激發人體抗結核桿菌的保護性免疫反應的抗原表位及其用途的製作方法

2023-10-05 16:11:24 4

專利名稱：：激發人體抗結核桿菌的保護性免疫反應的抗原表位及其用途的製作方法
技術領域：
：本發明涉及分子免疫學領域，具體涉及能激發人體抗結核桿菌的保護性免疫反應的抗原表位的分子模擬肽及其篩選方法與用途。
背景技術：
：近年來結核病(Tuberculosis,TB)在全球範圍內又死灰復燃。據世界衛生組織統計，全世界約有1/3人口約20億人感染了結核桿菌(Mycobacteriumtuberculosis,Mtb)，每年新發病人約900萬，每年死亡人數高達300萬。世界衛生組織提出了"全球結核病緊急狀態"(globalemergency)。由此可見，結核病對人類健康和經濟造成的衝擊和損害難以簡單評估。結核病在我國流行的特點是高患病率，高耐藥率，高死亡率，高感染率和低遞降率，嚴重影響了個人和家庭的生活質量、社會和國家的建設和經濟發展。目前控制結核病的策略主要是直接使用抗生素。然而，需聯合使用多種抗生素至少達6個月以上，而且由於Mtb耐藥菌株的廣泛出現，常造成抗生素治療無效。現今常用的結核疫苗---卡介苗(BCG)具有很大的局限性(1)對成人結核的效果並不令人滿意；(2)可在免疫力低下的個體中引起嚴重的疾病甚至死亡；(3)可造成皮膚試驗陽性，使其失去在結核桿菌感染中的診斷意義。因此，迫切需要開發新型高效的保護性結核疫苗，開發檢測、治療和預防結核病的新方法，以有效控制結核病的發生和病情發展，這一研究領域具有重要意義和廣闊的應用前景。結核桿菌(Mtb)是一種細胞內病原體，機體對其的控制依賴於對受感染細胞的識別和破壞。在小鼠模型中的研究表明，MHCII類限制性CD4+T細胞，MHCI類限制性CD8+T細胞，IFN-y，TNF-a，y5T細胞和CD1限制性T細胞在體內具有積極的保護性作用。在人體內己鑑定了不同型別的CD8+Mtb特異性T細胞，但其在結核病發病機制中的作用尚不明確。巨噬細胞巨噬細胞在人體對Mtb的免疫反應中起重要作用。Mtb可存活於未活化的巨噬細胞中。當巨噬細胞被激活，可產生IFN-y等細胞因子，誘導N0、活性硝酸鹽介質(RNI)以及NO合成酶的產生，從而發揮免疫效應作用。巨噬細胞發揮抗微生物活性的另一條途徑是吞噬小體的融合。但Mtb感染巨噬細胞可抑制吞噬小體的融合和酸化，而Mtb得以存活於巨噬細胞內。CD4+T細胞Mtb抗原經MHCII類分子遞呈至CD4+T細胞。CD4+T細胞可產生IFN-y等細胞因子發揮效應作用，也可誘導受染細胞的凋亡，還可協助B細胞、CD8+T細胞的激活。但是，Mtb感染巨噬細胞可導致巨噬細胞MHCII類分子表達下降，從而抑制CD4+T細胞的免疫效應。CD8+T細胞Mtb被巨噬細胞的吞噬小體吞噬，其抗原或其分泌的蛋白質進入吞噬小體中，再透過吞噬小體膜進入巨噬細胞，進而被消化處理並由MHCI類分子遞呈至CD8+T細胞。CD8+T細胞可產生IFN-y等細胞因子發揮效應作用，也可通過Fas/Fasl途徑、granzymeB等直接發揮細胞毒性作用。研究表明，BCG不能充分刺激CD8+T細胞，可能由於BCG失去了關鍵的溶胞膜素，Mtb抗原不能進入受感染細胞的胞液而被遞呈。現有的研究主要是關於CD4+T細胞在結核病中的保護性反應，特異性CD4+T細胞免疫反應與疾病不同階段的相關性，正在研究中。而結核病中CD8+T細胞的作用機制，尚未明確。CD8+T細胞被單個抗原肽激活依賴於許多因素，其中得到公認的是，APC表面存在高密度的肽/MHC複合物是體內或體外"初始"T細胞激活的關鍵。樹突狀細胞(DC)表達高水平MHC，在激活"初始"T細胞中起重要作用。關於激活"初始"T細胞所需的肽/MHC複合物分子數的報導，具有較大差異，從每細胞300個到10000個。但總的來講，"初始"T細胞的反應需要激活記憶細胞所需肽/MHC複合物分子數的100-1000倍。而且有研究表明，90%被CD8+T細胞識別的肽，與其MHCI類分子高親合性結合。從HLAI類分子洗脫的肽多為8-10胺基酸。而用合成肽進行的研究表明，長度為15-20胺基酸的肽亦可結合HLAI類分子而激活T細胞。HLAII類分子結合的肽的長度則具有相當的柔性.目前的TB疫苗可分為4類亞單位疫苗，DNA疫苗，全細菌疫苗和混合疫苗。亞單位疫苗是基於假設一個或少數幾個抗原即足以誘導保護性免疫反應。已有研究在小鼠模型上對亞單位疫苗進行檢驗，包括培養液濾過蛋白，單個蛋白，蛋白混合物以及融合蛋白。雖然這類疫苗很安全，但這種模式的抗原遞呈只能刺激有限數量的特異性T細胞，大多數是CD4+T細胞，而且總的來講，這類反應比較短暫。DNA疫苗能刺激CD4+和CD8+T細胞反應而且持久，但其安全性仍令人擔心，包括基因組整合的風險。迄今經測試，最成功的TBDNA疫苗是Ag85A。也有許多對全細菌疫苗的研究。從Mtb去除單個基因如毒力因子，可能降低細菌毒力但仍保持刺激CD4+、CD8+和非傳統T細胞的能力。對於這些突變子的安全性仍有爭議。混合疫苗是力圖利用上述策略的優勢，如BCG可經工程改造，過量表達一個或多個免疫原性/保護性蛋白。如，BCG經工程改造可分泌listerlysin，這使BCG蛋白可進入受感染細胞的胞漿，增強其刺激CD8+T細胞的能力。同樣，經工程改造的BCG過量表達Ag85，在豚鼠實驗中優於單獨用BCG。當Mtb以及其他一些細胞內病原體生長在培養基中時，也釋放蛋白質(培養基濾過蛋白)進入胞外基質中。有學者用雙相聚丙烯醯胺瓊脂糖電泳分析Mtb培養濾過液，鑑定了200多種不同的蛋白點。將胞內產生的和培養基中生長的Mtb產生蛋白用雙相聚丙烯醯胺瓊脂糖電泳進行比較分析，可發現顯著差異。Horwitz等純化並鑑定了在Mtb培養濾過液中最豐富的6種蛋白質，包括抗原85A，抗原85B，超氧化物歧化酶，hsp71，Mpt51，Mpt63。用這些純化蛋白質免疫豚鼠可使之獲得對Mtb的免疫力。儘管許多抗原帶有潛在的細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxicTly即hocyte，CTL)表位，但在初次反應中只有少數能產生CTL反應，主要的表位稱為免疫優勢決定簇，其它的表位稱為次要決定簇或結構性決定簇。次要決定簇能被處理和遞呈，但在免疫優勢決定簇存在時，次要決定簇不能激發CTL反應。結構性表位不能被遞呈，可能在抗原處理過程中有問題，包括蛋白小體剪切的特異性以及由於包饒表位的側面序列。影響免疫優勢的因素包括(1)APC的抗原處理無效；(2)缺乏適當的TCR以識別表位/HLA複合物分子；(3)CD8+T細胞抗原遞呈的競爭；(4)由免疫優勢CD8+T細胞產生的對其它決定簇反應的抑制。對於TB疫苗而言，尤其應考慮這些影響因素，因為幾乎每個人都會暴露於環境中的細菌，BCG禾口/或Mtb。雖然疫苗^f究集中於免疫優勢表位，但對次要決定簇的研究可能將免疫反應集中於不能逃避免疫識別的表位。有報導，將ESAT-6的次要決定簇免疫小鼠，可誘導顯著的抗TB的保護性免疫反應，而用有的免疫優勢表位卻不能產生這樣的保護性反應。因此，研究激發人體抗結核桿菌的保護性免疫反應的抗原表位，包括免疫優勢決定簇和次要決定簇，十分必要和迫切
發明內容-本發明的目的是篩選出能激發人體抗結核桿菌的保護性免疫反應的抗原表位的分子模擬肽，研究結核病的保護性免疫反應機制，進一步開發出新型的多聯多聚表位結核疫苗，更有效地預防和控制結核病的發生和發展。綜合應用基因組序列、生物信息學、功能基因組學和免疫學研究，本發明提供了一種能激發人體抗結核桿菌的保護性免疫反應的抗原表位的分子模擬肽，所述肽含有選自以下的胺基酸序列RLLALLCAAV(SEQIDNO:2)，KLILTQPFDV(SEQIDNO:5)，RLSQSADQYL(SEQIDNO:IO)，FLTREMPAWL(SEQIDNO:12)，KLIANNTRV(SEQIDNO:14)，GLPVEYLQV(SEQIDNO:15)。本發明還提供了一種能激發人體抗結核桿菌的保護性免疫反應的抗原表位的分子模擬肽的篩選方法，其特徵在於，它包括以下步驟I表位預測和分子模擬肽合成應用資料庫SYFPEITHI對結核桿菌Rv3840c、Rv0309、Rv0129c、Rv0173進行HLA-A*0201限制性CTL表位預測，以F-moc化學法合成上述預測得到的分子模擬肽；II上述分子模擬肽經親和力分析、穩定性分析、細胞增殖實驗、細胞活性檢測和特異性抗體檢測，篩選出親和力強、穩定性好、能產生較強增殖反應、具有較強細胞毒活性和免疫後能產生特異性抗體的分子模擬肽。本發明還提供了上述的能激發人體抗結核桿菌的保護性免疫反應的抗原表位的分子模擬肽在製備免疫原、免疫動物、或產生免疫保護上的應用。本發明還提供了上述的能激發人體抗結核桿菌的保護性免疫反應的抗原表位的分子模擬肽在製備多聯多聚表位結核疫苗上的用途。該多聯多聚表位結核疫苗，它含有上述分子模擬肽SEQIDNO:2，5，10，12，14，15中一個或多個直接或間接地連接而成的肽段。本發明大大有助於對結核病的預防和治療，尤其是X寸多耐藥性菌株的控制，也有利於研究結核病中的分子、細胞作用機制，促進困擾臨床的多耐藥性難題的解決。圖1預測抗原肽與HLA-A*0201的親和力及穩定性分析結果圖2結核桿菌抗原肽刺激PBMCs產生的增殖反應圖3結核桿菌抗原肽誘導PBMC產生特異性的CTL殺傷活性圖4結核抗原肽誘導的體液免疫反應具體實施例方式下面結合附圖和實施例對本發明作進一步描述。實施例l:1材料與方法1.1研究對象肺結核確診患者200例，其中HLA-A*0201陽性100例，HLA-A*0201陰性100例，均經放射學和臨床痰培養檢驗。100例HLA-A*0201陽性其他慢性肺病患者為疾病對照組，100例HLA-A*0201陽性健康志願者為正常對照組。1.2試劑和試劑盒淋巴細胞分離液Lymph叩repTM購自挪威AXIS-SHIELD公司；LPS、人重組IL-2、DMSO、BFA、P2-mg均購自Sigma公司；人重組GM-CSF、人重組IL-4購自R&D公司；RPMI1640培養基和胎牛血清購自Gibco公司；(Sigma);FITC標記的抗-CD3、抗-CD8、抗-HLA.A2流式單克隆抗體與檢測細胞內因子FITC標記抗體(IFN-Y、TNF-a、IL-10)均為Caltag公司產品；RNA抽提試劑盒購自Qiagen公司；時間分辨螢光DELFIA細胞增殖(AD0200)與細胞毒性(AD0016)檢測試劑盒均購自WallacOy公司；多肽由上海生工生物工程技術有限公司合成；T2細胞株購自美國ATCC細胞庫。1.3主要儀器流式細胞儀(CoulterEPICSXL)時間分辨螢光檢測儀(DELFIA1235，PerkinElmer)1.4表位預測和多肽合成應用資料庫SYFPEITHI對結核桿菌Rv3840c、Rv03O9、Rv0129c、Rv0173進行HLA-A巧201限制性CTL表位預測，根據多肽上的胺基酸是否為錨定殘基、輔助殘基或優勢殘基進行記分，分值高於21分者有可能是T細胞表位。由上海生工生物工程技術有限公司以F-moc化學法合成上述預測得到的多肽，合成的抗原肽均經高效液相色譜純化(純度>95。/0，並經質譜鑑定。凍乾粉保存於4"C，用前以無菌蒸餾水復甦多肽(2iig/ul)。1.5抗原肽親和力分析採用T2細胞株進行抗原肽親和力分析，其原理主要是利用T2細胞系的特點。T2細胞表面空載的HLA-A2分子表達極不穩定，遞呈後很快降解，抗原肽與之結合後穩定了HLA-A2的表達，抗原肽與HLA-A2的結合力越強，T2細胞表面HLA-A2分子的表達量就越高。而且由於T2細胞的內源性抗原遞呈途徑中必需的抗原多肽轉運蛋白(TAP)缺乏，所以T2細胞表面HLA-A2分子的表達量的增加直觀的反映了外來抗原肽與HLA-A2的結合力。具體方法為T2細胞以pH3.2的檸檬酸鈉一磷酸鹽緩衝液預處理lmin，使細胞表面的MHCI類複合物變性，立即用過量的RPMI1640(GibcoBRL)培養液洗1遍，調節細胞濃度至3X105，以lml/孔種於24孔細胞培養板。以抗原肽(20ug/ml)刺激，補充Brefeldin(BFA,10ug/ml)和32-MG(lug/ml)，37°C5%C02飽和溼度孵育4h，並以未加抗原肽為空白對照孔。收集細胞，以FACS(含0.2%FCS和0.1%疊氮鈉的PBS)洗1遍，用FITC標記的小鼠抗人HLA-A*0201單克隆抗體染色，常溫暗處反應30min，FACS液洗2遍，以鞘液懸浮，流式細胞儀(CoulterEPICSXL)檢測平均螢光強度。每個實驗重複3次，平均螢光強度高於空白對照孔平均螢光強度+3SD的抗原肽具有HLA-A*0201高親和力。1.6抗原肽穩定性分析T2細胞同前預處理，將抗原肽濃度提高至80ug/ml，37°C5%C02飽和溼度孵育18h，補充BFA至終濃度為10ug/ml，繼續孵育3h。收集細胞，同前測平均螢光強度。平均螢光強度高於空白對照孔平均螢光強度+3SD的抗原肽進行細胞增殖反應及細胞毒性實驗。1.7抗原肽誘導CTL製備密度梯度離心法分離經EDTA抗凝的靜脈血中的外周血單個核細胞(peripheralbloodmononuclearcells,PBMCs)，分離得到的PBMCs種於6孔細胞培養板，在含10%FCS的RPMI1640培養基中，37°C5%C02孵育1.5h。收集懸浮細胞(主要為淋巴細胞)，以10%二甲亞碸90%小牛血清保存於液氮備用。貼壁細胞為抗原提呈細胞一樹突狀細胞(DC)，補充含GM-CSF(1000U/ml，R&D)、IL-4(1000U/ml，R&D)及含10%FCS的RPMI1640培養液，37°C5%C02培養7d，需要時補充新鮮培養液。5d後，加入LPS(lyg/ml,Sigma)培養2d後，Y照射使其失去增殖活性。將經過照射的DC與抗原肽(10umol/L)在培養液中，37。C5XC02共孵過夜。將1乂105負載有抗原肽的DC與1X106自體PBMCs種於含10%FCS的RPMI1640完全培養液的24孔細胞培養板，37。C5^C(V混合培養3d後，加入riL-2(20U/ml,Sigma)繼續培養10d，進行細胞增殖實驗和細胞活性檢測。1.8細胞增殖實驗採用時間分辨螢光DELFIA細胞增殖檢測試劑盒(AD0200,Wallaroy)，將經輻射的5X103負載抗原肽的DC100ul與5X104抗原肽誘導的自體CTL100ul種於96孔細胞培養板，並以未負載抗原肽的DC作為陰性對照。加入20ulBrdU標記液孵育10h，離心1遍，加入Eu標記的抗BrdU單抗，室溫孵育2h，洗滌，固定。時間分辨螢光檢測儀(DELFIA1235)檢測螢光強度，每個樣本設3個復孔，取平均值為檢測結果。增殖係數(SI)=含抗原肽的平均螢光強度/陰性對照的平均螢光強度，SI〉2的抗原肽視為能誘導淋巴細胞增殖。1.9細胞毒性分析採用時間分辨螢光DELFIAEUTDA細胞毒性試驗(AD0116,Wallaroy)，抗原肽誘導CTL為效應細胞(E)，負載抗原肽的T2細胞為靶細胞(T)，檢測殺傷活性。參照說明書進行操作，效應細胞與靶細胞的比例為40:1，培養4h。時間分辨螢光檢測儀(DELFIA1235)檢測螢光強度，每個樣本設3個復孔，取平均值為檢測結果。細胞殺傷活性=(待測孔螢光強度一自然釋放孔螢光強度)/(最大釋放孔螢光強度一自然釋放孔螢光強度)X100%。1.10動物實驗1.10.1動物及分組C57BL/6小鼠20隻，2月齡，體重(18士2)g，雌雄不限，隨機分為4組，每組5隻。1.10.2免疫方法以體外實驗篩選出的結核抗原肽為免疫原，共注射3次，每次間隔2周，首次以CFA為佐劑，加強免疫以IFA為佐劑。小鼠首次及加強免疫量為50iig/只，與0.3ml佐劑完全乳化後，在腋窩、腹股溝、腋部皮下及腹腔多點注射。1.10.3標本的採集與分離在首次免疫、二次免疫和三次免疫後21天，分別對5隻/組小鼠在眼眶採血，分離血清，並凍存於-2(TC冰箱備用。1.10.4檢測特異性抗體.採用標準間接ELISA法測定血清中抗體滴度，分別測定每組動物特異性抗體滴度。按100孔包被96孔酶聯板，抗原濃度為20ug/ml，4。C過夜；以5%BSA-PBS37。C封閉120min，洗滌3次，3min/次；加倍比稀釋的被測動物血清，100孔，37T:孵育90min。洗滌3次後，加入HRP酶標二抗，37°C30min;洗滌3次後，加入DAB底物，37°C10min，終止反應。酶聯儀於490nm測定吸光度A值，以正常小鼠血清作陰性對照。結果以雙復孔A值均值表示。以待測標本A值/陰性對照A值>2為陽性標準，以出現陽性反應的最高稀釋度作為該樣本中抗體滴度。1.10.5免疫小鼠的攻毒保護性實驗對每組剩下5隻C57BL/6鼠免疫三次後間隔8周攻毒，攻毒注射部位為小鼠尾靜脈，注射劑量為1X106CFU，攻毒株為H37Rv。攻毒後8周殺死小鼠，將肺臟、脾臟勻漿稀釋接種到固體羅氏培養基上，四周後活菌計數。2結果2.1表位預測及多肽合成結果經生物信息學預測，選擇以下肽序列進行合成。合成的多肽經質譜鑑定，純度經高壓液相色譜(HPLC)分析均大於95%。Rv0309:VLAPVSLAV(SEQIDNO:l)RLLALLCAAV(SEQIDN0:2)SLAVVNPWFA(SEQIDNO:3)VLAPVSLAW(SEQIDNO:4)Rv0173:KLILTQPFDV(SEQIDNO:5)FLGKLDTFT(SEQIDNO:6)VLLVLALLL(SEQIDNO:7)RVMVADVWV(SEQIDNO:8)YLVGALKLI(SEQIDNO:9)RLSQSADQYL(SEQIDNO:IO)Rv0129c:GLPVEYLQV(SEQIDNO:ll)FLTREMPAWL(SEQIDN0:〗2)Rv3804c:AIYGPQQFV(SEQIDNO:13)KLIANNTRV(SEQIDNO:14)GLPVEYLQV(SEQIDNO:15)2.2抗原肽親和力及穩定性分析結果99%培養的T2細胞都表達HLA-A*0201分子，但平均螢光強度較弱。上述合成的抗原肽與HLA-A*0201結合活性見表1。經抗原肽1-15處理後的細胞平均螢光強度出現升高，其中以抗原肽2和14升高最為明顯。T2細胞平均螢光強度經抗原肽處理後的增長倍數=抗原肽處理後的平均螢光強度/無抗原肽的平均螢光強度，以抗原肽14處理的最高，抗原肽15其次。抗原肽與HLA-AW201分子結合的穩定性分析結果顯示，抗原肽與T2細胞上的HLA-A*0201分子結合後，抗原肽2、3、5、7、8、10、12、14、15能使T2細胞HLA-A*0201分子表達穩定上調(見圖l)。根據結合力和穩定性結果，選擇抗原肽2、3、5、7、8、10、12、14、15繼續下遊實驗。表1抗原肽刺激後的T2細胞HLA-A*0201平均螢光強度tableseeoriginaldocumentpage12tableseeoriginaldocumentpage132.3抗原肽刺激細胞增殖以細胞增殖反應評價抗原肽2、3、5、7、8、10、12、14和15在結核病患者PBMC中誘導抗原特異性CTL的能力，進一步鑑定其是否為特異性細胞表位。其中，HLA-A*0201陽性結核病患者100例，HLA-A*0201陰性結核病患者100例，100例HLA-A*0201陽性其他慢性肺病患者為疾病對照組，100例HLA-A*0201陽性健康志願者為正常對照組。設以刺激係數(SI)〉3為增殖反應陽性。結果表明，結核病患者(HLA-A*0201陽性和陰性患者)PBMC對抗原肽2、5、10、12、14和15均產生較強的陽性增殖反應，而在疾病對照組和健康對照組未出現顯著的增殖反應(見圖2)。2.4抗原肽誘導CTL殺傷毒性以負載抗原肽的T2細胞為靶細胞，抗原肽誘導的CD8+CTL為效應細胞，效靶比(E/T)為20:1，經時間分辨螢光DELFIAEUTDA細胞毒性試驗分析結核桿菌抗原肽誘導的CTL細胞毒活性。結果表明，經抗原肽2、5、10、12、14和15刺激的CD8+CTL為效應細胞具有較強的細胞毒活性(見圖3)。2.5小鼠抗體滴度的動態測定首次免疫後2周始，取血l次/周，分離血清，以結核抗原肽為包被抗原，ELISA間接法測定特異性抗體滴度，首次免疫3周後即可檢出特異性抗體，抗體滴度在測定時間內，抗體滴度逐^f增高，首次免疫後8周，抗體滴度達最高1:64。抗體滴度隨免疫次數和時間升高，而陰性對照組未檢測到抗體(見圖4)。2.6疫苗對免疫鼠的保護效果分析以攻毒8周後的小鼠為實驗材料，研究了各疫苗誘導的保護效力。實驗表明，各免疫組小鼠肺臟和脾臟的細菌數顯著減少。其保護效率如表2。表2疫苗誘導的保護性應答能力載菌數保護率抗原肽-肺脾月巿脾2(4.37±0.48)x105(4.54±0.76)x1042.462.095(4.47±0.46)x105(3.49±0.53)x1052.451.210(5.45±0.85)x105(5.34±0.58)x1052.361.0212(4.83±0.67)x105(5.25±0.47)x1052.411.0214(3.35±0.37)x105(1.15±0.39)x1042.572.6815(5.48±0.59)x105(5.25±0.49)x1042.362.02BCG(4.21±0.55)x105(3.81士0.43)x1042.472.17陰性對照(1.28±0.68)x108(5.65±0.84)x106——*保護率的計算方法為陰性組細菌數對數值減去疫苗或BCG組的細菌數的對數值而得到。數值越大保護效率越高。3結論綜合應用基因組序列、生物信息學、功能基因組學和免疫學研究，結果證實，以下抗原表位的分子模擬肽，可以激發人體抗結核桿菌的保護性免疫反應1.RLLALLCAAV(SEQIDNO:2)，模擬來源Rv0309:aa.312;2.KLILTQPFDV(SEQIDNO:5)，模擬來源Rv0173:aa.302311;3.RLSQSADQYL(SEQIDNO:IO)，模擬來源Rv0173:aa.260269;4.FLTREMPAWL(SEQIDNO:12)，模擬來源Rv0129c:aa.144-153;5.KLIANNTRV(SEQIDNO:14)，模擬來源Rv3804c:aa.242250;6.GLPVEYLQV(SEQIDNO:15)，模擬來源Rv3804c:aa.4856。15SEQUENCELISTING<110〉中國人民解放軍第二軍醫大學<120〉激發人體抗結核桿菌的保護性免疫反應的抗原表位及其用途<130〉說明書，權利要求書<160〉15<170〉Patentlnversion3.1<210〉1<211〉9<212〉PRT〈213〉人工序列〈400〉1ValLeuAlaProValSerLeuAlaVal15<210〉2<211〉10〈212〉PRT〈213〉人工序列〈400〉2ArgLeuLeuAlaLeuLeuCysAlaAlaVal1510〈210〉3〈211〉10〈212〉PRT<213〉人工序列<400〉3SerLeuAlaValValAsnProTrpPheAla1510<210〉4<211〉10<212〉PRT<213〉人工序列4ValLeuAlaProValSerLeuAlaValVal1510<210〉5〈211〉10〈212〉PRT<213〉人工序列<400〉5LysLeulieLeuThrGinProPheAspVal1510〈210〉6〈211〉9〈212〉PRT<213〉人工序列<400〉6PheLeuGlyLysLeuAspThrPheThr15<210〉7〈211〉9<212〉PRT<213〉人工序列<400〉7ValLeuLeuValLeuAlaLeuLeuLeu15<210〉89<212〉PRT<213〉人工序列<400〉8ArgValMetValAlaAspValTrpVal15<210〉9<211〉9<212〉PRT人工序列9TyrLeuValGlyAlaLeuLysLeulie1510<211〉10<212〉PRT人工序列<400〉10.ArgLeuSerGinSerAlaAspGinTyrLeu1510<210〉11〈211〉9人工序列〈400〉11GlyLeuProValGluTyrLeuGinVal15〈210〉12〈211〉10〈212〉PRT〈213〉人工序列〈400〉12PheLeuThrArgGluMetProAlaTrpLeu1510<210〉13〈211〉9PRT〈213>人工序列〈400〉13AlalieTyrGlyProGinGinPheVal15〈210〉14<211〉9〈212〉PRT〈213〉人工序列〈400〉14LysLeulieAlaAsnAsnThrArgVal15〈210〉15〈211〉9<212〉PRT〈213〉人工序列<400〉15GlyLeuProValGluTyrLeuGinVal1權利要求1、能激發人體抗結核桿菌的保護性免疫反應的抗原表位的分子模擬肽，其特徵在於，所述肽的胺基酸序列如SEQIDNO:14所示。2、如權利要求1所述的能激發人體抗結核桿菌的保護性免疫反應的抗原表位的分子模擬肽在製備免疫原上的應用。3、如權利要求1所述的能激發人體抗結核桿菌的保護性免疫反應的抗原表位的分子模擬肽在製備多聯多聚表位結核疫苗上的用途。全文摘要本發明涉及分子免疫學領域，近年來結核病在全球範圍內又死灰復燃，由於耐藥菌株的出現，抗生素治療常常無效；常用的結核疫苗——卡介苗也具有局限性。本發明的目的是篩選出能激發人體抗結核桿菌的保護性免疫反應的抗原表位的分子模擬肽，研究結核病的保護性免疫反應機制，進一步開發出新型的多聯多聚表位結核疫苗。本發明提供了一種能激發人體抗結核桿菌的保護性免疫反應的抗原表位的分子模擬肽，所述肽的胺基酸序列如SEQIDNO14所示。本發明還提供了上述肽的篩選方法和用途。本發明將更有效地預防和控制結核病的發生和發展。文檔編號A61P37/00GK101311189SQ20081012503公開日2008年11月26日申請日期2006年6月6日優先權日2006年6月6日發明者仲人前,吳傳勇,曄周,婁加陶,蔣廷旺,鄧安梅,錢,波陳,燕陳,陳孫孝申請人:中國人民解放軍第二軍醫大學