一種rPoIFNα1的分離純化方法
2023-10-05 14:59:44 2
一種rPoIFNα1的分離純化方法
【專利摘要】本發明公開了一種重組豬幹擾素α1（recombinantporcineinterferonα1，rPoIFNα1)規模化生產過程中的蛋白質分離純化方法。根據rPoIFNα1帶有his-tag標記蛋白以及蛋白質間電荷差異的原理，採用了包括鎳離子螯合層析、強陽離子交換層析、強陰離子交換層析三步層析方法，解決了大腸桿菌表達的rPoIFNα1中含有大量宿主菌蛋白的問題，大幅度地提高了rPoIFNα1的蛋白質純度（純度可高達98.8%），增加了其臨床應用的安全性。
【專利說明】—種rPolFNa 1的分離純化方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物製藥領域，尤其涉及藥用幹擾素蛋白的純化，特別適用於工程菌發酵得到的帶his-tag標記基因工程重組幹擾素規模化生產過程中的蛋白質分離純化。
【背景技術】
[0002]幹擾素(interfeixm，IFN)是由病毒或其他幹擾素誘導劑刺激機體後產生的一種小分子量糖蛋白，具有廣譜地抗病毒、抗腫瘤及免疫調節等功能，根據來源等不同，可分IFN-a，IFN-β，IFN-Y三種。其中IFN-α可刺激機體產生抗病毒蛋白質，且具有廣譜的抗病毒作用。重組人IFN-α已廣泛用於臨床，治療各種病毒性疾病，其療效已被各國學者所公認，但動物幹擾素的臨床應用卻相對緩慢。
[0003]我國是世界上養豬大國，豬的疾病種類繁多，特別是病毒性傳染病造成的發病率和死亡率最高，每年給養豬業造成巨大的經濟損失，有些病毒性疾病還威脅到人類健康。因此具有良好抗病毒作用的重組豬幹擾素，不僅對我國養豬業的健康發展有重要意義，也為人類的生命健康提供了重要保障。
[0004]本課題組採用基因工程原核表達技術，已成功構建出可高效、穩定表達具有高活性rPolFNa I的萬.BL21工程菌(重組豬a幹擾素的製備方法，專利號2008100201804)，具有工藝流程短、生產成本低等優點。應用此工程菌進行高密度發酵後的純化目的蛋白是一道非常重要的工藝過程:即將rPolFNa I從複雜的細菌表達環境中提取出來，去除各種雜質，包 括顆粒、細菌、內毒素、核酸和各種雜蛋白等非目標蛋白物，以達到政府藥品監督管理部門對該種生物製品要求的各項質量標準，才能滿足臨床需求。
[0005]目前國內外有一些對重組豬幹擾素分離純化報導，但其重組豬幹擾素製備工藝各不相同，因此生產過程中蛋白質純化工藝也完全不同。中國專利(CN 101570757A)構建的豬a幹擾素/白細胞介素2融合蛋白是以包涵體形式表達，採用包涵體變性復性的方法初步純化豬a幹擾素/白細胞介素2融合蛋白，該純化工藝尚達不到生物製品生產要求；中國專利(CN 102732587A)採用真核載體構建表達重組豬幹擾素a，該工藝生產周期較長，規模化生產成本高。因此探索建立本課題構建的rPolFNa I蛋白規模化生產分離純化工藝，具有重要的理論意義和實踐價值。
[0006]目前，利用重組工程菌株表達生產級用生物製品，在後期的分離純化過程中一般都要使用價值昂貴的單克隆抗體親和層析純化柱，純度才能達到95%以上。而本室自行構建的工程菌所表達的rPolFNa 1，市場上並無對應的單克隆抗體親和層析純化柱可供用於純化。因此，自行建立一種經濟、快速和高效的純化方法，以得到高純度的rPolFNa 1，尤為重要。
[0007]本發明採用了包括鎳離子螯合層析、強陽離子交換層析、強陰離子交換層析三步層析方法，大幅度地提高了 rPolFNa I的純度(純度高達98.8%)。
【發明內容】
[0008]本發明目的就是為了提供一種rPolFNa I的分離純化方法。
[0009]本發明是通過以下技術方案實現的:
一種rPolFNa I的分離純化方法,包括以下步驟:
(1)金屬螯合層析；
(2)強陽離子交換層析；
(3)強陰離子交換層析。
[0010]所述的金屬螯合層析為鎳離子螯合層析，平衡液是含5~45mM咪唑的磷酸鹽緩衝液； 強陽離子交換層析所用純化柱是SP Sepharose FF,平衡液是ρΗ4.0~6.0的醋酸鹽緩衝
液；
陰離子交換層析所用純化柱是Q Sepharose FF,平衡液是含(T25mM氯化鈉的緩衝液。
[0011]本發明的優點是:
使用本發明提供的純化方法，得到的rPolFNa I蛋白純度高達98.8%，達到生物製品注射用重組幹擾素質量標準要求，適合規模化生產用。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0012]圖1 rPolFNa I蛋白層析純化色譜圖；
圖1 A: rPolFNa I蛋白親和層析色譜圖，其中縱坐標mAu表示A280紫外吸收值，橫坐標為體積；
圖1 B: rPolFNa I蛋白陽離子交換層析色譜圖，其中縱坐標mAu表示A280紫外吸收值，橫坐標為體積；
圖1 C: rPolFNa I蛋白陰離子交換層析色譜圖，其中縱坐標mAu表示A280紫外吸收值，橫坐標為體積；
圖2 rPolFNa I純化蛋白Western blot檢測結果 M:蛋白質分子量Marker ；
泳道1:rPoIFNa I蛋白純化後結果；
泳道2:rPoIFNa I蛋白純化前對照；
泳道3:BL21工程菌蛋白對照。
[0013]圖3rPoIFNa I純化蛋白SDS-PAGE檢測結果；
M:蛋白分子標準；
泳道1:rPoIFNa I蛋白純化前對照；
泳道2:親和層析純化洗去的雜蛋白；
泳道3:親和層析純化收集的目的蛋白；
泳道4:陰離子交換層析後收集的目的蛋白；
圖4:rPoIFNa I純化蛋白RP-HPLC檢測色譜圖 其中縱坐標Au表示A280紫外吸收值，橫坐標為保留時間。
【具體實施方式】
[0014]實施例1rPolFNa I規模化生產中蛋白質純化工藝的建立
利用該重組蛋白帶his-tag標記基因，採用鎳離子交換層析，首先去除大部分的雜蛋白。其次選擇兩次離子交換的層析方法，先用強陽離子交換層析，去除大量內毒素，後用強陰離子交換層析，進一步純化。
[0015]1.材料與儀器
Chelating Separose Fast Flow 填料(GE healthcare 公司產品)；SP SepharoseFF 填料(GE healthcare 公司產品)；Q Sepharose FF 填料(GE healthcare 公司產品)；Column XK16/20 (GE healthcare 公司產品)；AKTA exploerlOO 層析系統(GE healthcare公司產品)。
[0016]2.實驗方法
2.1金屬鎳螯合親和層析法純化rPolFNa I蛋白
1)清洗:用超純水洗去純化系統管道中的保存液，再用3飛個柱體積的雙蒸水清洗Ni2+螯合親和層析柱，流速為3ml/min ；
2)平衡:用3~5 個柱體積的 Binding Buffer I (20mM Na2HPO4, 500 mM NaCl，5~45 mMImidazole, pH 7.5~10.5)平衡層析柱,流速為 3ml/min ；
3)上樣:將用0.22ΜΠ1孔徑濾膜過濾處理過的樣品過層析柱，流速為5ml/min ；
4)洗雜:用4個柱體積以上的BindingBuffer I過層析柱,洗去未與層析柱結合的雜蛋白，直到檢測不到蛋白吸收峰，流速3ml/min ；
5)洗脫:用Elution Buffer I (20mM Na2HPO4, 500 mM NaCl,
300-500mM Imidazole, pH 7.5~10.5),階段洗脫，流速 3ml/min ；
6)收集:收集洗脫下來的蛋白吸收峰；
7)洗柱:用雙蒸水清洗層析柱，流速為3ml/min；
8)保存:用20%乙醇過層析柱，流速為3ml/min。
[0017]2.2 SP Sepharose FF陽離子交換層析進一步純化rPoIFN-α I蛋白
1)平衡:用2~3個柱體積的BindingBuffer II (50mM醋酸鈉，pH 4.0~6.0)平衡陽離子交換柱，流速為2ml/min ；
2)上樣:將上述親和層析收集的樣品用BindingBuffer II透析過濾,上到陽離子交換層析柱中，流速為lml/min ；
3)淋洗:用BindingBuffer II洗去大部分雜蛋白，直至紫外基線穩定,流速為2ml/
min ；
4)洗雜:用50% Elution Buffer II (50mM 醋酸鈉，IM NaCl,
pH 4.0-6.0)洗去結合力弱的雜蛋白，直至紫外基線穩定，流速為2ml/min ；
5)洗脫:用ElutionBuffer II,以2ml/min的流速洗脫,收集蛋白吸收峰；
6)洗柱:用雙蒸水清 洗柱子，流速2ml/min；
7)保存:用20%乙醇過柱，流速為2ml/min。
[0018]2.3、Q Sepharose FF陰離子交換層析純化rPoIFN α I蛋白
1)平衡:用2-3 個柱體積的 Binding Buffer III (50mM Tris-HCl , 25mM NaCl，pH
6.(T9.0)平衡陰離子交換柱，流速為2ml/min ；
2)上樣:將上一步純化收集的樣品用BindingBuffer III透析過濾,上到陰離子交換層析柱中，流速為lml/min ；
3)淋洗:用10%的ElutionBuffer III,洗去大部分雜蛋白，直至紫外基線穩定，流速為2ml/min ；
4)洗脫:用ElutionBuffer III衝洗，以2ml/min的流速洗脫,收集蛋白吸收峰；
5)洗柱:用雙蒸水清洗柱子，流速2ml/min；
6)保存:用20%乙醇過柱，流速為2ml/min。
[0019]rPoIFN α I純化蛋白的檢測
I) Western blot 檢測
對分離純化後的rPoIFNa I進行Western blot鑑定，一抗:豬幹擾素α單克隆抗體購自ABcam等公司，使用前1000倍稀釋，二抗:HRP標記羊抗鼠IgG，使用前1000倍稀釋。純化後的rPoIFN α I經Western blot檢測表明:純化前後rPoIFN α I均可與豬幹擾素α單克隆抗體發生特異性反應，在35KD處出現特異性條帶。具體結果如圖2所示。
[0020]2 ) SDS-PAGE 檢測
將分離純化的蛋白樣品進行SDS-PAGE分析，SDS-PAGE分析結果如圖3所示，經過純化去除雜蛋白後SDS-PAGE上只看到單一條帶。 [0021]3) RP-HPLC 檢測
重組菌誘導表達破碎後收集到的上清依次經鎳親和層析、強陽離子交換層析和強陰離子交換層析，最後得到的純化蛋白經μ RPC C18 ST 4.6/100反相層析柱進行分析檢測蛋白純度，流動相A:0.1%三氟乙酸(TFA)水溶液；B:0.08%TFA+80%乙腈(CAN)，流速0.8ml/min,連續梯度洗脫，30min從100%A到100%B。根據A280nm吸收峰的峰面積計算樣品純度。
[0022]純化後的rPoIFNa I經μ RPC C18 ST 4.6/100反相層析柱進行分析只得到一個主吸收峰，其他4個峰為雜峰。通過計算峰面積得出主峰面積佔總面積的98.8%。
【權利要求】
1.一種rPoIFNd I的分離純化方法，其特徵在於包括以下步驟: (1)金屬螯合層析； (2)強陽離子交換層析； (3)強陰離子交換層析。
2.根據權利要求1所述的一種rPoIFNaI的分離純化方法，其特徵在於所述的金屬螯合層析為鎳離子螯合層析，平衡液是含5~45mM咪唑的磷酸鹽緩衝液。
3.根據權利要求1所述的一種rPoIFNaI的分離純化方法，其特徵在於所述的強陽離子交換層析所用純化柱是SP Sepharose FF，平衡液是ρΗ4.0~6.0的醋酸鹽緩衝液。
4.根據權利要求1所述的一種rPoIFNaI的分離純化方法，其特徵在於所述的陰離子交換層析所用純化柱是Q Sepharose FF,平衡液是含(T25mM氯化鈉的緩衝液。
【文檔編號】C07K1/18GK103965346SQ201310526225
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2013年10月29日 優先權日:2013年10月29日
【發明者】王明麗, 趙俊, 何磊 申請人:王明麗, 趙俊