具有高產β-環糊精能力的環糊精葡萄糖基轉移酶的突變體及突變方法

2023-10-05 18:32:54 2

專利名稱：具有高產β-環糊精能力的環糊精葡萄糖基轉移酶的突變體及突變方法
技術領域：
具有高產P-環糊精能力的環糊精葡萄糖基轉移酶的突變體及突變方法，本發 明屬於基因工程和酶工程領域。具體地說本發明是利用蛋白質工程的定點突變
方法改善環糊精葡萄糖基轉移酶(CGT酶)的產物特異性的技術。
背景技術：
環糊精是由六個以上葡萄糖連結而成的具有環狀疏水圓錐形結構的低聚糖 非還原性化合物系列，其中最常用的是a-、 (3-、 Y-環糊精，它們分別由6、 7、 8 個葡萄糖單元構成。目前，環糊精的工業化生產均採用酶法合成，即在CGT酶 催化作用下，通過環化反應轉化澱粉及相關基質合成環糊精。由於環糊精能與 許多客體分子形成包合物，從而改變客體分子的物理和化學性質如溶解度、穩 定性等，因此在食品、醫藥、農業、紡織、環保、化妝品、生物技術和分析化 學等領域具有廣泛的應用。
CGT酶是一個多功能型的酶，它能催化四種不同的反應..三種轉糖基化反 應(歧化反應、環化反應和偶合反應)和水解反應。CGT酶通過環化反應能利用 澱粉生產環糊精，這是其工業應用的基礎。用CGT酶生產環糊精一個主要的不 利條件是所有己知的野生型CGT酶生產的是a-、 P-、 Y-環糊精的混合物。這不 僅給產物的分離純化帶來很大不便，而且提高了成本。
本發明主要是對來源於軟化類芽孢桿菌Peam'6ac/〃w macera似JFB 05-01(CCTCC NO: M 208063)的CGT酶進行了產物特異性的定點突變改造。

發明內容
本發明的目的是提供提高i3 macera"s JFB 05-01 CGT酶產P-環糊精能力的 突變方案。
本發明的再一個目的是提出具有更高P-環糊精生產能力的突變體酶K47R， K47H， K47T，及其構建方法。
本發明的技術方案來源於軟化類芽孢桿菌(屍e朋沾ac/〃w w"cera似)JFB 05-01的環糊精葡萄糖基轉移酶，簡稱CGT酶，的三種突變體酶K47R， K47H 及K47T，將CGT酶基因中第47位的賴氨酸Lys分別變成了精氨酸Arg，組氨 酸His或蘇氨酸Thr，分別命名為K47R， K47H及K47T，它們相比於野生型CGT 酶具有更高的產P-環糊精能力。
軟化類芽孢桿菌(屍eam'6ad〃ws maceram) JFB 05-01 (CCTCC NO: M 208063)，已在中國專利CN101294149A公開，
公開日2008年10月29日。所述的三種突變體酶K47R， K47H及K47T的製備方法，根據A w"ceram JFB 05-01 CGT酶基因序列，分別設計併合成引入Arg47， His47， Thr47密碼子 的定點突變引物，對基因進行定點突變，測定DNA序列，分別鑑別出Lys47密 碼子變成Arg47密碼子，His47密碼子及Thr47密碼子的突變體，並在大腸桿菌 BL21(DE3)中進行表達。
(1) 定點突變
利用快速PCR技術，以表達載體c^/pET-20b(+)為模板進行定點突變，
引入Arg47密碼子的定點突變引物為
正向引物5'- CGATCCAATTTGCGGCTCTATTTCGG -3，(下劃線為突變鹼基)， 反向引物5'-CCGAAATAGAGCCGCAAATTGGATCG-3，(下劃線為突變鹼基)，
引入His47密碼子的定點突變引物為
正向引物5'- CGATCCAATTTGCACCTCTATTTCGG -3，(下劃線為突變鹼基)， 反向引物5，- CCGAAATAGAGGTGCAAATTGGATCG -3，(下劃線為突變鹼基)，
弓i入Thr47密碼子的定點突變引物為
正向引物5'- CGATCCAATTTGACGCTCTATTTCGG -3，(下劃線為突變鹼基)， 反向引物5'- CCGAAATAGAGCGTCAAATTGGATCG -3'(下劃線為突變鹼基)， PCR反應體系均為10x五x buffer 5 |iL， dNTPs (2.5 mM) 5 (iL，正向引
物(10 pM) lpL，反向引物(10 pM) lpL，模板DNA 1 pL，五x &《HS (5 U小L)
0.25 nL，加入雙蒸水至50pL。
PCR擴增條件均為94。C預變性4min;隨後進行35個循環(94。C 30 s， 55°C
30 s， 72。C6min);最後72。C保溫10 min。
PCR產物經I (購自加拿大Fermentas公司)消化，轉化大腸桿菌JM109
感受態細胞，感受態細胞在LB固體培養基(含100 pg/mL氨苄青黴素)培養過夜
後，挑單克隆於LB液體培養基(含100嗎/mL氨苄青黴素)中培養，後提取質粒，
將突變質粒轉化表達宿主大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞，所有突變質粒均測
序正確。
(2) 突變體的表達與純化
挑取轉入表達宿主大腸桿菌BL21(DE3)的單克隆於LB液體培養基(含100 )xg/mL氨苄青黴素)生長8 10 h，按4%接種量將種子發酵液接到TB液體培養基 (含100 pg/mL氨苄青黴素)；大腸桿菌在30 。c搖床培養至OD6qq=0.6，加入 O.OlmM終濃度的IPTG誘導胞外表達，並在25t:搖床繼續培養發酵90小時後， 將發酵液於4 。C、 10000 rpm離心20 min除菌體，收集上清液並純化，分別得 到突變體酶K47R， K47H和K47T製品。
本發明的有益效果本發明構建了三個有意義的突變體，均實現了P-環糊精 產物特異性的提高，比野生型CGT酶更利於P-環糊精的工業化生產。
5

圖1野生型和突變型CGT酶的三種環糊精產量。A、野牛型CGT酶 B、突變體酶K47R; C、突變體酶K47H; D、突變體酶K47T。其中4表示a-環 糊精；國表示P-環糊精；A表示Y-環糊精。
具體實施例方式
實施例l:本實施例說明突變體酶K47R， K47H及K47T的製備。
1) 定點突變
利用快速PCR技術，以表達載體cg/pET-20b(+)為模板進行定點突變，
引入Arg47密碼子的定點突變引物為
正向引物5'- CGATCCAATTTGCGGCTCTATTTCGG -3'(下劃線為突變鹼基)， 反向引物5'-CCGAAATAGAGCCGCAAATTGGATCG-3，(下劃線為突變鹼基)，
引入His47密碼子的定點突變引物為
正向引物5'- CGATCCAATTTGCACCTCTATTTCGG -3 ，(下劃線為突變鹼基)， 反向引物5，- CCGAAATAGAGGTGCAAATTGGATCG -3,(下劃線為突變鹼基)，
引入Thr47密碼子的定點突變引物為
正向引物5' - CGATCCAATTTGACGCTCTATTTCGG -3，(下劃線為突變鹼基)， 反向引物5，- CCGAAATAGAGCGTCAAATTGGATCG誦3，(下劃線為突變鹼基)， PCR反應體系均為lOx五x 72^ buffer 5 jxL， dNTPs (2.5 mM) 5 (iL，正向引
物(10 ^M) l|iL，反向引物(10 jaM) l|iL，模板DNA 1 (iL，五jc 7bg HS (5 U/|iL)
0.25 jiL，加入雙蒸水至5(HiL。
PCR擴增條件均為94。C預變性4min;隨後進行35個循環(94。C 30 s， 55°C
30 s， 72。C6min);最後72。C保溫10 min。
三種PCR產物分別經Z)/7wI (購自加拿大Fermentas公司)消化，轉化大腸
桿菌JM 109感受態細胞，感受態細胞在LB固體培養基(含100 pg/mL氨苄青黴
素)培養過夜後，挑單克隆於LB液體培養基(含100 )ag/mL氨苄青黴素)中培養，
後提取質粒，將突變質粒轉化表達宿主大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞，所有
突變質粒均測序正確。
2) 突變體的表達與純化
挑取轉入表達宿主大腸桿菌BL21 (DE3)的單克隆於LB液體培養基(含100 [ig/mL氨苄青黴素)生長8~10 h，按4%接種量將種子發酵液接到TB液體培養基 (含100 [ag/mL氨苄青黴素)。大腸桿菌在30 。C搖床培養至OD6Q=0.6，加入 O.OlmM終濃度的IPTG誘導胞外表達，並在25。C搖床繼續培養發酵90小時後， 將發酵液於4 。C、 10000 rpm離心20min除菌體，分別收集上清液。
6上清液中加入70%固體硫酸銨鹽析過夜，4 。C、 10000 rpm離心20 min， 取沉澱物用適量含20 mM磷酸鈉、0.5 M氯化鈉和20 mM咪唑、pH 7.4的緩衝 液A溶解，並在緩衝液A中透析過夜後，通過0.22pm膜過濾後製成卜.樣樣品； Ni親和柱用緩衝液A平衡後，將上樣樣品吸入M柱，使之完全吸附後，分別 用緩衝液A、含20-480 mM咪唑的緩衝液A、含480mM咪唑的緩衝液A洗脫， 流速lmL/min，檢測波長為280 nm，分部收集含CGT酶酶活的洗脫液；活力 組分在50 mM磷酸鈉緩衝液(pH=6)中透析過夜後，分別得到純化突變體酶 K47R， K47H及K47T。
實施例2:本實施例說明酶活分析。
1) 酶活測定方法
甲基橙法測定a-環化活力的方法取適當稀釋的酶液O.lmL，加入裝有0.9 mL預先用50mM磷酸緩衝液(pH6.5)配製的3M(w/v)可溶性澱粉溶液中，在 40。C下反應10min後，加入1.0 mL l.ON的鹽酸停止反應，再加入1.0 mL用 50mM磷酸緩衝液配製的0.1 mM甲基橙，在16"C下保溫20min，在505nm下
測定吸光度。 一個酶活單位定義為在上述條件下每分鐘生成1 pmol a-環糊精所 需的酶量。
酚酞法測定P-環化活力的方法取適當稀釋的酶液O.l mL，加入裝有0.9 mL 預先用50mM磷酸緩衝液(pH6.5)配製的3。/。(w/v)可溶性澱粉溶液的試管中， 在40。C下反應10min後，加入3.5mL 30mM NaOH和0.5mL由5mMNa2C03溶 液配製的0.02。/。(w/v)酚酞停止反應，在室溫下保溫20min，在550nm下測定吸 光度。 一個酶活單位定義為在上述條件下每分鐘生成liamol卩-環糊精所需的酶
溴甲酚氯法測定Y-環化活力的方法取適當稀釋的酶液O.l mL，加入裝有 0.9mL預先用50mM磷酸緩衝液(pH6.5)配製的3。/。(w/v)可溶性澱粉溶液的試 管中，在40。C下反應10min後，加入50|nL l.ON的鹽酸停止反應，再加入2 mL 0.2 M檸檬酸緩衝液(pH 4.2)和lOO)iL 5 mM溴甲酚氯溶液，在室溫下保溫 20min，在630nm下測定吸光度。 一個酶活單位定義為在上述條件下每分鐘生成 lpmol Y-環糊精所需的酶量。
2) 酶活比較
實驗結果列於表l。野生型CGT酶有更高的a-環化活力，與野生型相比， 突變體酶K47R的a-環化活力降低了 13%，卩-環化活力增加至1.5倍；突變體酶 K47H的a-環化活力降低了 34%， (3-環化活力增加至2.2倍；K47T的P-環化活 力顯著升高，(3-環化活力高於a-環化活力。突變體酶K47R， K47H， K47T的總 環化活力有所下降。而且，突變體酶K47R， K47H， K47T的(3-環化活力佔總環 化活力的比例高於野生型酶。表l
a-環化活力(3-環化活力Y-環化活力總活力
鵬(U/mg)(U/mg)(U/mg)(U/mg)
野生型190.432.21.1223.7
K47R165.546.62.0214.1
K47H125.871.92.4200.1
K47T88.195.52.2185.8
實施例3:本實施例說明HPLC方法分析環糊精生成量。
配製5%(溼基，含水量8%， w/v)可溶性澱粉溶液作為底物，5g澱粉溶解在 90mL磷酸鈉緩衝液(pH6.0)中，定容至100mL，在沸水屮煮沸30min。分別加入 一定量的野生CGT酶、突變酶K47R、 K47H、或K47T使反應體系中酶活為0.2 U/mL，置於40 "C下反應40h，隔時間取樣600pL, 12000 rpm離心10 min，取 上清500(iL，加5pL糖化酶(70U/mL)，在30 。C糖化lh， 10min煮沸滅活，12000 rpm離心30min，取上清經0.45pm超濾膜過濾後取20(iL上HPLC分析。
反應液中a-, P-，和Y-環糊精的濃度採用HPLC測定，採用HPLC進行產物 分析的色譜條件是Waters 600HPLC色譜儀，Waters自動進樣器，色譜柱 Lichrosorb NH2 (4.6 mmxl50 mm)， Waters2410示差檢測器；流動相(V/V)為65% 乙腈水溶液，流速lmLmin";柱溫30 °C。
實驗結果列於圖1，將上述突變體表達獲得的突變體純酶製品與野生型純酶 製品相比，可以發現，突變體K47R， K47H， K47T實現了P-環糊精生產能力的 提高。表2可以看出，通過40h培養後，與野生型相比，這三個突變體的(3-環糊 精產量分別增加了4%， 8%及13%，而a-環糊精產量降低了 11%， 21%及34%。
表2
酶澱粉轉化率(％)a產物(g/l)(%) P
野生型42.37.6 (41.8)9.9 (54.4)0.69 (3.8)
K47R41.56.8(38.1)10.3 (57.7)0.75 (4.2)
K47H40.56.0 (34.4)10.7 (61.4)0.72 (4.1)
K47T39.35.0 (29.6)11.2 (66.4)0.68 (4.0)
8序列表
SEQIDNO:l
正向引物5，誦CGATCCAATTTGCGGCTCTATTTCGG墨3'， 反向引物5， -CCGAAATAGAGCCGCAAATTGGATCG-3，，
<210〉 SEQIDNO:2
正向引物5， -CGATCCAATTTGCACCTCTATTTCGG-3，， 反向引物5， -CCGAAATAGAGGTGCAAATTGGATCG-3，，
SEQIDNO:3
正向引物5，誦CGATCCAATTTGACGCTCTATTTCGG-3，， 反向引物5， - CCGAAATAGAGCGTCAAATTGGATCG-3，。
權利要求
1、來源於軟化類芽孢桿菌(Peanibacillus macerans)JFB 05-01的環糊精葡萄糖基轉移酶，簡稱CGT酶，的三種突變體酶K47R，K47H及K47T，其特徵是將CGT酶基因中第47位的賴氨酸Lys分別變成了精氨酸Arg，組氨酸His或蘇氨酸Thr，分別命名為K47R，K47H及K47T，它們相比於野生型CGT酶具有更高的產β-環糊精能力。
2、 權利要求1所述的三種突變體酶K47R， K47H及K47T的製備方法，其 特徵在於根據P waceram JFB 05-01 CGT酶基因序列，分別設計併合成引入 Arg47, His47或Thr47密碼子的定點突變引物，對基因進行定點突變，測定DNA 序列，分別鑑別出Lys47密碼子變成Arg47密碼子，His47密碼子及Thr47密碼 子的突變體，並進行大腸桿菌表達。
3、 權利要求2所述的突變體酶K47R， K47H及K47T的製備 (1)定點突變利用快速PCR技術，以表達載體cg/pET-20b(+)為模板進行定點突變， 引入Arg47密碼子的定點突變引物為下劃線為突變鹼基， 下劃線為突變鹼基，下劃線為突變鹼基， ,下劃線為突變鹼基，下劃線為突變鹼基，正向引物5 ，- CGATCCAATTTGCGGCTCTATTTCGG -3,，反向引#勿5 ，-CCGAAATAGAGCCGCAAATTGGATCG-3'， 引入His47密碼子的定點突變引物為正向引物5 ， - CGATCCAATTTGCACCTCTATTTCGG陽3 ，，反向引物5 ， - CCGAAATAGAGGTGCAAATTGGATCG -3 ， 弓I入Thr47密碼子的定點突變引物為正向引物5 ， - CGATCCAATTTGACGCTCTATTTCGG隱3 ，，反向引物5，- CCGAAATAGAGCGTCAAATTGGATCG -3，，下劃線為突變鹼基，PCR反應體系均為10x￡:c buffer5 |aL， 2.5 mM dNTPs 5 ^L， 10 iaM正向 引物lpiL， 10 iiM反向引物l(iL，模板DNAlnL， 5 U L五:c %《HS 0.25 (^L，加入雙蒸水至50hL;PCR擴增條件均為94。C預變性4 min;隨後94。C 30 s， 55°C 30 s， 72°C 6 min 進行35個循環；最後72。C保溫10min;PCR產物經Z^wI消化，轉化大腸桿菌JM109感受態細胞，感受態細胞在 含100嗎/mL氨苄青黴素的LB固體培養基培養過夜後，挑單克隆於含100 pg/mL氨苄青黴素的LB液體培養基中培養，後提取質粒，將突變質粒轉化表達 宿主大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞，所有突變質粒均測序正確； (2)突變體的表達與純化挑取轉入表達宿主大腸桿菌BL21 (DE3)的單克隆於含100 pg/mL氨苄青黴素的LB液體培養基生長8 10 h，按4%接種量將種子發酵液接到含100嗎/mL 氨卞青黴素的TB液體培養基；大腸桿菌在3(TC搖床培養至OD6(X)=0.6，加入 O.OlmM終濃度的IPTG誘導胞外表達，並在25"C搖床繼續培養發酵90小時後， 將發酵液於4。C、 10000 rpm離心20 min除菌體，收集上清液並純化，分別得 到突變體酶K47R， K47H及K47T製品。
全文摘要
具有高產β-環糊精能力的環糊精葡萄糖基轉移酶的突變體及突變方法，屬於基因工程和酶工程領域。本發明利用蛋白質工程的定點突變方法提高一種環糊精葡萄糖基轉移酶(簡稱CGT酶)產β-環糊精能力，提供了提高來源於Peanibacillus macerans JFB05-01(CCTCC NOM 208063)的CGT酶產β-環糊精能力的突變方案，將CGT酶的47位的Lys分別替換成Arg，His及Thr，獲得的三種突變體酶K47R，K47H，K47T，它們的β-環糊精生產能力較野生型CGT酶有所提高；其中，突變體酶K47T尤為顯著。這些突變體酶比野生型CGT酶更利於β-環糊精的工業化生產。
文檔編號C12N9/10GK101503680SQ20091002915
公開日2009年8月12日 申請日期2009年1月6日 優先權日2009年1月6日
發明者敬 吳, 張佳瑜, 李兆豐, 堅 陳 申請人:江南大學