能與LOX-1結合的Hsp60片段、其衍生物及應用的製作方法

2023-10-05 19:10:24 10

專利名稱：能與LOX-1結合的Hsp60片段、其衍生物及應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及分子生物學和免疫學領域。更具體地說，L0X-1作為一個Hsp60家族 的共同受體，可通過識別Hsp60的C末端介導Hsp60的結合和內化。而Hsp60的C末端與 抗原融合能夠通過與L0X-1的結合和隨後的內化提高抗原的免疫效果
背景技術：
Sawamura 等(Nature 386(6620) 73-7)於 1"7 年使用氧化低密度脂蛋 白(oxidizedlow-density lipoprotein, οχ-LDL)作為誘館篩選單一牛主動脈內皮 cDNA文庫，首次克隆到ox-LDL的受體，即Lox-I (凝集素樣氧化低密度脂蛋白受體_1， Lectin-Iikeoxidized LDL receptor-1) 人的Lox-I含有273個胺基酸殘基，含有四個潛 在的糖基化位點，其相應的表達蛋白相對分子質量為42kDa。研究表明，Lox-I是一種II型單次跨膜的糖蛋白，含有單個的C型凝集素樣結構 域；按結構來分類，它屬於非經典的C型凝集素家族；然而，由於L0X-1能識別氧化低密度 脂蛋白，從功能角度而言，它又被認為是一種清道夫受體(scavengerrec印tor type Ε)。 Lox-I的頸部含有一個半胱氨酸殘基，在細胞表面以二聚化或多聚化形式發揮其生物。它在 位於胞漿中的尾部有多個潛在的磷酸化位點，如Thr2，它們的磷酸化可能參與了 Lox-I的 所介導的細胞信號轉導及其生物學功能。儘管Lox-I胞內尾部缺失保守的信號基序，但它仍可以引發很多細胞效應，如配 體內化、NF-κ B激活、凋亡以及呼吸爆發、細胞因子的產生。在樹突細胞中，在單核細胞中， ox-LDL能夠激活MAPK(mitogen activated protein kinases)信號通路，從而增強其與血 管內皮細胞的黏附功能，這種效應可以被Lox-I的反義脫氧寡核苷酸所抑制。此外，血管內皮細胞表面的Lox-I能夠作為血小板的黏附分子，當血管內皮損傷 時，能夠導致更易凝血和血小板的黏附。最近的研究表明，ox-LDL與其受體Lox-I結合 以後，能夠激活ROS酶源，從而引發自由基信號途徑，導致了 NF-κ B的活化。其中，ROS是 NF- κ B特異性信號途徑共同的下遊信號信使，ROS生成是NF- κ B激活這個鏈反應的早期事 件，NF- κ B的激活伴隨著ROS的生成，同時伴有NO生成量的降低。Lox-I可以結合、內化、降解ox-LDL，但並不能識別天然的LDL或乙醯化的LDL。並 且Lox-I與ox-LDL結合是特異性的，此過程可有效地被多聚肌苷酸(polyinosinic acid) 及卡拉膠(Carrageenan)所抑制，但並不被巖藻多糖或甲基化牛血清白蛋白所抑制。L0X-1 是與ox-LDL上的蛋白部分相結合，並不能完全排除其與載脂蛋白BlOO的脂質部分結合的 可能性。此外，L0X-1還能識別並內化衰老/凋亡細胞、紅細胞和活化的血小板、革蘭氏陽性 /革蘭氏陰性細菌等，在維持機體的自穩狀態和抵禦外來病原體過程中發揮著重要作用。因此，篩選L0X-1的新的配體分子，為研究L0X-1在免疫系統中的功能以及進一步 闡明它們的信號傳導機制奠定基礎，並為以L0X-1為藥物靶點的藥物開發提供理論基礎。Hsp60在進化上是高度保守的蛋白質之一，在體內廣泛表達，參與細胞內蛋白質的 摺疊，阻止蛋白質的聚集，對於細胞的生存是必需的。在哺乳動物中，Hsp60定位在線粒體 內，在外界環境的壓力下，包括應激和病態條件等，Hsp60可以易位到胞漿、細胞膜，還可以分泌到細胞外；在外界損傷的情況下，細胞壞死也可以釋放大量的Hsp60。在健康人體的血 漿中，存在著低水平的Hsp60，隨著年齡的升高，Hsp60水平逐漸下降。但在高血壓，動脈粥 樣硬化，糖尿病以及內風溼性關節炎等疾病中，血漿水平的Hsp60明顯升高。
近年來研究表明Hsp60在自身免疫性疾病及慢性感染等的發病中均發揮重要的 調節作用。在應激狀態下，包括感染等，Hsp60過表達或異位表達可以作為一種自身抗原被 免疫系統識別，誘發機體的保護性免疫應答，促進機體的免疫學功能。另外，在細胞受到外 界刺激導致細胞壞死也可以釋放大量Hsp60到血漿中，以及Hsp60可以通過一些未知的分 泌途徑分泌到血漿中，這些可溶性的Hsp60能夠調節固有免疫和獲得性免疫，從而調節機 體的免疫功能。這種血漿中的Hsp60在機體中發揮著一種調節免疫的作用，因此通常可把 血漿中的Hsp60作為一種危險信號。在固有免疫系統中，Hsp60能夠激活促炎症細胞因子(包括TNF-α、IL_12等)產 生，同時激活細胞表面共刺激分子(如CD80、CD86)的表達，促進抗原呈遞細胞的成熟等。 在獲得性免疫系統中，Hsp60能夠降低T細胞的趨化功能，增強T細胞的黏附。特別在T調 節細胞中，Hsp60能夠促進T調節細胞的增殖，提高IL-10、TGF-li3的分泌，從而調節炎症 的發生發展。因此專家推測，HspBO可能作為一種細胞因子，能夠調節機體的免疫功能。Hsp60激活自身免疫系統作為它的新功能，具有非常廣泛的功能重要性，然而對它 發揮功能的機制目前尚不清楚。Hsp60的細胞因子效應可能是通過TLR-2/4受體發揮其功 能的，進而激活NF-K B的轉錄活性，促進抗原遞呈細胞的成熟以及細胞因子的產生。然而， 越來越多的證據表明，在抗原遞逞細胞表面，存在Hsp60的吞噬受體，並且該受體發揮了重 要的生物學功能，但是目前還沒有被鑑定。為了更進一步的對Hsp60的免疫調節功能的研究，鑑定免疫學細胞上的Hsp60受 體顯得非常必要。Hsp60受體的鑑定，將為闡明Hsp60在自身免疫性疾病中的生物學功能以 及以Hsp60作為免疫佐劑或自身免疫性疾病治療藥物的研究提供必要的理論基礎。綜上所述，本領域迫切需要對L0X-1的新的配體分子進行篩選和對Hsp60的受體 進行鑑定，從而為藥物靶點的開發提供基礎。

發明內容
本發明的目的之一就是揭示L0X-1與Hsp60之間的關係，通過本發明證實了 L0X-1是Hsp60家族的共同受體，其通過識別Hsp60的C末端介導Hsp60的結合和內化。本 發明的另一目的是提供L0X-1結合結構域(即Hsp60的C末端)在提高Hsp60C末端與抗 原的融合蛋白的免疫效果中的用途。在本發明的第一方面中，提供了一種融合蛋白，其包含(A)含熱休克蛋白Hsp60 的C末端序列的肽段；⑶活性肽段；和(C)任選的位於㈧和⑶之間的連接肽。在一個優選例中，所述(C)是長度為0-50個胺基酸，優選2-30個胺基酸，更優選 4-20個胺基酸的連接肽。在一個優選實施方式中，該融合蛋白中的部分(A)是選自下組的肽段(i)SEQ ID NO :2、SEQ ID NO 4 或 SEQ ID NO 6 所示的胺基酸序列；(ii)全長 Hsp60;(iii)在(i)或(ii)限定的胺基酸序列中經過取代、缺失或添加一個或幾個胺基酸，且能結合LOX-I並被L0X-1介導內化的由⑴或(ii)衍生的胺基酸序列；或
(iv)與(i) (iii)中任一項所述多肽同源、且能結合L0X-1並被L0X-1介導內 化的胺基酸序列。在一個優選例中，(A)包含一個或多個含熱休克蛋白Hsp60的C末端序列的肽段， 優選所述多個含熱休克蛋白Hsp60的C末端序列的肽段為相同肽段的重複序列。在本發明的另一個實施方式中，所述(A)是由選自下組的核苷酸序列編碼的(a) SEQ ID NO =USEQ ID NO :3、SEQ ID NO 5 序列或 Hsp60 的全長序列；(b)與(a)中序列同源的序列；或(c)在嚴格條件下與(a)或(b)限定的序列雜交、且能結合L0X-1並被L0X-1介導 內化的活性分子。在另一個實施方式中，所述(B)是具有選自下組的一種或多種活性的肽段抗原 遞呈、抗腫瘤、免疫調節、抗感染、促進細胞成熟、和促進細胞因子分泌。在一個優選例中，所述肽段選自所述⑶選自腫瘤抗原(優選Mucin I或 NY-ES0-1)、微生物抗原(優選HBsAg、HPV抗原E6、或HPV抗原E7)，優選腫瘤抗原Mucin I 或它們的活性片段。在本發明的第二方面中，提供了一種分離的核酸分子，其編碼本發明的融合蛋白。 在本發明的另一個方面還涉及含有所述核苷酸序列的載體以及宿主細胞。 在本發明的第三方面中，提供了 一種複合物，所述複合物包含與熱休克蛋白Hsp60 的C末端結合的L0X-1。在一個優選例中，所述複合物包含(I)含熱休克蛋白Hspeomc 末端序列的多肽或蛋白質；和(II)與熱休克蛋白Hspeo的C末端結合的L0X-1。在一個優選例中，所述⑴是選自下組的多肽或蛋白質(i)SEQ ID NO :2、SEQ ID NO 4 或 SEQ ID NO 6 所示的多肽；(ii)全長 Hsp60;(iii)在(i)或(ii)限定的胺基酸序列中經過取代、缺失或添加一個或幾個氨基 酸，且能結合L0X-1並被L0X-1介導內化的由⑴或(ii)衍生的胺基酸序列；或(iv)與(i) (iii)中任一項所述多肽同源、且能結合L0X-1並被L0X-1介導內 化的胺基酸序列。在一個優選例中，所述L0X-1通過具有SEQ ID NO :15所示序列的結合結構域或其 同源序列(例如具有90%以上(如90、95、98或99% )同源性的同源序列)與熱休克蛋白 Hsp60的C末端結合。在另一個優選例中，所示L0X-1的結合結構域由SEQ ID NO 14的核苷酸序列或其 同源序列(例如具有90%以上(如90、95、98或99% )同源性的同源序列)編碼。在一個優選例中，所述熱休克蛋白Hsp60是哺乳動物來源的Hsp60或微生物來源 的Hsp60，優選所述Hsp60是人的Hsp60、細菌的GroEL或牛結核桿菌的Hsp65。在本發明的一個實施方式中，所述L0X-1通過L0X-1的結合結構域與所述熱休克 蛋白Hsp60的C末端結合。 在一個優選例中，所述L0X-1是全長L0X-1或L0X-1胞外段(如aal40_273)。
在本發明的另一個實施方式中，所述熱休克蛋白Hsp60和/或L0X-1還連接或融 合有其它活性蛋白或多肽。
在一個優選例中，所述其它活性蛋白或多肽具有抗原遞呈、抗腫瘤、免疫調節、抗 感染、促進細胞成熟、和/或促進細胞因子分泌的活性。在另一優選例中，所述其它活性蛋白或多肽選自腫瘤抗原Mucin I或來自於微 生物或病毒的抗原，優選腫瘤抗原Mucin I。在本發明的第四方面中，提供了一種組合物，所述組合物包含 (A)有效量的選自下組中的一種或多種本發明的融合蛋白、編碼本發明融合蛋 白的分離的核酸分子或含有該核酸分子的載體或宿主細胞、本發明的複合物、Hsp60的C末 端多肽或其編碼序列、全長Hsp60或其編碼序列；和(B)藥學上、免疫學上或保健品學上可接受的載體。在本發明的第五方面中，提供了本發明的融合蛋白、編碼本發明融合蛋白的分離 的核酸分子或含有該核酸分子的載體或宿主細胞、本發明的複合物、Hsp60的C末端多肽或 其編碼序列、全長Hsp60或其編碼序列的用途，其用於製備調節免疫、抗感染、抗腫瘤、促進 細胞成熟和/或促進細胞因子分泌的組合物。在一個優選例中，所述組合物為保健品、藥物或疫苗。在本發明的第六方面中，提供了 L0X-1多肽、L0X-1的結合結構域或它們的編碼序 列的用途，其用於結合熱休克蛋白Hsp60的C末端。在一個優選例中，所述結合介導了熱休克蛋白Hsp60的內化，從而提高了熱休克 蛋白Hsp60的抗原遞呈、抗腫瘤、免疫調節、抗感染、促進細胞成熟、和/或促進細胞因子分 泌的活性。在本發明的其它方面中，提供了 L0X-1與熱休克蛋白Hsp60聚合物，所述聚合物包 含分離的哺乳動物L0X-1結合的結構域的多肽，其中所述分離的哺乳動物L0X-1結合的結 構域由與SEQ ID No 2或與SEQ ID No 4或與SEQ ID No 6所示的L0X-1結合的結構域 中任一種具有70%以上相同性(例如75%、80%、85%、90% 95% ,98% ,99%^ 100% )的 胺基酸序列組成；或，包含L0X-1結合的結構域的多肽，其中所述的L0X-1結合的結構域由與SEQID No 2或與SEQ ID No :4或與SEQ ID No :6所示的L0X-1結合的結構域中任一種具有70%以上 相同性(例如75%、80%、85%、90%95%、98%、99%或100%)的胺基酸序列組成，條件是 所述多肽不是全長的Hsp60家族的多肽；或，包含SEQ ID No 2或SEQ ID No 4或SEQ ID No 6所示的L0X-1結合的結構域 的多肽中的任一個。在一個實施方式中，所述L0X-1結合的結構域的多肽做了保守性胺基酸置換。在另一個實施方式中，其中分離的哺乳動物L0X-1結合的結構域由SEQ ID No 2 或SEQ ID No :4或SEQ ID No 6中任一種所示的胺基酸序列組成。在另一個實施方式中，所述分離的哺乳動物L0X-1結合的結構域介導抗原遞呈、 細胞的成熟和細胞因子的分泌、調節免疫、抗感染和抗腫瘤功能。在本發明的其它方面中，還提供了一種分離的核酸分子，它包含下列的核苷酸的 一種編碼分離的哺乳動物L0X-1結合的結構域的核苷酸序列，其中所述分離的哺乳動 物L0X-1結合的結構域與SEQ ID No :1(來源於人)或與SEQ ID No :3(來源於大腸桿菌Kl)或與SEQ ID No :5(來源於牛結核桿菌H37Rv)所示的LOX-I結合的結構域其中任何一 個具有70%以上的胺基酸序列相同性；或，編碼分離的哺乳動物L0X-1結合的結構域的核苷酸序列，其中所述的核苷酸序 列在45°C 6XSSC中、然後在50-65°C下用0. 2SSC和0. 1% SDS洗滌一遍或多遍後與編碼 L0X-1結合的結構域的SEQ ID No :1或SEQ ID No :3或SEQ ID No :5所示的核苷酸序列的 任何一個互補序列雜交；或，如SEQ ID No :1或SEQ ID No 3或SEQ ID No 5中所示的編碼分離的哺乳動物 L0X-1結合的結構域的核苷酸序列的任何一種。在一個實施方式中，所述分離的哺乳動物L0X-1結合的結構域由SEQ ID No :1或 SEQ ID No :3或SEQ ID No 5中其中任何一種所示的核酸序列組成。在另一個實施方式中，所述分離的L0X-1結合的結構域介導抗原遞呈，細胞的成 熟和細胞因子的分泌，調節免疫，抗感染和抗腫瘤等中的應用。在另一個實施方式中，所述核酸分子編碼融合蛋白。在本發明的另一方面中，還提供了一種融合蛋白，該蛋白包括由分離的L0X-1結 合的結構域組成的第一多肽和其它的第二多肽。在一個實施方式中，該融合蛋白的第一多肽由分離的L0X-1結合的結構域的一個 或一個以上的重複胺基酸序列組成。本發明還進一步提供了一種載體，它包含本發明的核酸分子。在一個實施方式中， 該載體包含一個或多個重複的本發明的核酸分子。在另一方面，本發明提供了一種介導抗原遞呈，細胞的成熟和細胞因子的分泌，調 節免疫和抗腫瘤功能的方法，該方法包括調節Hsp60多肽或其L0X-1結合的結構域的活性， 或者包括調節Hsp60或其L0X-1結合的結構域的表達。在另一方面，本發明提供了一種鑑定化合物的方法，該化合物調節L0X-1結合的 結構域的介導抗原提成，細胞的成熟和細胞因子的分泌，調節免疫和抗腫瘤功能，該方法包 括使含L0X-1結合的結構域的無細胞混和物與測試化合物接觸；測定測試化合物調節L0X-1結合的結構域的能力，從而鑑定出能調節L0X-1結合 的結構域的介導抗原遞呈，細胞的成熟和細胞因子的分泌，調節免疫和抗腫瘤功能。本發明的其它方面由於本文的公開內容，對本領域的技術人員而言是顯而易見 的。


圖1顯示了 L0X-1和Hsp60_C在酵母中的相互作用。圖2顯示了 L0X-1和Hsp60細胞流式分析的結果。圖3顯示了 L0X-1和Hsp60-C細胞流式分析的結果。圖4顯示了 L0X-1結合和內化Hsp60和Hsp60_C免疫螢光的結果。圖5顯示了 L0X-1作為Hsp60家族共同受體，能夠結合GroEL和Hsp65 (微生物來 源的Hsp60家族成員)的結果。圖6顯示了 Hsp60_C與抗原融合能夠通過L0X-1提高抗原的免疫效果。
圖7顯示了含有L0X-1胞外段的pGADT7質粒的結構示意圖。
具體實施例方式本發明中，發明人通過酵母雙雜交，免疫螢光分析以及細胞流式等實驗證明了 L0X-1是Hsp60家族的共同識別受體，能夠通過識別Hsp60的C末端介導Hsp60的結合和內 化。並且發明人通過進一步的試驗證實了 Hsp60的C末端與抗原融合能夠通過L0X-1提 高抗原的免疫效果。具體而言，本發明人做出了如下獨創性的發現1.證明了 L0X-1通過識別Hsp60的C末段介導Hsp60的結合和內化通過酵母雙雜交篩選，發明人發現Hsp60的C末段(Hsp60-C，aa436-573)，而不是 Hsp60 的 N 末端(Hsp60-N，aa27_152)或 Hsp60 的 AM 結構域(Hsp60_AM，aal53_435)，能夠 與L0X-1胞外段(aal40-273)相互作用，從而對酵母報告基因的表達有很強的激活作用。通 過細胞流式技術和免疫螢光分析，發明人進一步證明了 L0X-1通過識別Hsp60的C末段介 導Hsp60的結合和內化。2.證明了 L0X-1是Hsp60家族一個共同受體通過細胞流式分析和免疫螢光分析，發明人發現，L0X-1除了能夠識別哺乳動物的 Hsp60外，還能識別微生物來源的Hsp60家族成員，包括但不限於細菌的GroEL和牛結核杆 菌的Hsp65。由此證明了，L0X-1能夠作為Hsp60家族的一個共同受體。3.證明了 Hsp60的C末段與L0X-1的結合可提高腫瘤抗原的抗腫瘤作用通過把Hsp60的C末端與腫瘤抗原Mucin I融合(Hsp60_C/Mucin I)，進行免疫 小鼠，我們發現，使用Hsp60-C/MUCin I比單獨使用Mucin I蛋白具有更好的抗腫瘤能力。 使用L0X-1的胞外端多肽阻斷Hsp60-C與L0X-1的結合，明顯抑制Hsp60-C/Mucin I的抗 腫瘤效果，與單獨Mucin I蛋白的抗腫瘤效果沒有明顯差異，表明Hsp60的C末段能夠通過 L0X-1提高腫瘤抗原的抗腫瘤作用。Hsp60、其C末端序列、及它們的編碼序列如本發明中所用，術語「Hsp60」是指本領域中已知的一類熱休克蛋白，其在進化上 高度保守，且可在體內廣泛表達，並介導細胞生存必需的多種反應。該術語不僅包括動物來 源的Hsp60(例如人的全長Hsp60基因及蛋白序列分別如SEQ ID NO 9和10所示)，還包 括諸如微生物等其它生物來源的Hsp60家族成員(如牛結核桿菌的Hsp65)。在本發明中，發明人證明了 Hsp60可被L0X-1所識別，與L0X-1的結合結構域識 另IJ，從而完成Hspeo的內化並在胞內實現或增強Hsp60的各種功能、實現或增強與Hsp60相 連或融合的其它活性多肽或蛋白質的功能。經本發明人研究發現，Hsp60主要通過其C末端與L0X-1結合。所述C末端序列 為例如人Hsp60的第436-573位胺基酸、大腸桿菌的第411-548位胺基酸或牛結核桿菌的 第409-540位胺基酸。本發明中Hsp60蛋白或多肽優選由哺乳動物(優選人)、細菌(如結 核桿菌)等Hsp60基因或其同源基因或家族基因編碼。在本發明中，術語「Hsp60的C末端」、「結合L0X-1的(多肽/Hsp60)序列」、「Hsp60 的活性片段」和「(Hsp60上的結合)L0X-1的結合結構域」可互換使用，均表示實現位於 Hsp60或其同源序列中的與L0X-1結合和內化所需的胺基酸序列或由其衍生的序列。
應理解本發明中所述的Hsp60，還包括它們的變異形式(包括保守性變異多肽)、 或其同源蛋白或多肽、或其活性片段。本發明的蛋白質或多肽或其結合結構域可以是天然 純化的產物，或是化學合成的產物，或使用重組技術從原核或真核宿主(例如，細菌、酵母、 高等植物、昆蟲和哺乳動物細胞)中產生。本發明蛋白質或多肽的變異形式包括(但並不限於)一個或多個(通常為1-50 個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個)氨 基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數個(通常為20個 以內，較佳地為10個以內，更佳地為5個以內)胺基酸。例如，在本領域中，用性能相近或 相似的胺基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質或多肽的功能。又比如，在C末端和/或N 末端添加一個或數個胺基酸通常也不會改變蛋白質或多肽的功能，例如本發明的L0X-1蛋 白質或多肽可包括或不包括起始的甲硫氨酸殘基而仍然具有與L0X-1結合的活性。本領域 技術人員可根據本領域常識和/或常規試驗很容易地確定這些變異方式，而不會影響蛋白 或多肽的活性。在本發明中，「保守性變異多肽」指與Hsp60蛋白或多肽或其結合結構域(例如SEQ ID NO :2(源自人 Hsp60)、SEQ ID NO :4 (源自大腸桿菌 Kl 的 GroEL)或 SEQ ID N0:6(源自 牛結核桿菌H37Rv的Hsp65))的胺基酸序列相比，有至多20個，較佳地至多10個，更佳地 至多5個，最佳地至多3個胺基酸被性質相似或相近的胺基酸所替換而形成多肽。這些保 守性變異多肽最好根據下表進行胺基酸替換而產生
權利要求
一種融合蛋白，其包含(A)含熱休克蛋白Hsp60的C末端序列的肽段；(B)其它活性肽段；(C)任選的，位於(A)和(B)之間的連接肽。
2.如權利要求1所述的融合蛋白，其特徵在於，所述㈧是選自下組的肽段(i)SEQID NO :2、SEQ ID NO 4 或 SEQ ID NO 6 所示的胺基酸序列；(ii)全長Hsp60 ；(iii)在(i)或(ii)限定的胺基酸序列中經過取代、缺失或添加一個或幾個胺基酸，且 能結合L0X-1並被L0X-1介導內化的由(i)或(ii)衍生的胺基酸序列；或(iv)與(i) (iii)中任一項所述多肽同源、且能結合L0X-1並被L0X-1介導內化的胺基酸序列。
3.如權利要求1所述的融合蛋白，其特徵在於，所述(A)是由選自下組的核苷酸序列編 碼的(a)SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO 5 序列或 Hsp60 的全長序列；(b)與(a)中序列同源的序列；或(c)在嚴格條件下與(a)或(b)限定的序列雜交、且能結合L0X-1並被L0X-1介導內化 的活性分子。
4.如權利要求1所述的融合蛋白，其特徵在於，所述(B)是具有選自下組的一種或多種 活性的肽段抗原遞呈、抗腫瘤、免疫調節、抗感染、促進細胞成熟、和促進細胞因子分泌。
5.如權利要求1所述的融合蛋白，其特徵在於，所述⑶選自腫瘤抗原(優選Mucin I或NY-ES0-1)、微生物抗原(優選HBsAg、HPV抗原E6、或HPV抗原E7)、或它們的活性片 段。
6.一種分離的核酸分子，其編碼權利要求1-5中任一項所述的融合蛋白。
7.一種複合物，其包含(I)含熱休克蛋白Hsp60的C末端序列的多肽或蛋白質；和(II)與熱休克蛋白Hsp60的C末端結合的L0X-1。在一個優選例中，所述(I)是選自下組的多肽或蛋白質(i)SEQID NO :2、SEQ ID NO 4 或 SEQ ID NO 6 所示的多肽；(ii)全長Hsp60 ；(iii)在(i)或(ii)限定的胺基酸序列中經過取代、缺失或添加一個或幾個胺基酸，且 能結合L0X-1並被L0X-1介導內化的由(i)或(ii)衍生的胺基酸序列；或(iv)與(i) (iii)中任一項所述多肽同源、且能結合L0X-1並被L0X-1介導內化的胺基酸序列。
8.如權利要求7所述的複合物，其特徵在於，所述複合物還連接或融合有其它活性蛋 白或多肽。
9.一種組合物，所述組合物包含(A)有效量的權利要求1-5中任一項所述的融合蛋白、權利要求6所述的分離的核酸分 子和/或權利要求7-8中任一項所述的複合物；和(B)藥學上、免疫學上或保健品學上可接受的載體。
10.權利要求1-5中任一項所述的融合蛋白、權利要求6所述的分離的核酸、權利要求 7-8中任一項所述的複合物、含Hsp60的C末端序列的多肽或其編碼序列、或全長Hsp60或 其編碼序列的用途，其用於製備調節免疫、抗感染、抗腫瘤、促進細胞成熟和/或促進細胞 因子分泌的組合物。
全文摘要
本發明提供了能與LOX-1結合的Hsp60片段、其衍生物及應用，所述衍生物包括融合蛋白、複合物和組合物等。具體而言，本發明涉及LOX-1作為一個Hsp60家族的共同受體，LOX-1通過識別Hsp60的C末端介導Hsp60的結合和內化的發現。Hsp60的C末端與抗原融合能夠通過LOX-1提高抗原的免疫效果。本發明為進一步研究Hsp60的生物學功能，以及以Hsp60和Hsp60的C末端作為疫苗遞送工具，以LOX-1作為受體靶向在抗腫瘤免疫和抗感染藥物的研究與開發提供了理論依據。
文檔編號A61P37/02GK101967193SQ20101012769
公開日2011年2月9日 申請日期2010年3月19日 優先權日2010年3月19日
發明者惲小婧, 朱海燕, 謝建輝, 顧建新 申請人:上海醫學生命科學研究中心有限公司