蔓越莓木葡聚糖低聚糖組合物的製作方法

2023-10-05 18:52:24 1

蔓越莓木葡聚糖低聚糖組合物的製作方法
【專利摘要】一種由蔓越莓花萼經酶處理的組合物製備的組合物，其能減少或抑制微生物與具有用於粘附的α-Gal-(1-4)-Gal末端低聚糖受體的細胞的粘附。
【專利說明】蔓越莓木葡聚糖低聚糖組合物

【技術領域】
[0001] 本發明提供一種新的木葡聚糖低聚糖組合物，該組合物被命名為抗微生物粘附抑 制性級分A6, 一種含有所述包含抗微生物粘附抑制性級分A6的低聚糖組合物的組合物，和 使用所述組合物至少減少病原體粘附對動物細胞，特別是人和哺乳動物細胞粘附的方法。

【背景技術】
[0002] 木葡聚糖是公知的在雙子葉植物和非鴨蹠草科單子葉植物中發現的I型植物 細胞壁中的主要交聯多糖（Carpita 和Gibeaut, Plant Journal, Volume 3，1_30，1993)〇 帶一個0-(1-4)-葡聚糖骨架，木葡聚糖氫鍵結合到纖維素微纖維表面並且形成連接 細胞壁中相鄰微纖維的網絡。該木葡聚糖網絡與細胞壁基質多糖的膠質網絡相互交錯 (Carpita和Gibeaut, 1993,見前）。這使得木葡聚糖成為初生細胞壁生長和形成中的重要 多糖（Carpita 和 McCann, Biochemistry and Molecular Biology of Plants, Buchanan B. B. , Gruissem, W. , Jones, R. L. , Eds. ；American Society of Plant Physiologists, Rockville，MD.，52-108, 2000)。木葡聚糖中存在似塊狀結構，其中6-11糖序列在整個 多糖中重複。因此，碳水化合物結構對植物分類群是特異性的（Sims等，Carbohydrate Research, Volume 293, 147-172, 1996 ;Vierhuis 等,Carbohydrate Research, Volume 332, 285-297, 2001 ;Ray 等，Carbohydrate Research, Volume 339, 201-208, 2004 ;Hoffman 等，Carbohydrate Research, Volume 340,1826-1840,2005)。3 種木葡聚糖結構已被描述 具有巖藻半乳-木葡聚糖，巖藻糖半乳糖-木葡聚糖最常分布在單子葉植物分類學的目中 約一半，和所有除茄目、唇形目、龍膽目、杜鵑花目外的雙子葉植物目的植物中（Carpita和 McCann 2000,見前；Hoffman等2005,見前）。來自這些後一目的木葡聚糖含有阿拉伯糖 基-木葡聚糖結構。少量的第三種木葡聚糖結構同樣在鴨蹠草科單子葉植物中（禾本科植 物草，鳳梨科植物，棕櫚，和柏樹）作為在纖維素骨架上隨機分布的單一木糖取代基存在 (Carpita和McCann, 2000，見前）。單一字母命名被開發用於描述木葡聚糖取代基的順序 (Fry 等，Physiol. Plant.，Volume 89, 1-3, 1993) 〇
[0003] 蔓越莓汁是酸性的（pH約2. 6或更低），富含花青素和賦予它澀味的丹寧酸 (Holmes 和 Starr,Fruit Juice Processing Technology, Nagy, S. , Chen, C. S. , Shaw, P. E. (Eds. )，AGSCIENCE，Auburndale，FL, 515-531, 1993)。果汁是在用熱的市售果膠酶浸 軟（約50°C作用約1小時）漿果後經研磨和壓榨而製備的。蔓越莓膠質具有非常高的 甲氧基含量，在壓榨後和果汁過濾和濃縮前需要二次的熱的市售果膠酶處理。蔓越莓汁 被認為是一種健康的果汁。原花色素具有抗氧化特性（Uri-Sarda等，Anal.Bioanal. Chem，Volume394, 1545-1556, 2009)，並且被報導能抑制P-傘狀大腸桿菌與尿路上皮細胞 的粘附（Howell 等，Phytochem.，Volume 66,2281-2291,2005)。P-傘狀大腸桿菌是引 發尿路感染的主要原因，其造成每年830萬的醫院就次數（Zopf和Roth, Lancet, Volume 347, 1017-1021，1996)。蔓越莓汁也被報導具有益生特性（Clifford等，美國專利申請號 20090022849, 2009)〇
[0004] 最近，Coleman等（於 07/13/2010 提交AmericanSocietyofPharmaconosy,St. PetersburgBeach,FL的報告）用蔓越莓汁粉餵豬並從尿中分離出低聚糖或氨基糖，其能 夠抑制由尿路致病性大腸桿菌引發的紅細胞凝集。相同的a-Gal-(l-4)-f3_Gal受體是紅 細胞凝集和P-傘狀大腸桿菌與尿路上皮細胞粘附所必須的（Howell等2005,見前）。因此， 非源自原花色素的碳水化合物，被報導具有細菌抗粘附特性（Coleman等2010,見前）。果 膠的低聚糖抑制大腸桿菌的產維羅毒素菌株和腸道致病菌株與HT29細胞的粘附（Rhoades 等J.FoodProtect.，卷71，2272-2277, 2008)。所以，植物細胞壁低聚糖優先地具有細菌抗 粘附特性。然而，蔓越莓植物細胞壁低聚糖的結構仍然未知，且Coleman等（2010,見前） 並未報導低聚糖如何在尿排洩前被胃腸道吸收。
[0005] 對中和和/或從宿主機體，如人和家畜，去除細菌和細菌成分的現有治療方案很 大程度上基於抗生素的使用。自20世紀40年代引入抗生素藥以來，抗生素藥被證明對許 多細菌相關疾病是有效的。然而，它們時常被濫用已導致抗生素耐藥性細菌菌株的產生，這 需要開發和使用越來越更強效的藥物。醫院內的細菌感染在不斷增加，導致嚴重病患的病 例激增，在某些情況下，甚至出現危急性命的症狀。例如，尿路感染（UTI)是一個普遍的衛 生保健問題。UTI通常定義為尿中出現>100, 000細胞/毫升的細菌。UTI普遍地由革蘭氏 陰性細菌，特別是大腸桿菌（E.coli)引起，並主要感染女性。這種感染是由細菌與尿道上 皮細胞粘附並定植所致。大腸桿菌的粘附是通過細菌細胞壁上的蛋白質性纖維（菌毛）進 行的，蛋白質性纖維能夠附著在尿路上皮細胞上特異性的低聚糖受體。抗生素是常規開處 方用於治療，但常常提高細菌的耐藥性。四分之一的女性也出現感染復發且經常被發現更 易於這些感染。能治療和預防UTI的自然物質可被用於那些在許多情況下因抗生素治療而 導致患有這種病況的患者，如需要後續抗真菌治療的繼發性陰道酵母感染。
[0006] 已有大量文獻報導蔓越莓植物營養素在預防和減輕尿路感染（UTI)中的作用，特 別是革蘭氏陰性尿路致病性細菌大腸桿菌，是UTI的最常見病因（Lavigne等，Clinical MicrobiologyandInfection,Volume14, 350-355, 2008 ；0feck等,Advancesin ExperimentalMedicineandBiology,Volume408, 179-183, 1996 ;0feck等，NewEngland JournalofMedicine,Volume324, 1599, 1991)。已發現食用蔓越莓在解決UTI感染有一定 的效果。蔓越莓產品能防止某些細菌菌毛與尿道的尿道上皮細胞的粘附，由此減少細菌產 生感染的能力?iMartino等，WorldJournalofUrology，2〇〇6) ;(Liu等，Biotechnology Bioengineering, 2006)。在蔓越莓汁中發現的原花色素，其是濃縮的丹寧酸，被證實抑制 大腸桿菌粘附（Howell等，JournalofMedicine, 1998)。於2009年公布的美國專利申請 2009/0226548,指出一些大腸桿菌菌毛特異性地結合到D-甘露糖，不像蔗糖或果糖，D-甘 露糖在人體內代謝非常慢，因此一旦攝入，D-甘露糖會進入血流並通過腎快速移動至排洩， 接著進入膀胱中的尿中。D-甘露糖一旦出現在尿中將會導致對D-甘露糖結合敏感的細菌 菌毛粘附於D-甘露糖，而不是上皮細胞。這使得機體從體內清除與D-甘露糖結合的大腸 桿菌。另外，D-甘露糖能夠逆轉與上皮結合的大腸桿菌競爭性地阻斷尿路感染的初發期。 為了減輕現有的UTI和防止復發，定期攝取蔓越莓以及D-甘露糖將防止細菌粘附、定植並 最終防止不可控的尿路感染。這個文獻進一步認為為了實施這個策略，需要消費者的配合。
[0007] 細菌和真菌感染的其他治療有使用肉桂（Cinnamonmumcassia)提取物。肉桂的 抗微生物作用可部分歸功於存在主要抗細菌的肉桂醛、丁香酚、冰片、芳樟醇（linool)和 麝香草酚，以及主要抗真菌的鄰-甲基肉桂醛。
[0008] 對於用於至少減少抑制細菌與人和哺乳動物細胞的粘附和用於減少或抑制致病 性細菌入侵和感染人和哺乳動物細胞的營養和治療組合物以及方法仍然存在著需求。以下 描述的本發明包括這樣的組合物和方法，它們與相關技術的組合物和方法不同。


【發明內容】

[0009] 因此本發明的一個目的是提供一種製備自經酶處理的來自美洲蔓越橘 (VicciniumMacrocarpon)的蔓越莓花萼的組合物，其至少減少微生物與具有用於粘附的 a-Gal-(1_4)-Gal末端低聚糖受體的細胞的粘附。
[0010] 本發明的另一個目的是提供一種製備自經酶處理的來自美洲蔓越橘的蔓越莓花 萼的組合物，其中所述組合物包含乙醯化、富含中性糖的多糖，所述多糖的重均摩爾質量為 約10. 2X103±2. 0Da，Z平均流體力學半徑為約2. 0±0. 2nm，重量-平均特徵粘度為約 0. 048±0. 0001dL/g。
[0011] 本發明的又另一個目的是提供一種用於防止細菌與具有用於粘附的 a-Gal-(1-4)-Gal末端低聚糖受體的細胞的粘附的方法，其中將具有乙醯化、富含中性 糖的多糖的組合物施用於具有用於粘附的a-Gal-(1_4)-Gal末端低聚糖受體的細胞，所 述多糖的重均摩爾質量為約10. 2X103±2.ODa，Z平均流體力學半徑為約2. 0±0. 2nm，重 量-平均特徵粘度為約〇.〇48±0.001dL/g。
[0012] 從下面的描述本發明的其他目的和有益效果將是顯而易見的。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0013] 圖1為顯示蔓越莓級分的低聚糖分析的圖。木葡聚糖低聚糖的DP在每個峰的上 方指示。
[0014] 圖2為蔓越莓的A6級分的MALDI-T0F質譜掃描。
[0015] 圖3六和8為111/^ = 1055.32〇\)的串聯嫩0)1-1'0卩譜和111/^ = 1217.37(8)的串 聯MALDI-T0F譜。
[0016] 圖4和圖4插圖為基於MALDI-TOF/TOFMS.的木葡聚糖碎片的圖。
[0017] 圖5A-C是級分A6的NMR譜。
[0018] 圖6為顯示來自美洲蔓越橘的蔓越莓級分的抗粘附活性的圖。

【具體實施方式】
[0019] 本發明提供了一種使用美洲蔓越橘由蔓越莓花萼經酶處理的組合物製備的組合 物。本發明的組合物包含合適的載體和有效量的作為活性成分的分離的抗微生物粘附抑制 性級分，所述組合物用作減少或抑制微生物與具有用於粘附的a-Gal-(1_4)-Gal末端低 聚糖受體的細胞的粘附的藥劑。
[0020] 分離的粘附抑制性級分被命名為A6且表徵為：A6包含乙醯化、富含中性糖的多 糖，其重均摩爾質量為約10.2X103±2Da，Z平均流體力學半徑為約2.0±0.2nm，重量-平 均特徵粘度為約〇. 〇48±0. 001dL/g。A6的單糖組成主要為葡萄糖、阿拉伯糖和木糖以及存 在非常少的半乳糖醛酸和鼠李糖，這指示多糖片段是半纖維素並且可能是木葡聚糖。
[0021] 本發明的組合物可以通過口服施用於患者。通常分離的抗微生物粘附抑制性級分 的濃度是減少細菌細胞與哺乳動物細胞，尤其是人細胞粘附的量，對其的確定在本領域技 術人員的能力範圍內。
[0022] 鑑於發明的目的，以下為下文使用的某些術語的定義。
[0023] 當在說明書和權利要求書中使用時，除非上下文另外明確指示，否則單數形式 "一個"，"一種"，和"該"包含複數指代物。比如，術語"一個細胞"包括多個細胞，包括其 混合物。
[0024] 當在本文中使用時，蔓越莓被理解為美洲蔓越橘。
[0025] 術語木葡聚糖用於描述一組被稱作半纖維素的多糖。木葡聚糖含有1，4-連接的 0 -D-吡喃葡萄糖基殘基的骨架，在1，4-連接的-D-吡喃葡萄糖基殘基中04處於赤道方 位。
[0026] 當在本文中使用時，術語分離的、純化的或生物純的，是指基本上或實質上不含當 以其天然狀態存在時正常與其共存的組分的材料。在一個示例性實施方案中，純度和均質 性使用分析化學技術如聚丙烯醯胺凝膠、電泳、或高效液相色譜來測定。
[0027] 當在本文中使用時，術語病原體是指非有益細菌、病毒、真菌、單細胞或多細胞寄 生蟲，例如大腸桿菌，如產維羅毒素的大腸桿菌（VTEC)，腸道致病性大腸桿菌（EPEC)，產腸 毒素的大腸桿菌（ETEC)，或聚集性大腸桿菌（EAggEC)，金黃色葡萄球菌，耐甲氧西林金黃 色葡萄球菌（MRSA)，艱難梭菌，硫酸鹽還原細菌如脫硫弧菌（Desulfovibriosp.)，例如，脫 硫脫硫弧菌（Desulfovibriodesulfuricans)或Desulfovibriopiger〇
[0028] 當在本文中使用時，術語"控制"，或"控制的"，如在例如下列短語：大腸桿菌的 控制，控制大腸桿菌，控制大腸桿菌菌群，或控制大腸桿菌感染或任何語法上等同的表述 中，是指用於預防感染或侵襲，減少或消除已感染區域或有機體的群體，或消除大腸桿菌或 期望進行控制的其他物種的群體的任何手段。如本文所用的控制是指成功預防、消除、減少 或改善大腸桿菌、大腸桿菌感染或大腸桿菌菌群的任何指示。
[0029] 本發明的藥物、營養或藥學組合物被定義為具有本發明的至少一種活性成份和適 當的載體的組合物。適當的載體被定義為不會引起對活細胞或生物體明顯刺激且不消除施 用的本發明的活性成分的生物活性和特徵的任意物質。
[0030] 當在本文中使用時，治療有效量是指引發期望生物反應所必須的量。如本領域普 通技術人員所理解的，生物活性劑的有效量可以根據諸如下面的因素變化，所述因素如期 望的生物終點、待遞送的生物活性劑、包封基質的組成、靶組織等。
[0031] 當在本文中使用時，術語"級分"意指來自蔓越莓花萼經酶處理的濃縮物的任意 HPLC洗脫級分，所述HPLC洗脫級分能夠控制在活生物體或活細胞群中的的大腸桿菌菌群。
[0032] 術語"尿路感染"或"UTI"是指影響尿路的任何部分的細菌感染。當細菌進入膀 胱或腎臟並於尿中繁殖時，它們引起UTI。UTI的最常見類型是膀胱感染，其也稱膀胱炎。
[0033] 術語粘附是指細菌通過細菌表面上的粘附分子與彼此，與其他細胞表面，和與非 細胞表面的總體聚集。
[0034] 除非以其他方式定義，本文所用的所有技術和科學術語具有與本發明所屬領域的 普通技術人員所普遍理解的相同含義。術語"約"定義為加或減10%;例如約100°F意指 從90°F到110°F。儘管與本文所述的那些類似或等效的任何方法和材料可以用於實施 或測試本發明，但現在描述優選的方法和材料。
[0035]P-傘狀粘附分子特異性地結合於一組被確認為P-血型抗原的受體。這種受 體存在於多種類型的人細胞，如尿道上皮細胞和紅細胞的表面上，其介導細菌的附著以 及隨後在尿道上皮的定植。P-傘狀大腸桿菌導致人紅細胞（RBC)聚集（HA)(Ofeck和 Doyle，BacterialAdhesiontoCellsandTissues,ChapmanandHall,Ltd.,Lond on，357-365, 1994)。
[0036] 本發明提供一種用於通過施加處於合適的載體中的減少細菌粘附量的分離的被 命名為A6的粘附抑制性級分來至少減少細菌的粘附的藥物、營養或藥學組合物和方法。這 種組合物可以以適合於治療的多種方式給藥。活性成份，A6可以單獨給藥或作為與在藥學 上可接受的載體、稀釋劑、輔料和媒介物組合的活性成份。組合物一般通過口服給藥。常規 方法，如將化合物作為片劑、混懸劑、溶液劑、乳劑、膠囊劑、粉劑、糖漿劑等施用是可用的。 用於經口或靜脈內遞送抗粘附組合物並保留生物活性的已知技術是優選的。可以經皮下、 局部或胃腸外或鞘內給藥的製劑和輸注技術以及栓劑和植入物也在本發明的考慮當中。
[0037] 藥學上可接受的載體、稀釋劑、輔料和媒介物以及植入物載體一般是指惰性的、無 毒的固體或液體填料、稀釋劑，或不與本發明的活性成份反應的包封材料。適用於注射的藥 物製劑包括無菌水溶液或分散體和用於重構成無菌注射溶液或分散體的無菌粉末。載體可 為溶劑或分散介質，包含例如水，乙醇，多元醇如甘油丙二醇、液體聚乙二醇等，及其適合的 混合物和植物油。
[0038] 適當的流動性可以通過使用如卵磷脂的塗層，在分散體的情況下通過維持所需的 粒度以及通過使用表面活性劑來保持。非水性媒介物如棉籽油，芝麻油，橄欖油，大豆油，玉 米油，向日葵油，或花生油和酯，如肉豆蔻酸異丙酯也可被用做用於複合組合物的溶劑。另 夕卜，可以添加增強組合物的穩定性、無菌性和等滲性的各種添加劑，包括抗菌防腐劑、抗氧 化劑、螯合劑和緩衝劑。通過各種的抗細菌劑和抗真菌劑，如對羥基苯甲酸酯、三氯叔丁醇、 苯酚、山梨酸等，可以確保阻止微生物的作用。可能合乎需要的是包括等滲劑，比如糖、氯化 鈉等。可注射藥物形式的長效吸收可以通過使用延緩吸收的藥劑，如單硬脂酸鋁、明膠等 來產生。使用的任何媒介物、稀釋劑或添加劑必須能與本發明的抗微生物粘附性級分A6配 伍。對遞送系統的選擇也在本領域普通技術人員的能力範圍內。
[0039] 對在本發明的抗微生物粘附抑制性級分A6中的木葡聚糖的鑑定通過使用碳水化 合物分析、高效尺寸排阻色譜法、MALDI-TOF/TOFMS和核磁共振光譜法進行。本發明的活性 木葡聚糖製劑被命名為抗微生物粘附級分A6,其包括以SSGG結構為優勢嵌段序列的阿拉 伯糖-木葡聚糖。這是首個具有這種類型的木葡聚糖結構的杜鵑花目成員，但僅是在此目 之下被表徵有木葡聚糖的第二種植物。一種新的木葡聚糖七糖被表徵為SSG和GSS低聚糖 結構。在蔓越莓MALDI-TOFMS譜中SSG/GSS木葡聚糖七糖和SSGG木葡聚糖八糖是最豐富 的離子。NMR確認了利用質譜法闡明的蔓越莓木葡聚糖結構。蔓越莓木葡聚糖低聚糖在阻 斷尿路致病性大腸桿菌和產維羅毒素大腸桿菌菌株與人上皮細胞的粘附方面是有活性的。
[0040] 用於從蔓越莓中分離抗微生物粘附級分A6的方法包括用Klerzymel50果膠酶 (DSM FoodSpecialities)或該酶家族中其他等效的果膠酶處理蔓越莓花萼的步驟。處理 典型地是在100-140° F的範圍內進行水果脫果膠。用於30-45min脫果膠過程的用量為 大約為0. 035至0. 055重量％ (即每100鎊水果用0. 035-0. 055鎊酶），並且這可根據對 蔓越莓脫果膠期間時間或酶量的變化進行調整。碎片和其他顆粒物經傾析、離心或其他相 似方法除去。然後液體經噴霧乾燥產生蔓越莓粉末並產生級分Al。A1的分級分離是利 用BiotageFLASH-40系統完成的，系統改為接收裝有SNAPKP-C18-HS12g樣品的Biotage SNAPKP-C18-HS120g柱。約20克級分A1溶解在約200ml去離子水（DI)中。約50ml(±5g) 的溶液加樣到預平衡的C18-柱中（柱子用約300ml甲醇洗脫接著再用約300mlDI水洗 脫）。分級分離是從先用約500mlDI水洗脫柱子開始，接著用約500ml約15%甲醇/水（V/ V)混合物洗脫柱子（流速為約35ml/min)，以產生級分A2。殘留的酚類內容物用約500ml 甲醇從柱子中洗去。柱子通過在再次加樣更多的A1溶液（約50ml)前，用約500mlDI水 洗滌進行再次平衡。這個過程重複總計4次並且混合約15%甲醇/水的各部分以製備級 分A2。乾燥級分A2 ;首先在真空狀態（BuchiLaboratoryEquipment)下去除甲醇，接著冷 凍乾燥水性溶液以產生約4. 97g粉紅色粉末。使用示差折光檢測對A2進行分析，觀察到從 HPX-87CHPLC柱中在約6. 7min時洗脫的一個未知的峰。使用S印hadexLH20柱層析對級 分A2作進一步純化以消除殘留的酚類色素。故將級分A2 (約4. 8g)溶解在約60mlDI水 中，將混合物加樣至45X300mm的S印hadexLH20柱中（用約500mlDI水預處理）。柱子 用約500mlDI水洗脫得到純化的級分A6 (使用MasterflexL/S泵-型號為7014-52,流速 約為2. 5ml/min)。殘留的酚類內容物用約75%丙酮/水溶液（約500ml)從柱子中洗去。 級分A6經冷凍乾燥得到約4. 32g灰白色結晶粉末（含粉紅色的痕跡）。
[0041] 實施例1
[0042] 聚合度（DP)約為7?9的木糖葡萄糖低聚糖購自於Megazyme(伯雷，愛爾蘭）。 蔓越莓花萼經酶處理的命名為A1的濃縮級分是在蔓越莓脫果膠過程中使用Klerzyme150 果膠酶〇)SMFoodSpecialties)生產的。經C18快速色譜法對A1的分級分離產生約15% 甲醇級分（A2)。在A2級分中觀察到一個未知的峰，此峰是使用示差折光檢測從HPX-87C HPLC柱在約6. 7m/in時洗脫出來的。存在與A2相關的粉紅色，利用LH20凝膠柱色譜將 其減少以消除酷類色素，產生A6。詳細地，蔓越莓花萼用Klerzyme150果膠酶（DSMFood Specialties)或這個酶家族中的其他等效果膠酶處理。處理典型地是在約100?140°F 的範圍內進行水果脫果膠。用於約30-45min脫果膠過程的用量為大約為0. 035至0. 055重 量％ (即每100鎊水果用0. 035-0. 055鎊酶），並且這可由對該方法了解的人根據時間或酶 的量的變化進行調整。碎片和其他顆粒物經傾析、離心或其他相似方法除去。然後液體經噴 霧乾燥產生蔓越莓粉末級分AUA1的分級分離是利用BiotageFLASH-40系統完成的，系統 改為接收裝有SNAPKP-C18-HS12g樣品的BiotageSNAPKP-C18-HS120g柱。A1 (約 20 克）溶解在約200ml去離子水（DI)中。約50ml(±5g)的溶液加樣到預平衡的C18-柱中 (柱子用約300ml甲醇洗脫接著再用約300mlDI水洗脫）。分級分離是從先用約500mlDI 水洗脫柱子開始，接著用約500ml約15%甲醇/水（V/V)混合物洗脫柱子（流速為約35ml/ min)，以產生級分A2。殘留的酚類內容物用約500ml甲醇從柱子中洗去。柱子通過在再次 加樣更多的A1溶液（約50ml)前，用約500mlDI水洗滌進行再次平衡。這個過程重複總 計4次並且混合約15%甲醇/水的各部分以製備級分A2。乾燥級分A2 ;首先在真空狀態 (BuchiLaboratoryEquipment)下去除甲醇，接著冷凍乾燥水性溶液以產生約4. 97g粉紅 色粉末。使用示差折光檢測對A2進行分析，觀察到從HPX-87CHPLC柱中在約6. 7min時洗 脫的一個未知的峰。使用SephadexLH20柱層析對級分A2作進一步純化以消除殘留的酷 類色素。因此，將級分A2 (約4. 8g)溶解在約60mlDI水中，將混合物加樣至45X300mm的S印hadex LH20柱中（用約500mlDI水預處理）。柱子用約500mlDI水洗脫得到純化的 級分A6(使用Masterflex L/S泵-型號為7014-52,流速約為2. 5ml/min)。殘留的酚類內 容物用約75%丙酮/水溶液（約500ml)從柱子中洗去。級分A6經冷凍乾燥得到約4. 32g 灰白色結晶粉末（含粉紅色的痕跡）。
[0043] 中性糖含量（NS)，半乳糖醛酸含量（GA)，酯化程度（DE)和乙醯化程度（DA)如以 前報導那樣測定（Fishman等2008)，除了NS(葡萄糖標準品）用作DA的基準而非GA。根據 以前報導的程序（Zhao等，AlternativeTherapies，卷14, 34-38, 2008)，通過高效陰離子 交換色譜-脈衝安培檢測（HPAEC-PAD)接著進行甲醇分解來進行單糖分析。根據Rhoades 等2008,見前報導的程序，也通過HPAEC-PAD分離未水解的低聚糖。
[0044] 利用高效尺寸排阻色譜來進行對通過市售果膠酶處理蔓越莓花萼得到的A1級分 的碳水化合物分析。約10_20mg/ml的蔓越莓樣品溶解在含有約0. 05MNaN03和約0. 01% NaN3的流動相中，置於冷室中攪拌過夜，在約50, 000g轉速下離心約lOmin且通過約0. 22或 0. 45微米MillexHV濾器（Millipore公司，貝德福德，MA)過濾。用於溶劑遞送系統，1000 型串聯脫氣器，自動採樣器和泵（Agilent公司）的流速設置約為0.7mL/min。注射容量約 為200yL。樣品一式三份地測試。柱子組由1個PLAquagel0H-40與2個0H-30尺寸排 阻柱（PolymerLaboratories,Amherst,MA)串聯構成。柱子的溫度在設定在約35°C的水浴 中進行控制。柱流出液用與ViscostarII型差壓粘度計（DPV)(WyattTechnology,Santa Barbara,CA)和OptilabrEX幹涉儀（RI)(WyattTechnology)串聯的HELEOSII多角度激 光散射光度計（MALLS)(WyattTechnology,SantaBarbara,CA)檢測。來自這3個探測器 的電子輸出由ASTRA?軟體（WyattTechnology)處理。
[0045] 對通過市售果膠酶處理蔓越莓花萼得到的A1級分的碳水化合物分析包含高甲氧 基果膠片段和大量的富含中性糖的物質（表1)。A2級分通過甲醇洗脫從反相HPLC柱中由 A1得到。明顯地，甲醇並不能完全從此級分中除去，因為A6的甲醇明顯多於果膠甲酯理論 上可能的量（表1)。大多數純化的蔓越莓級分（A6)由乙醯化的、富含中性糖且重均摩爾質 量約為10, 200Da的多糖構成（表2)。z-平均流體力學半徑和重量-平均特徵粘度與A6 的低分子量保持一致（表2)。A1和A2分子量值也比大多數多糖要低，但A6的分子量是3 種蔓越莓級分中最低的。
[0046] 表1.蔓越莓級分的碳水化合物分析（摩爾％ ).

【權利要求】
1. 一種抗微生物粘附的組合物，包含有效量的分離自蔓越莓的抗微生物的粘附抑制性 級分A6作為活性成分，其中所述分離的級分含有乙醯化、富含中性糖的多糖，所述多糖的 重均摩爾質量為約10. 2X103±2. ODa，Z平均流體力學半徑為約2. 0±0. 2nm，重量-平均 特徵粘度為約〇. 〇48±0. 0001dL/g，且具有對尿路致病性菌和產維羅毒素菌有粘附抑制活 性，其中所述有效量至少降低細菌與具有用於粘附的a -Gal-(1_4)-Gal末端低聚糖受體 的細胞的粘附。
2. -種用於減少細菌與具有用於粘附的a -Gal-(1-4)-Gal末端低聚糖受體的細胞的 粘附的方法，包括對所述細胞施用有效量的分離自蔓越莓的抗微生物的粘附抑制性級分A6 作為活性成分，其中所述分離的級分含有乙醯化、富含中性糖的多糖，所述多糖的重均摩爾 質量為約10. 2X103±2. 0Da，Z平均流體力學半徑為約2. 0±0. 2nm，重量-平均特徵粘度 為約0. 048±0. 0001dL/g，且對尿路致病性菌和產維羅毒素菌有粘附抑制活性，其中所述有 效量至少降低細菌與具有用於粘附的a -Gal-(1_4)-Gal末端低聚糖受體的細胞的粘附。
【文檔編號】A61K31/716GK104507485SQ201380032460
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2013年5月22日 優先權日:2012年5月25日
【發明者】阿蘭·T·霍奇斯基, 阿爾伯託·努涅斯, 克裡斯蒂娜·邱, 加裡·D·斯特拉恩 申請人:美利堅合眾國（由農業部長代表）, 優鮮沛蔓越莓公司