一種桔青黴的固定化方法

2023-10-06 00:00:39

一種桔青黴的固定化方法
【專利摘要】本發明公開了一種桔青黴的固定化方法，以經過預處理的纖維材料作為固定化介質，將核酸酶P1的生產菌株桔青黴活化後接入發酵容器中培養24～60h，使菌株在培養過程中吸附於纖維材料上。本發明中，固定化細胞所用的纖維材料經過了相應的預處理過程，其作為固定化材料成本低、無毒、易得、製備過程簡單，適合大規模生產。經過預處理的纖維材料具有較高的孔隙率和比表面積，因此單位體積固定的細胞數目多，保證了高密度發酵的優勢，而且具有良好的傳質性能，並縮短了發酵周期。
【專利說明】一種桔青黴的固定化方法
【技術領域】
[0001]本發明屬於工業生物【技術領域】，涉及桔青黴的固定化方法。
【背景技術】
[0002]核酸酶Pl是具有重要應用價值的酶製劑，主要催化特性為裂解RNA和DNA中的3』，5』 -磷酸二酯鍵，生成5』 -核苷酸以及在低溫環境下分解單核苷酸和寡核苷酸中的3』-磷酸單酯鍵，是核苷酸工業生產中必不可少的原料。核酸酶Pl的生產通常採用固體或液體發酵。固體發酵簡便、成本低，但佔地面積大、生產效率低，而且產生的分生孢子易汙染環境。深層發酵避免了上述缺點，但成本較高。
[0003]隨著固定化技術的快速發展，現該技術已廣泛應用於生物發酵領域。將桔青黴菌絲體固定在谷梗或其他一些惰性材料上，重複使用，既降低了發酵液粘度，利於氧氣及營養物質的傳遞，提高了細胞利用率和生物反應速率，同時也便於產物的分離提取等後處理加工。近年來，核酸酶Pi的固定化發酵生產得到了越來越多的關注。
[0004]目前應用於桔青黴的固定方法常見的有吸附法和包埋法。夏黎明等利用吸附固定在多孔聚酯載體上的桔青黴菌絲生產核酸酶，酶活可高達513U/mL，其產酶效率是游離菌絲的3.6倍，連續生產28批，產酶水平沒有下降，平均酶活達到507U/mL。王克明等先使用玉米芯顆粒吸附桔青黴孢子，再用質量分數為1.5%的海藻酸鈉包埋吸附固定化細胞玉米芯顆粒,於搖瓶中培養50h後，發酵液中核酸酶Pl的活力高達503U/mL，並經過了 30批次連續重複發酵產酶穩定在較高水平。宋威等採用聚乙烯醇與海藻酸鈉比例為2:I的複合載體固定桔青黴的孢子，連續發酵20個周期後，生產的核酸酶酶Pl活力損失不大，始終保持在468~501U/mL。但是，為了更 進一步提高核酸酶Pl的生產效率，簡化生產工藝，降低生產成本，仍需要尋找更加天然、高效的固定化材料。
[0005]近年來，以纖維材料作為固定化介質的纖維床生物反應器作為一種新型固定化方法受到了廣泛關注。用纖維材料做固定材料，不僅工藝穩定，無毒，廉價易得，吸附效果好，重複使用率高，而且對細胞活性具有較好的保護作用，但目前為止纖維材料作為固定材料而應用於核酸酶Pl的發酵卻鮮有報導。

【發明內容】

[0006]本發明所要解決的技術問題是提供一種穩定高效的桔青黴的固定化方法。
[0007]為解決上述技術問題，本發明採用的技術方案如下:
[0008]一種桔青黴的固定化方法，以經過預處理的纖維材料作為固定化介質，將核酸酶Pl的生產菌株桔青黴活化後接入發酵容器中培養24~60h，使菌株在培養過程中吸附於纖維材料上。
[0009]其中，所述的纖維材料為棉纖維織物、活性炭纖維、納米纖維、竹纖維、聚乙烯醇纖維、聚氨酯泡沫、絲綢、細菌纖維素膜、絲瓜瓤和甘蔗渣中的任意一種或幾種。
[0010]其中，所述的預處理，具體步驟如下:[0011](I)將纖維材料在沸水中煮沸後烘乾；
[0012](2)將經過步驟(1)處理後的纖維材料置於濃度為I~100g/L的表面改性劑水溶液中浸泡I~20小時，並用鹽酸調節溶液的pH值至7.0，再將纖維材料置於去離子水中充分漂洗後烘乾；
[0013] (3)將經過步驟(2)處理後的纖維材料置於濃度為I~100g/L的交聯劑水溶液中浸泡I~20小時，再將纖維材料置於去離子水中充分漂洗後烘乾，保存備用。
[0014]所述的表面改性劑為聚乙烯亞胺、聚醚醯亞胺、丁二醯亞胺、二乙三胺和二甲胺基丙胺中的任意一種或幾種；所述的交聯劑為戊二醛、乙二醛、琥珀醛、2-甲基-1，3-丙二醛和(2S，3R) -2, 3- 二羥基丁二醛中的任意一種或幾種。
[0015]其中，當發酵容器為搖瓶時，纖維材料以50g/L的添加量平鋪固定於搖瓶底部的不鏽鋼絲圈上。
[0016]其中，當發酵容器為氣升式發酵罐時，將纖維材料裁剪成長條狀，沿垂直方向螺旋纏繞在多條不鏽鋼絲條上，如圖1所示。
[0017]其中，當發酵容器為自吸式發酵罐時，將纖維材料平鋪在與之大小形狀均相同的鋼絲網上，纖維材料與鋼絲網一起捲成筒狀，如圖2所示。
[0018]有益效果:相對於現有技術，本發明優勢如下:
[0019]1、本發明所採用的纖維材料為化學惰性，對細胞沒有毒害作用，機械強度高，也不會被細胞代謝分解，不影響微生物的生長代謝，死細胞自行脫落，而活細胞能夠實現自增殖過程，始終維持很高的催化效率。
[0020]2、選用的纖維材料具有較高的孔隙率和比表面積，因此單位體積固定的細胞數目多，不僅固定化的細胞密度大，保證了高密度發酵的優勢，而且具有良好的傳質性能，傳質效率高，並縮短了發酵周期，搖瓶發酵的時間由游離發酵的48-65小時下降至36-50h，氣升式纖維床反應器的發酵時間也由游離發酵的72-96小時下降至60-82小時，自吸式纖維床反應器的發酵時間也由游離發酵的65-84小時下降至48-76小時。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0021]圖1為氣升式發酵罐中纖維材料的固定方式示意圖；其中，I表示不鏽鋼絲條；2表示纖維材料。
[0022]圖2為自吸式發酵罐中纖維材料的固定方式示意圖；其中，I表示不鏽鋼絲網；2表示纖維材料。
[0023]圖3為採用本發明的核酸酶Pl固定化發酵方法的示意圖；其中，I表示補料瓶；2表示螺動泵；3表示接種口 ；4表示排氣口 ；5表示空壓機；6表示轉子流量計；7表示空氣過濾器；8表示空氣分布器。
[0024]圖4為吸附於棉纖維材料上的桔青黴生物膜樣品的SEM照片。
【具體實施方式】
[0025]以下參照具體的實施例來說明本發明。本領域的技術人員容易理解，這些實施例僅用於說明本發明，其不以任何方式限制本發明的範圍。
[0026]以下實施例所使用的生產核酸酶Pl的菌株為桔青黴YL104，該菌株已保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號CGMCC N0.2014，記載在中國專利CN101067116A 中。
[0027]實施例1:纖維材料固定化介質的製備。
[0028]天然纖維材料由於和微生物細胞的表面特性相近，因此在一定程度上阻礙了菌體細胞吸附到纖維材料表面，所以要對纖維材料進行相關預處理，以促進細胞吸附到纖維載體表面。就上述纖維材料的預處理方法所確定的一個具體實施方案:
[0029](I)將纖維材料在沸水中煮沸0.1-5小時後20-100°C下烘乾；
[0030](2)將纖維材料置於濃度為I~100g/L的表面改性劑水溶液中浸泡1-20小時，並用鹽酸調節溶液的PH至7.0，再將纖維材料置於去離子水中充分漂洗後60-80°C烘乾；
[0031](3)將纖維材料置於濃度為I~100g/L的交聯劑水溶液中浸泡1-20小時，再將纖維材料置於去離子水中充分漂洗後60-80°C烘乾，4°C保存備用；
[0032]所述的表面改性劑為聚乙烯亞胺、聚醚醯亞胺、丁二醯亞胺、二乙三胺和二甲胺基丙胺中的任意一種或幾種；所述的交聯劑為戊二醛、乙二醛、琥珀醛、2-甲基-1，3-丙二醛和(2S，3R) -2, 3- 二羥基丁二醛中的任意一種或幾種。
[0033]例如可以採用如下具體的預處理過程；
[0034]方式一:
[0035](I)將活性炭纖維在沸水中煮沸I小時後60°C下烘乾；
[0036](2)將活性炭纖維·置於濃度為10g/L的二甲胺基丙胺水溶液中浸泡4小時，並用鹽酸調節溶液的pH至7.0，再將活性炭纖維置於去離子水中充分漂洗後60°C烘乾；
[0037](3)將活性炭纖維置於濃度為10g/L的乙二醛水溶液中浸泡4小時，再將活性炭纖維置於去離子水中充分漂洗後60°C烘乾，4°C保存備用；
[0038]方式二:
[0039](I)將棉纖維在沸水中煮沸2小時後80°C下烘乾；
[0040](2)將棉纖維置於濃度20g/L的聚乙烯亞胺水溶液中浸泡2小時，並用鹽酸調節溶液的pH至7.0，再將棉纖維置於去離子水中充分漂洗後60°C烘乾；
[0041](3)將棉纖維置於濃度為15g/L的戊二醛水溶液中浸泡2小時，再將棉纖維置於去離子水中充分漂洗後60°C烘乾，4°C保存備用；
[0042]方式三:
[0043](I)將竹纖維在沸水中煮沸I小時後60°C下烘乾；
[0044](2)將竹纖維置於濃度為5g/L的丁二醯亞胺水溶液中浸泡3小時，並用鹽酸調節溶液的pH至7.0，再將竹纖維置於去離子水中充分漂洗後60°C烘乾；
[0045](3)將竹纖維置於濃度為10g/L的2-甲基-1，3_丙二醛水溶液中浸泡3小時，再將竹纖維置於去離子水中充分漂洗後80°C烘乾，4°C保存備用；
[0046]預處理後的纖維材料的孔隙率> 90%，比表面積> 30m2/m3，不僅固定化的細胞密度大，而且具有良好的傳質性能。
[0047]實施例2:採用活性炭纖維固定化介質於搖瓶中生產核酸酶P1。
[0048]按照實施例1中方式一所述的方法將活性炭纖維進行預處理，將處理過的活性炭纖維以50g/L的添加量平鋪在直徑略小於三角瓶直徑的鋼絲圈上進行固定，作為搖瓶中固定化發酵生產核酸酶Pl的固定化介質。[0049]將桔青黴菌株於麥芽汁斜面上28~30°C培養5~7天進行活化，用無菌水充分洗滌桔青黴斜面得到孢子懸液，轉接於裝IOOmL液體發酵培養基(組分:葡萄糖50g/L，蛋白腖5g/L，磷酸二氫鉀0.04g/L，磷酸氫二鉀0.04g/L，硫酸鎂0.05g/L，氯化鈣0.05g/L，硫酸鋅0.05g/L, pH5-7)的500mL的搖瓶中，於28~30°C,250rpm搖床中培養24_60h，待發酵結束，將發酵液全部移出，測定發酵液中核酸酶Pl的酶活，並補入相同體積的新鮮發酵培養基進行下一批發酵。搖瓶中活性炭纖維固定化發酵的時間由游離發酵的48-65小時下降至36-50h，連續生產22批，產酶水平基本沒有下降，酶活始終保持在450-500U/mL。
[0050]實施例3:以棉纖維為固定化介質的氣升式纖維床反應器生產核酸酶P1。
[0051]按實施例1中方式二所述的方法將棉纖維進行預處理，如圖1所示，將棉纖維材料裁剪成長條狀，呈螺旋狀纏繞在不鏽鋼絲柱的側柱上，作為氣升式發酵罐中發酵生產核酸酶Pl的固定化介質。[0052]將桔青黴菌進行斜面培養，斜面孢子用無菌水洗下接入三角瓶，在無菌狀態下接入15升內循環氣升式發酵罐中進行游離培養，培養基為葡萄糖50g/L，蛋白腖5g/L，磷酸二氫鉀0.04g/L,磷酸氫二鉀0.04g/L,硫酸鎂0.05g/L,氯化鈣0.05g/L,硫酸鋅0.05g/L,PH5-7，培養溫度28~30°C，罐壓0.8~1.5MPa，通氣量1.2~1.8m3/h,待發酵液中核酸酶Pl的酶活達到100U/mL以上，用無菌壓縮空氣將發酵液全部移至一氣升式纖維床反應器中，培養基成分和發酵參數同上，使菌株邊發酵邊固定於纖維床上，測定發酵液中的酶活，當發酵液中的酶活達到400U/mL時，將發酵液全部移出，並補入新鮮培養基進行下一批發酵。氣升式纖維床反應器的發酵時間由游離發酵的72-96小時下降至62-80小時，連續生產了 15批，發酵周期穩定在同一水平。
[0053]實施例4:以竹纖維為固定化介質的自吸式纖維床反應器生產核酸酶P1。
[0054]以實施例1中方式三所述的方法對竹纖維進行預處理，如圖2，將處理過的竹纖維材料2以15g/L的添加量平鋪在與之大小形狀均相同的鋼絲網I上，與其捲成筒狀，纖維材料層與層之間保持疏鬆均勻，填充在自吸式發酵罐中作為生產核酸酶Pl的固定化介質。
[0055]將桔青黴菌株在斜面上活化後，接入氣升罐中進行游離培養，待發酵液中開始有酶活後，用無菌壓縮空氣將發酵液全部移至自吸式纖維床反應器中進行固定化發酵，培養基成分為葡萄糖50g/L，蛋白腖5g/L，磷酸二氫鉀0.04g/L,磷酸氫二鉀0.04g/L,硫酸鎂0.05g/L，氯化鈣 0.05g/L,硫酸鋅 0.05g/L, pH5_7，培養溫度 28 ~30°C，罐壓 0.5 ~1.2MPa，通氣量0.4~1.0m3/h，待發酵液中核酸酶Pl的酶活達到400U/mL時，換入新鮮的發酵液進行下一批發酵。從第二批發酵開始，培養基成分調整為葡萄糖40g/L，蛋白腖5g/L，磷酸二氫鉀0.032g/L,磷酸氫二鉀0.032g/L,硫酸鎂0.05g/L,氯化鈣0.05g/L,硫酸鋅0.05g/L，pH5-7，以節約發酵成本，並按第一批的發酵工藝參數進行後續發酵。自吸式纖維床反應器的發酵時間由游離發酵的65-84小時下降至48-76小時，連續進行了 12批的反覆批次發酵，產酶水平沒有下降，發酵工藝穩定。
【權利要求】
1.一種桔青黴的固定化方法，其特徵在於，以經過預處理的纖維材料作為固定化介質，將核酸酶Pl的生產菌株桔青黴活化後接入發酵容器中培養24~60h，使菌株在培養過程中吸附於纖維材料上。
2.根據權利要求1所述的桔青黴的固定化方法，其特徵在於，所述的纖維材料為棉纖維織物、活性炭纖維、納米纖維、竹纖維、聚乙烯醇纖維、聚氨酯泡沫、絲綢、細菌纖維素膜、絲瓜瓤和甘蔗渣中的任意一種或幾種。
3.根據權利要求1所述的桔青黴的固定化方法，其特徵在於，所述的預處理，具體步驟如下: (1)將纖維材料在沸水中煮沸後烘乾； (2)將經過步驟(1)處理後的纖維材料置於濃度為I~100g/L的表面改性劑水溶液中浸泡I~20小時，並用鹽酸調節溶液的pH值至7.0，再將纖維材料置於去離子水中充分漂洗後烘乾； (3)將經過步驟(2)處理後的纖維材料置於濃度為I~100g/L的交聯劑水溶液中浸泡I~20小時，再將纖維材料置於去離子水中充分漂洗後烘乾，保存備用。
4.根據權利要求3所述的桔青黴的固定化方法，其特徵在於，所述的表面改性劑為聚乙烯亞胺、聚醚醯亞胺、丁二醯亞胺、二乙三胺和二甲胺基丙胺中的任意一種或幾種；所述的交聯劑為戊二醛、乙二醛、琥珀醛、2-甲基-1，3-丙二醛和(2S，3R)-2, 3-二羥基丁二醛中的任意一種或幾種。
5.根據權利要求1所述的 桔青黴的固定化方法，其特徵在於，當發酵容器為搖瓶時，纖維材料以50g/L的添加量平鋪固定於搖瓶底部的不鏽鋼絲圈上。
6.根據權利要求1所述的桔青黴的固定化方法，其特徵在於，當發酵容器為氣升式發酵罐時，將纖維材料裁剪成長條狀，沿垂直方向螺旋纏繞在多條不鏽鋼絲條上。
7.根據權利要求1所述的桔青黴的固定化方法，其特徵在於，當發酵容器為自吸式發酵罐時，將纖維材料平鋪在與之大小形狀均相同的鋼絲網上，纖維材料與鋼絲網一起捲成筒狀。
【文檔編號】C12N11/12GK103571818SQ201310595509
【公開日】2014年2月12日 申請日期:2013年11月21日 優先權日:2013年11月21日
【發明者】應漢傑, 陳勇, 趙南, 吳菁嵐, 李淑亞, 李振建, 程浩, 劉慶國 申請人:南京工業大學