣品迴路的型號RHEODYNE 7725的樣品注入器(VWR International Ltd.，Dorset，UK)進行注入。藉助型號RHEODYNE 7725的樣品注入器可將親和柱從HPLC的在線組態(即，親和柱與HPLC流體聯通)轉換到離線組態(即，親和柱未與HPLC流體聯通)。藉助型號LC10AD高壓液體泵(Shimadzu，Columbia，MD)使樣品從樣品注入器轉移流過親和柱。型號1100紫外-可見光檢測器(Agilent Technologies，Wilmington，DE)在361nm檢測到峰。
結合緩衝液，包含(0.01M Na2PO4+0.15M NaCl；pH 7.0)，被泵送通過親和柱以使該柱達到平衡。總共使用了10個柱體積的結合緩衝液。
按如下所述製備含維生素B12的試樣。將含有約1mg/g維生素B12並重0.1g試樣的固體材料溶解在100mL結合緩衝液中形成混合物。該混合物利用0.22μm過濾器進行過濾。
在加載該試樣之前，採取以下步驟(1)給RP-HPLC按下面的規定編程；(2)所有緩衝液接受脫氣處理並採用0.45μm過濾器進行過濾；(3)給泵管充填適當的緩衝液，然後再將親和柱和分析柱連接到儀器上，以防止空氣帶入到柱內；(4)從柱上拆下端蓋，將柱連接到儀器上；(5)每個柱使用至少10個柱體積的結合緩衝液平衡或直至在流出液中檢測不到信號；以及(6)將試樣加載到樣品迴路中。
採用以下色譜條件柱1 抗-維生素B12免疫親和柱柱2 GENESISC18，4μm，4.6×250mm流率 1ml/min檢測器紫外-可見光，361nm結合緩衝液0.01M磷酸鹽+0.15M NaCl，pH7.0洗脫緩衝液0.01M HCl+0.15M NaCl移動相30％(v/v)甲醇/70％(v/v)0.01M HCl+0.15M NaCl將以下時間周期編程到儀器設定中

實施例4含有單克隆抗-黃麴黴毒素B1抗體的剛性載體的製備按如下所述製備範例剛性載體。1.5g偶聯緩衝液和250μg單克隆抗-黃麴黴毒素B1抗體(產品號A9555，由Sigma-Aldrich(St.Louis，MO，)銷售，濃度為約7.6mg抗體每毫升)加入到10mL圓底燒瓶中。在該燒瓶中加入160mg NaCNBH3和1g實施例1的中間體E並在搖動器上混合4h。樣品過濾，並以10mL偶聯緩衝液洗滌4次。隨後，在10mL圓底燒瓶中加入1.5g偶聯緩衝液、160mg NaCNBH3和50mg乙醇胺，隨後在搖動器上混合4h。樣品過濾並以10mL偶聯緩衝液洗滌4次。獲得的剛性載體材料被置於含0.02％疊氮化鈉的PBS緩衝液內並在4℃下儲存。
實施例5檢測黃麴黴毒素B1的親和柱的製備一種範例親和柱通過在4.6×50mm內徑的親和柱中充填實施例4製備的剛性載體材料而製成。充填的柱隨後灌注以含0.02wt％疊氮化鈉的20mM磷酸鹽緩衝液(pH7.4)。獲得的範例親和柱在4℃溫度下儲存。
實施例6含黃麴黴毒素的組合物的分析實施例5的範例親和柱被偶聯到類似於圖3所示範例儀器40的儀器上。該儀器包含配備了後柱型號為Cobra cell(Lamers Pleuger′s，Hertogenbosch，NL)的高效液相色譜(HPLC)(型號1100系列，AgilentTechnologies(Wilmington，DE))。利用配備了500μL樣品迴路的型號RHEODYNE 7725的樣品注入器(VWR International Ltd，Dorset，UK)進行注入。藉助型號RHEODYNE 7725的樣品注入器可將親和柱切換到與HPLC的在線或離線。藉助型號LC10AD高壓液體泵(Shimadzu，Columbia，MD)，使樣品從樣品注入器轉移流過親和柱。型號1100紫外-可見光檢測器(Agilent Technologies，Wilmington，DE)在365nm和型號1046A可編程螢光檢測器(Agilent Technologies，Wilmington，DE)在365/430nm檢測到峰。
結合緩衝液，包含(0.01M Na2PO4+0.15M NaCl；pH 7.0)，被泵送通過親和柱以使該柱達到平衡。總共使用了10個柱體積的結合緩衝液。
按如下所述製備含黃麴黴毒素B1、B2、G1和G2的試樣。含有10～100ng/g黃麴黴毒素B1、B2、G1和G2並重25g的固體材料被懸浮在100mL乙腈中。樣品在超聲波作用下提取15min。液體部分以6000rpm離心處理10min。100μL上層清液以900μL結合緩衝液進行稀釋。
在加載試樣之前，採取以下步驟(1)給RP-HPLC按下面的規定編程；(2)所有緩衝液接受脫氣處理並採用0.45μm過濾器進行過濾；(3)給泵管充填適當的緩衝液，然後再將親和柱和分析柱連接到儀器上，以防止空氣帶入到柱內；(4)從柱上拆下端蓋，將柱連接到儀器上；(5)每個柱使用至少10個柱體積的結合緩衝液平衡或直至在流出液中檢測不到信號；以及(6)將試樣加載到樣品迴路中。
採用以下色譜條件柱1 抗-黃麴黴毒素B1免疫親和柱柱2 GENESISC18，4μm，4.6×250mm檢測器1 紫外-可見光，365nm檢測器2 螢光檢測器(365/430nm)結合緩衝液0.01M磷酸鹽+0.15M NaCl，pH7.0流率 0.5ml/min洗脫緩衝液20％(v/v)乙腈水溶液移動相600mL甲醇+80mL乙腈+200μL濃硝酸+50mg溴化鉀並以水調整到1000mL流率 0.8ml/min將以下時間周期編程到儀器設定中

實施例7
含有重組人雌激素受體(hER)作為活性配體的剛性載體的製備按如下所述製備範例剛性載體。1.5g偶聯緩衝液和50μg重組人雌激素受體(產品號AB RP-310，由10P′s(Breda，NL)銷售)加入到10mL圓底燒瓶中。在該燒瓶中加入160mg NaCNBH3和實施例1的1g中間體E並在搖動器上混合4h。樣品過濾，並以10mL偶聯緩衝液洗滌4次。隨後，在10mL圓底燒瓶中加入1.5g偶聯緩衝液、160mg NaCNBH3和50mg乙醇胺，隨後在搖動器上混合4h。樣品過濾並以10mL偶聯緩衝液洗滌4次。獲得的剛性載體材料被置於含0.02％疊氮化鈉的PBS緩衝液內並在4℃下儲存。
實施例8檢測內分泌幹擾劑的親和柱的製備一種範例親和柱通過在4.6mm×50mm內徑的親和柱中充填實施例7製備的剛性載體材料而製成。充填的柱隨後灌注以含0.02wt％疊氮化鈉的20mM磷酸鹽緩衝液(pH7.4)。獲得的範例親和柱在4℃溫度下儲存。
實施例9含內分泌幹擾劑的組合物的分析實施例8的範例親和柱被偶聯到類似於實施例3中使用的儀器的儀器上。結合緩衝液，包含(0.01M Na2PO4+0.15M NaCl；pH 7.0)，被泵送通過親和柱以使該柱達到平衡。總共使用了10個柱體積的結合緩衝液。
按如下所述製備含17-β-雌二醇、17-α-雌二醇、17-α-乙炔基雌二醇、雌酮、雙酚A、壬基酚和鄰苯二甲酸丁基苄基酯的混合物的試樣。含250～1000mg/l 17-β-雌二醇、17-α-雌二醇、17-α-乙炔基雌二醇、雌酮、雙酚A、壬基酚和鄰苯二甲酸丁基苄基酯的儲備溶液在100mL結合緩衝液中稀釋1000倍配成混合物。
在加載試樣之前，採取以下步驟(1)給RP-HPLC按下面的規定編程；(2)所有緩衝液接受脫氣處理並採用0.45μm過濾器進行過濾；(3)給泵管充填適當的緩衝液，然後再將親和柱和分析柱連接到儀器上，以防止空氣帶入到柱內；(4)從柱上拆下端蓋，將柱連接到儀器上；
(5)每個柱使用至少10個柱體積的結合緩衝液平衡或直至在流出液中檢測不到信號；以及(6)將試樣加載到樣品迴路中。
採用以下色譜條件柱1 重組人雌激素受體(hER)親和柱柱2 GENESISC18，4μm，4.6×250mm流率 0.8ml/min檢測器紫外-可見光，230nm結合緩衝液0.01M磷酸鹽+0.15M NaCl，pH7.0洗脫緩衝液25％(v/v)6M硫氰酸鉀，50％(v/v)結合緩衝液，25％(v/v)甲醇移動相A 0.01N HCl水溶液移動相B 乙腈將以下時間周期編程到儀器設定中

雖然以結合本發明具體實施方案對本發明做了描述，但本領域技術人員在研讀了上面的內容以後可以輕易地想到對於這些實施方案的替代、變換和等價方案。因此，本發明的範圍應按照所附權利要求及其任何等價物的範圍來評估。
權利要求
1.一種包含與分析柱流體聯通的親和柱的儀器，其中親和柱包含剛性載體，它能耐受最高約200bar的柱壓力，所述剛性載體具有一種或多種結合在其上的配體，所述一種或多種配體能選擇性地結合到給定樣品溶液內的一種或多種分析物上。
2.權利要求1的儀器，其中剛性載體包含大量無機顆粒。
3.權利要求2的儀器，其中每個無機顆粒包含(i)無機基材；(ii)改性基材表面，它減少不希望的材料與無機基材之間的非特異結合。
4.權利要求3的儀器，其中改性基材表面包含一個或多個固定在無機基材上的R10基團，其中每個R10基團獨立地選自-CH2OH、-CH(OH)2、-CH(OH)CH3、-CH2CH2OH、-C(OH)2CH3、-CH2CH(OH)2和-CH(OH)CH2(OH)。
5.權利要求4的儀器，其中每個R10基團包含-CH2OH。
6.權利要求1的儀器，其中一種或多種配體包含單克隆抗-黃麴黴毒素B1抗體、單克隆抗-黃麴黴毒素G1抗體、單克隆抗-黃麴黴毒素Q1抗體、單克隆抗-黃麴黴毒素B2抗體、單克隆抗-黃麴黴毒素G2抗體、單克隆抗-雙酚A抗體、單克隆抗-2，4-二氯苯氧基乙酸抗體、單克隆抗-2，4，5-三氯苯氧基乙酸抗體、單克隆抗-4-氯-2-甲基乙酸抗體、單克隆抗-4-(2，4-二氯苯氧基)丁酸抗體、單克隆抗-雌酮抗體、單克隆抗-17-β-雌二醇抗體、單克隆抗-17-α-乙炔基雌二醇抗體、單克隆抗-乳鐵蛋白抗體、單克隆抗-睪酮抗體、單克隆抗-去甲睪酮抗體、單克隆抗-苯基脲抗體、單克隆抗-烯菌酮抗體、單克隆抗-葉酸抗體、單克隆抗-維生素B12(氰鈷銨)抗體、單克隆抗-殺螟松抗體、單克隆抗-毒死蜱抗體、單克隆抗-嘧啶磷抗體、抗-兒茶酚胺抗體、重組人雌激素受體(hER)及其組合。
7.權利要求1的儀器，其中一種或多種分析物包含黃麴黴毒素B1、黃麴黴毒素G1、黃麴黴毒素Q1、黃麴黴毒素B2、黃麴黴毒素G2、雙酚A、2，4-二氯苯氧基乙酸、2，4，5-三氯苯氧基乙酸、4-氯-2-甲基乙酸、4-(2，4-二氯苯氧基)丁酸、雌酮、17-β-雌二醇、17-α-乙炔基雌二醇、乳鐵蛋白、睪酮、去甲睪酮、溴谷隆、醚磺隆、醚苯磺隆、氟磺隆、烯菌酮、葉酸、維生素B12(氰鈷銨)、殺螟松、毒死蜱、嘧啶磷、腎上腺素、去腎上腺素、多巴胺、具有雌激素活性的化合物，或其組合。
8.權利要求1的儀器，其中一種或多種配體包含單克隆抗-黃麴黴毒素B1抗體、單克隆抗-黃麴黴毒素G1抗體、單克隆抗-黃麴黴毒素Q1抗體、單克隆抗-黃麴黴毒素B2抗體、單克隆抗-黃麴黴毒素G2抗體，或其組合。
9.權利要求1的儀器，其中一種或多種配體包含單克隆抗-葉酸抗體、單克隆抗-維生素B12(氰鈷銨)抗體，或其組合。
10.權利要求1的儀器，其中一種或多種配體包含重組人雌激素受體(hER)。
11.權利要求1的儀器，其中親和柱通過管式偶聯器連接到分析柱上。
12.權利要求1的儀器，其中分析柱構成反相高效液相色譜(RP-HPLC)裝置的一部分。
13.權利要求12的儀器，還包含螢光檢測裝置。
14.權利要求1的儀器，其中剛性載體包含大量矽膠顆粒。
15.權利要求14的儀器，其中矽膠顆粒具有球體的形狀和介於約500埃～800埃的平均孔隙尺寸。
16.一種適用於親和柱的剛性載體，所述剛性載體包含大量無機顆粒，其中每個顆粒包含無機基材；改性基材表面，它減少非分析物材料和配體-特異性分析物材料在無機基材上的非特異結合；以及結合在無機基材上的一種或多種配體，其中該一種或多種配體包含單克隆抗-黃麴黴毒素B1抗體、單克隆抗-黃麴黴毒素G1抗體、單克隆抗-黃麴黴毒素Q1抗體、單克隆抗-黃麴黴毒素B2抗體、單克隆抗-黃麴黴毒素G2抗體、單克隆抗-雙酚A抗體、單克隆抗-2，4-二氯苯氧基乙酸抗體、單克隆抗-2，4，5-三氯苯氧基乙酸抗體、單克隆抗-4-氯-2-甲基乙酸抗體、單克隆抗-4-(2，4-二氯苯氧基)丁酸抗體、單克隆抗-雌酮抗體、單克隆抗-17-β-雌二醇抗體、單克隆抗-17-α-乙炔基雌二醇抗體、單克隆抗-乳鐵蛋白抗體、單克隆抗-睪酮抗體、單克隆抗-去甲睪酮抗體、單克隆抗-苯基脲抗體、單克隆抗-烯菌酮抗體、單克隆抗-葉酸抗體、單克隆抗-維生素B12(氰鈷銨)抗體、單克隆抗-殺螟松抗體、單克隆抗-毒死蜱抗體、單克隆抗-嘧啶磷抗體、抗-兒茶酚胺抗體、重組人雌激素受體(hER)及其組合。
17.權利要求16的剛性載體，其中改性基材表面包含一個或多個固定在無機基材上的R10基團，其中每個R10基團獨立地選自-CH2OH、-CH(OH)2、-CH(OH)CH3、-CH2CH2OH、-C(OH)2CH3、-CH2CH(OH)2和-CH(OH)CH2(OH)。
18.權利要求17的剛性載體，其中一個或多個R10基團是通過二價部分-X-固定在無機基材上的。
19.權利要求16的剛性載體，其中一種或多種配體通過一種或多種在無機基材上的反應活性部位與一種或多種配體上的官能團之間形成連接的連接基固定到無機基材上。
20.權利要求19的剛性載體，其中一種或多種連接基包含氨基取代的矽氧烷與二醛的組合。
21.權利要求20的剛性載體，其中氨基取代的矽氧烷包含氨基丙基三甲氧基矽烷，而二醛則包含戊二醛。
22.權利要求16的剛性載體，其中一種或多種配體直接固定在無機基材的反應活性部位上。
23.權利要求16的剛性載體，其中改性基材表面包含反應活性部位，其中約50％～約99％反應活性部位覆蓋以R基團，該基團的反應活性小於改性前基材表面上的任何官能團的，並且約1％～約50％反應活性部位覆蓋以一種或多種配體或任選的連接基。
24.權利要求23的剛性載體，其中約70％～約95％反應活性部位覆蓋以R基團，該基團的反應活性小於改性前基材表面上的任何官能團的，並且約5％～約30％反應活性部位覆蓋以一種或多種配體或任選的連接基。
25.權利要求16的剛性載體，其中一種或多種配體包含單克隆抗-黃麴黴毒素B1抗體、單克隆抗-黃麴黴毒素G1抗體、單克隆抗-黃麴黴毒素Q1抗體、單克隆抗-黃麴黴毒素B2抗體、單克隆抗-黃麴黴毒素G2抗體，或其組合。
26.權利要求16的剛性載體，其中一種或多種配體包含單克隆抗-葉酸抗體、單克隆抗-維生素B12(氰鈷銨)抗體，或其組合。
27.權利要求16的剛性載體，其中一種或多種配體包含重組人雌激素受體(hER)。
28.權利要求16的剛性載體，其中剛性載體包含大量矽膠顆粒。
29.權利要求28的剛性載體，其中矽膠顆粒具有球體的形狀和介於約500埃～約800埃的平均孔隙尺寸。
30.一種親和柱，包含權利要求16～29中任何一項的剛性載體。
31.一種儀器，包含與分析柱流體聯通的親和柱，其中親和柱包含權利要求30的親和柱。
32.一種親和柱，包含具有一定柱體積的柱結構；以及位於柱結構的柱體積內的剛性載體，所述剛性載體包含大量無機顆粒，其中每個顆粒包含無機基材；改性基材表面，它減少非分析物材料和配體-特異性分析物材料與無機基材之間的非特異結合；以及結合在無機基材上的一種或多種配體，其中該一種或多種配體包含單克隆抗-黃麴黴毒素B1抗體、單克隆抗-黃麴黴毒素G1抗體、單克隆抗-黃麴黴毒素Q1抗體、單克隆抗-黃麴黴毒素B2抗體、單克隆抗-黃麴黴毒素G2抗體、單克隆抗-雙酚A抗體、單克隆抗-2，4-二氯苯氧基乙酸抗體、單克隆抗-2，4，5-三氯苯氧基乙酸抗體、單克隆抗-4-氯-2-甲基乙酸抗體、單克隆抗-4-(2，4-二氯苯氧基)丁酸抗體、單克隆抗-雌酮抗體、單克隆抗-17-β-雌二醇抗體、單克隆抗-17-α-乙炔基雌二醇抗體、單克隆抗-乳鐵蛋白抗體、單克隆抗-睪酮抗體、單克隆抗-去甲睪酮抗體、單克隆抗-苯基脲抗體、單克隆抗-烯菌酮抗體、單克隆抗-葉酸抗體、單克隆抗-維生素B12(氰鈷銨)抗體、單克隆抗-殺螟松抗體、單克隆抗-毒死蜱抗體、單克隆抗-嘧啶磷抗體、抗-兒茶酚胺抗體、重組人雌激素受體(hER)及其組合。
33.權利要求32的親和柱，其中改性基材表面包含一個或多個固定在無機基材上的R10基團，其中每個R10基團獨立地選自-CH2OH、-CH(OH)2、-CH(OH)CH3、-CH2CH2OH、-C(OH)2CH3、-CH2CH(OH)2和-CH(OH)CH2(OH)。
34.權利要求33的親和柱，其中一個或多個R10基團是通過二價部分-X-固定在無機基材上的。
35.權利要求32的親和柱，其中一種或多種配體通過一種或多種在無機基材上的反應活性部位與一種或多種配體上的官能團之間形成連接的連接基固定到無機基材上。
36.權利要求35的親和柱，其中一種或多種連接基包含氨基取代的矽氧烷與二醛的組合。
37.權利要求36的親和柱，其中氨基取代的矽氧烷包含氨基丙基三甲氧基矽烷，而二醛則包含戊二醛。
38.權利要求32的親和柱，其中一種或多種配體直接固定在無機基材的反應活性部位上。
39.權利要求32的親和柱，其中改性基材表面包含反應活性部位，其中約50％～約99％反應活性部位覆蓋以R基團，該基團的反應活性小於改性前基材表面上的任何官能團的，並且約50％～約1％反應活性部位覆蓋以一種或多種配體或任選的連接基。
40.權利要求39的親和柱，其中約70％～約95％反應活性部位覆蓋以R基團，該基團的反應活性小於改性前基材表面上的任何官能團的，並且約30％～約5％反應活性部位覆蓋以一種或多種配體或任選的連接基。
41.權利要求32的親和柱，其中一種或多種配體包含單克隆抗-黃麴黴毒素B1抗體、單克隆抗-黃麴黴毒素g1抗體、單克隆抗-黃麴黴毒素Q1抗體、單克隆抗-黃麴黴毒素B2抗體、單克隆抗-黃麴黴毒素G2抗體，或其組合。
42.權利要求32的親和柱，其中一種或多種配體包含單克隆抗-葉酸抗體、單克隆抗-維生素B12(氰鈷銨)抗體，或其組合。
43.權利要求32的親和柱，其中一種或多種配體包含重組人雌激素受體(hER)。
44.權利要求32的親和柱，其中剛性載體包含大量矽膠顆粒。
45.權利要求44的親和柱，其中矽膠顆粒具有球體的形狀和介於約500埃～約800埃的平均孔隙尺寸。
46.一種儀器，包含與分析柱流體聯通的親和柱，其中親和柱包含權利要求30和32～45中任何一項的親和柱。
47.一種分析試樣的方法，所述方法包括以下步驟令試樣與權利要求1～46中任何一項的儀器、剛性載體或親和柱接觸。
48.一種分析洗脫樣品的方法，所述方法包括以下步驟將洗脫樣品從親和柱轉移到分析柱，其中親和柱與分析柱流體聯通，以及分析分析柱的內容物以確定一種或多種分析物在洗脫樣品中的存在。
49.權利要求48的方法，其中洗脫樣品包含一種或多種在溶劑中的分析物，所述一種或多種分析物選自黃麴黴毒素B1、黃麴黴毒素G1、黃麴黴毒素Q1、黃麴黴毒素B2、黃麴黴毒素G2、雙酚A、2，4-二氯苯氧基乙酸、2，4，5-三氯苯氧基乙酸、4-氯-2-甲基乙酸、4-(2，4-二氯苯氧基)丁酸、雌酮、17-β-雌二醇、17-α-乙炔基雌二醇、乳鐵蛋白、睪酮、去甲睪酮、溴谷隆、醚磺隆、醚苯磺隆、氟磺隆、烯菌酮、葉酸、維生素B12(氰鈷銨)、殺螟松、毒死蜱、嘧啶磷、腎上腺素、去腎上腺素、多巴胺、具有雌激素活性的化合物，或其組合。
50.權利要求49的方法，其中洗脫樣品包含可檢測數量的至少一種真菌毒素。
51.權利要求49的方法，其中洗脫樣品包含可檢測數量的黃麴黴毒素B1、黃麴黴毒素G1、黃麴黴毒素Q1、黃麴黴毒素B2、黃麴黴毒素G2或其組合。
52.權利要求49的方法，其中洗脫樣品包含可檢測數量的葉酸、維生素B12(氰鈷銨)，或其組合。
53.權利要求49的方法，其中洗脫樣品包含可檢測數量的至少一種具有雌激素活性的化合物。
54.權利要求48的方法，其中轉移步驟包括對洗脫樣品施加流體壓力以便將洗脫樣品從親和柱轉移到分析柱。
55.權利要求54的方法，其中流體壓力是通過泵施加的。
56.權利要求48的方法，其中分析步驟包括檢測一種或多種分析物在洗脫樣品中的存在，將一種或多種分析物彼此分離，在洗脫樣品中定量化一種或多種分析物，或其任意組合。
57.權利要求56的方法，其中分析步驟包括對洗脫樣品實施反相高效液相色譜(RP-HPLC)、螢光檢測或這兩種處理。
58.權利要求48～57中任何一項的方法，其中親和柱包含能耐受最高約300bar的柱壓的剛性載體，所述剛性載體具有一種或多種結合在其上的配體，所述一種或多種配體能選擇性地結合試樣內的一種或多種分析物。
59.權利要求58的方法，其中剛性載體包含大量無機顆粒。
60.權利要求59的方法，其中每個無機顆粒包含無機基材；和減少非分析物材料和配體-特異性分析物材料對無機基材的非特異結合的改性基材表面。
61.權利要求60的方法，其中改性基材表面包含一個或多個固定在無機基材上的R10基團，其中每個R10基團獨立地選自-CH2OH、-CH(OH)2、-CH(OH)CH3、-CH2CH2OH、-C(OH)2CH3、-CH2CH(OH)2和-CH(OH)CH2(OH)。
62.權利要求61的方法，其中每個R10基團包含-CH2OH。
63.權利要求61的方法，其中一個或多個R10基團是通過二價部分-X-固定在無機基材上的。
64.權利要求58的方法，其中一種或多種配體通過一種或多種在無機基材上的反應活性部位與一種或多種配體上的官能團之間形成連接的連接基固定到無機基材上。
65.權利要求64的方法，其中一種或多種連接基包含氨基取代的矽氧烷與二醛的組合。
66.權利要求65的方法，其中氨基取代的矽氧烷包含氨基丙基三甲氧基矽烷，而二醛則包含戊二醛。
67.權利要求58的方法，其中一種或多種配體直接固定在無機基材的反應活性部位上。
68.權利要求60的方法，其中改性基材表面包含反應活性部位，其中約50％～約99％反應活性部位覆蓋以R基團，該基團的反應活性小於改性前基材表面上的任何官能團的，並且約50％～約1％反應活性部位覆蓋以一種或多種配體或任選的連接基。
69.權利要求68的方法，其中約70％～約95％反應活性部位覆蓋以R基團，該基團的反應活性小於改性前基材表面上的任何官能團的，並且約30％～約5％反應活性部位覆蓋以一種或多種配體或任選的連接基。
70.權利要求59的方法，其中無機顆粒包含大量矽膠顆粒。
71.權利要求70的方法，其中矽膠顆粒具有球體的形狀和介於約500埃～約800埃的平均孔隙尺寸。
72.權利要求48～71中任何一項的方法，還包括以下步驟將試樣引入到包含能耐受最高約200bar柱壓的剛性載體的親和柱中，所述剛性載體具有一種或多種固定在其上的配體，所述一種或多種配體能選擇性地結合一種或多種分析物；令試樣接觸剛性載體和其上的配體；清洗剛性載體以便洗掉任何除一種或多種分析物以外的試樣組分；將洗脫液引入到親和柱中以便使洗脫液接觸一種或多種結合在剛性載體上的配體上的分析物；以及讓洗脫液維持與剛性載體接觸一段時間以便形成洗脫樣品。
73.權利要求72的方法，其中該段時間介於約5分鐘～約15分鐘。
74.權利要求72的方法，還包括以下步驟以第一緩衝液衝洗親和柱；以及將第二試樣引入到親和柱中。
75.一種分析潛在地包含至少一種真菌毒素的洗脫樣品的方法，所述方法包括以下步驟將洗脫樣品從親和柱轉移到分析柱，其中親和柱與分析柱流體聯通，以及分析分析柱的內容物以確定至少一種真菌毒素在洗脫樣品中的存在。
76.權利要求75的方法，其中洗脫樣品包含可檢測數量的黃麴黴毒素B1、黃麴黴毒素G1、黃麴黴毒素Q1、黃麴黴毒素B2、黃麴黴毒素G2或其組合。
77.一種分析潛在地包含葉酸、維生素B12(氰鈷銨)或其組合的洗脫樣品的方法，其中該方法包含以下步驟將洗脫樣品從親和柱轉移到分析柱，其中親和柱與分析柱流體聯通，以及分析分析柱的內容物以確定葉酸、維生素B12(氰鈷銨)或二者在洗脫樣品中的存在。
78.一種分析潛在地包含至少一種具有雌激素活性的化合物的試樣的方法，所述方法包括以下步驟將試樣引入到親和柱中，該親和柱包含剛性載體，後者具有結合在其上的一種或多種配體，所述一種或多種配體能選擇性地結合到一種或多種具有雌激素活性的化合物上。
79.權利要求78的方法，其中一種或多種配體包含天然人雌激素受體、重組人雌激素受體(hER)或其衍生物、模擬雌激素受體或其衍生物的生物學活性部分的重組蛋白，或任何選擇性識別作為內分泌幹擾劑的具有生物活性的化合物的其它配體。
80.權利要求78的方法，其中一種或多種配體包含重組人雌激素受體(hER)。
81.權利要求78的方法，還包括以下步驟令試樣接觸剛性載體和其上的配體；清洗剛性載體以便洗掉任何未顯示雌激素活性的試樣組分；將洗脫液引入到親和柱中以便使洗脫液接觸一種或多種結合在剛性載體上的配體上的具有雌激素活性的化合物；以及讓洗脫液維持與剛性載體接觸一段時間以便形成包含具有雌激素活性的化合物的洗脫樣品；以及分析分析柱的內容物以確定一種或多種具有雌激素活性的化合物在洗脫樣品中的存在。
82.權利要求81的方法，其中剛性載體能耐受最高約200bar的柱壓，並且親和柱與分析柱流體聯通。
83.一種分析潛在地包含至少一種分析物的試樣的方法，所述方法包括以下步驟向包含剛性載體的親和柱中引入試樣，所述剛性載體包含大量無機顆粒，其中每個顆粒包含無機基材；改性基材表面，它減少非分析物材料和配體-特異性分析物材料與無機基材之間的非特異結合；以及結合在無機基材上的一種或多種配體，其中該一種或多種配體包含單克隆抗-黃麴黴毒素B1抗體、單克隆抗-黃麴黴毒素G1抗體、單克隆抗-黃麴黴毒素Q1抗體、單克隆抗-黃麴黴毒素B2抗體、單克隆抗-黃麴黴毒素G2抗體、單克隆抗-雙酚A抗體、單克隆抗-2，4-二氯苯氧基乙酸抗體、單克隆抗-2，4，5-三氯苯氧基乙酸抗體、單克隆抗-4-氯-2-甲基乙酸抗體、單克隆抗-4-(2，4-二氯苯氧基)丁酸抗體、單克隆抗-雌酮抗體、單克隆抗-17-β-雌二醇抗體、單克隆抗-17-α-乙炔基雌二醇抗體、單克隆抗-乳鐵蛋白抗體、單克隆抗-睪酮抗體、單克隆抗-去甲睪酮抗體、單克隆抗-苯基脲抗體、單克隆抗-烯菌酮抗體、單克隆抗-葉酸抗體、單克隆抗-維生素B12(氰鈷銨)抗體、單克隆抗-殺螟松抗體、單克隆抗-毒死蜱抗體、單克隆抗-嘧啶磷抗體、抗-兒茶酚胺抗體、重組人雌激素受體(hER)，及其組合；令試樣接觸剛性載體和其上的配體；清洗剛性載體以便洗掉任何不結合配體的試樣組分；將洗脫液引入到親和柱中以便使洗脫液接觸一種或多種結合在剛性載體上的配體上的分析物；以及讓洗脫液維持與剛性載體接觸一段時間以便形成潛在地包含一種或多種分析物的洗脫樣品；以及分析分析柱的內容物以確定一種或多種分析物在試樣中的存在。
84.權利要求83的方法，其中改性基材表面包含一個或多個固定在無機基材上的R10基團，其中每個R10基團獨立地選自-CH2OH、-CH(OH)2、-CH(OH)CH3、-CH2CH2OH、-C(OH)2CH3、-CH2CH(OH)2和-CH(OH)CH2(OH)。
85.權利要求84的方法，其中一個或多個R10基團是通過二價部分-X-固定在無機基材上的。
86.權利要求83的方法，其中一種或多種配體通過一種或多種在無機基材上的反應活性部位與一種或多種配體上的官能團之間形成連接的連接基固定到無機基材上。
87.權利要求86的方法，其中一種或多種連接基包含氨基取代的矽氧烷與二醛的組合。
88.權利要求87的方法，其中氨基取代的矽氧烷包含氨基丙基三甲氧基矽烷，而二醛則包含戊二醛。
89.權利要求83的方法，其中一種或多種配體直接固定在無機基材的反應活性部位上。
90.權利要求83的方法，其中改性基材表面包含反應活性部位，其中約50％～約99％反應活性部位覆蓋以R基團，該基團的反應活性小於改性前基材表面上的任何官能團的，並且約50％～約1％反應活性部位覆蓋以一種或多種配體或任選的連接基。
91.權利要求90的方法，其中約70％～約95％反應活性部位覆蓋以R基團，該基團的反應活性小於改性前基材表面上的任何官能團的，並且約30％～約5％反應活性部位覆蓋以一種或多種配體或任選的連接基。
92.權利要求83的方法，其中無機顆粒包含大量矽膠顆粒。
93.權利要求92的方法，其中矽膠顆粒具有球體的形狀和介於約500埃～約800埃的平均孔隙尺寸。
94.一種製造包含無機基材的剛性載體材料的方法，所述方法包括以下步驟(1)令R基團固定到無機基材表面的至少第一部分上，其中R基團的反應活性小於固定步驟之前無機基材表面上的任何官能團的；(2)令一種或多種連接基固定到無機基材表面的至少第二部分上，其中一種或多種連接基包含醛官能團；以及(3)令一種或多種配體選擇性地結合到一種或多種連接基上。
95.權利要求94的方法，其中步驟(2)在步驟(1)之前實施。
96.權利要求94的方法，其中一種或多種連接基包含氨基取代的矽氧烷與二醛的組合。
97.權利要求96的方法，其中氨基取代的矽氧烷包含氨基丙基三甲氧基矽烷，而二醛則包含戊二醛。
98.一種製造親和柱的方法，所述方法包括以下步驟(1)密封管式結構的第一端；(2)以權利要求16～29中任何一項的剛性載體材料或按照權利要求94～97中任何一項的方法成形的剛性載體材料，至少部分地充填管式結構的柱腔；(3)以第一緩衝液至少部分地填充管式結構的柱腔以包封剛性載體材料；並且，任選地，(4)密封管式結構的另一端。
全文摘要
公開一種包括適合用於親和柱的剛性載體的儀器部件、親和柱以及與分析柱(例如，在高壓液相色譜(HPLC)柱中的)流體聯通的親和柱。還公開採用該儀器部件檢測一種或多種分析物的存在的方法。
文檔編號B01J20/286GK101031344SQ200580031449
公開日2007年9月5日 申請日期2005年7月19日 優先權日2004年7月19日
發明者P·M·－J·布雷姆斯, G·范埃謝, M·M·雷姆雷夫－布姆 申請人:格雷斯股份有限兩合公司