海濱錦葵多糖製備工藝及用途的製作方法

2023-10-05 21:33:54

專利名稱：海濱錦葵多糖製備工藝及用途的製作方法
技術領域：
本發明屬於生化分離技術領域，具體涉及從海濱錦葵中分離製備錦葵多糖的工藝 及用途。
二.
背景技術：
海濱錦葵(kostelezkya virginica)是錦葵科錦葵屬多年生宿根鹽生植物，天然分 布於美國東部沿海鹽沼海岸帶。1992年由南京大學引種至中國。有文獻報導，海濱錦 葵的花、葉、根部可食用。尤其是根部可生食、可烹炸、可作茶飲，焙乾碾碎可用作 糖果和口香糖原料，以增加膠粘度。根部浸出液可濃縮至蛋清狀替代蛋清使用。多糖
在生物界分布很廣，從其他動植物中分離製備多糖的研究方法有不少論文和專利。但 從海濱錦葵中提取錦葵多糖以及對錦葵多糖的研究論文很少見到，專利至今未有。
根據我們的研究我們認為錦葵多糖是一種雜多糖，屬多糖類。在錦葵根部含量豐 富。從生物學實驗證明，錦葵多糖具有增強免疫力的生物學功能。可作為人體非特異 性免疫增強劑，促進體液免疫及細胞免疫，加強抗體或補體生成。該多糖可製成片劑、 口服液、膠囊等作為保健食品給免疫低下者使用，促進他們的健康。也可進一歩製成 藥品，供免疫低下或腫瘤病人輔助治療使用。
三.

發明內容
本發明需要解決的問題是從海濱錦葵的根中提取出錦葵多糖，並利用錦葵多糖的 生物學功能將其製成片劑、膠囊、口服液等保健食品，供免疫力低下者使用。還可制 成藥品供病患者使用。
本發明技術方案
l.海濱錦葵多糖提取工藝採集海濱錦葵新鮮根，洗淨、曬乾或烘乾，粉碎。取 乾粉，按比例l: 15加入蒸餾水，用超聲儀加溫超聲提取。超聲條件功率200瓦， 溫度6(TC，時間1小時。超聲後用紗布過濾。同樣條件再重複一次；兩次濾液合併。
將濾液蒸發部分後，用乙醇沉澱，將沉澱乾燥得粗多糖。將錦葵粗多糖加入適量水溶
解後，加入等體積20%三氯乙酸，沉澱夫除蛋白，離心得上清液，減壓蒸餾後的濃縮
液對水透析，透析後的溶液加乙醇沉澱，乾燥，得去蛋白錦葵多糖(錦葵多糖簡稱
JKDT，以下同)溶液,簡稱為JKDT-1。
從上步驟得到的JKDT-1用DEAE-纖維素柱層析，梯度洗脫，分別檢測，得到洗 脫液，合併有效組分，濃縮，乙醇沉澱，乾燥，得組分JKDT-2A 、 JKDT-2B。得到
3的JKDT-2A組分再用sephcryl -200柱層析，純化分離，得到三個組分，分別是 JKDT-3A、 JKDT-3B、 JKDT-3C。根據實驗結果，JKDT-2B用sephacryl-200層析後仍 為一個峰，不需要再層析。因此錦葵多糖最後組分為四個，分別是:JKDT-2B、JKDT-3A、 JKDT-3B、 JKDT-3C。
2.錦葵多糖的生物學功能實驗 錦葵多糖免疫活性試驗
表l多糖對T細胞增殖的影響(培養24h)
齊懂(U g/ml)A值A值(加conA)
(X±S)(X±S)
對照0. 3715±0. 04330. 4408±0. 0280
3001. 7162±0. 1636*1. 7839±0. 1055*
2001. 7277±0. 2898*1. 7164土0. 1755*
1001. 5621±0. 5384*1. 6524±0. 1770*
501. 5879±0. 5450*1. 7720±0. 2324*
401. 3701±0. 5670*1. 1304±0. 7834*
P*<0. 05
表2多糖對B細胞增殖的影響(培養24h)劑量(U g/ml)A值A值(加conA)
(x±S)(X±S)
對照0. 4840±0. 06280. 4467±0. 0537
3001. 7556±0. 0701*1. 6803±0. 0563*
2001.6967±0. 0577*1. 5382±0. 5727*
1001. 5463±0. 1927*1.4199±0. 4631*
501. 1781±0. 5431*1.4526±0. 4327*
401. 1938±0. 5144*1. 0293±0. 5641*
P*〈0.05
3.錦葵多糖的測定-酚-硫酸法。
本方法是用苯酚-硫酸試劑與錦葵多糖的己糖醛酸起反應，在490nm處產生特徵 性光吸收，以光吸收值大小參比標準曲線來確定錦葵多糖的含量。苯酚試劑取苯酚 200克，加鋁片0.2克和NaHC03 0.1克，蒸餾，收集180-182。C餾分稱取15克，加 蒸餾水溶解，定容於250ml容量瓶。取乾燥的葡萄糖標準品，準確配製濃度為 250^g/ml。分別取O.O， 0.1， 0.2， 0.3， 0.4， 0.5， 0.6， 0.7， 0.8ml,放入試管， 再分別補加蒸餾水至l.Oml，加入苯酚試劑l.Oml,再加入濃硫酸5.0ml,冷卻後於 490nm處測定光吸收值，以濃度對光吸收值作標準曲線。錦葵多糖同法配製 25-200)^g/ml範圍內濃度，取1. (M後再加入1. Oml苯酚試劑，5. Oml濃硫酸，冷卻後測490nm處光吸收值，對照標準曲線計算錦葵多糖的含量。
本發明有益效果是使用了超聲方法，並且採用中溫度技術(60°C)，從海濱錦葵 中第一次提取了錦葵多糖，並利用現有技術進行了純化。從我們對模型動物的實驗發 現，錦葵多糖具有增強實驗動物免疫力的功能。可製備成提高免疫功能的保健食品。 通過進一步的實驗和研究，錦葵多糖也可製備成治療腫瘤的藥物。 四.
具體實施例方式
取新鮮採集的海濱錦葵根，洗淨、乾燥、粉碎，取樣200克乾粉，以1;15的比 例加入蒸餾水，用超聲儀超聲抽提，抽提條件溫度6(TC，超聲功率200W,時間l小 時，超聲後用紗布過濾，濾渣再用上述條件處理一次。合併兩次濾液，得4500ml，減 壓蒸發得860ml,加乙醇至最終濃度為70%，攪拌，得粘性沉澱，去上清，綢布過濾， 沉澱5(TC烘乾，得錦葵多糖粗品10. 2克。
取錦葵多糖粗品5. 0克，加蒸餾水250ml,溶解後加入20%三氯乙酸250ml，冷藏 於8"冰箱冷藏，次閂取上清，沉澱部分離心5000 r/分，10分鐘，合併得上清490ml， 減壓濃縮至50ml,裝透析袋對水透析。除去三氯乙酸，得無蛋白錦葵多糖溶液194ml。
將按常規方法處理好的DEAE-纖微素，裝柱後水洗至中性，取上述無蛋白錦葵多 糖溶液94ml,加水一倍，上樣；上樣結束後，先用水洗滌兩個床體積，再用0-1.0MNaCL 洗脫錦葵多糖，經檢測洗脫峰有兩個，I峰收集120ml, II峰收集448ml，再分別^k縮 至I峰60ml， II峰162ml;兩峰濃縮液分別加入4倍體積95%乙醇沉澱多糖，放置4-6 小時後，用砂芯漏鬥抽濾，分次用無水乙醇脫水，5(TC烘乾。I峰得幹品JKDT-2A 53.6mg, II峰得JKDT-2B 362mg。
將JKDT-2A 53.6mg樣品加水10ml溶解，上樣於按常規處理並裝好的 s印hacryl-200柱，經洗脫得到三個組分，經檢測計算其含量分別是JKDT-3A 1.16mg, JKDT-3B 3.95mg.JKDT-3C 8. 3mg。
錦葵多糖含量純度檢查酚-硫酸法。本方法是用苯酚-硫酸試劑與錦葵多糖的己 糖醛酸起反應，在490nm處產生特徵性光吸收，以光吸收值大小參比標準曲線來確 定錦葵多糖的含量。苯酚試劑取苯酚200克，加鋁片0.2克和NaHC03 0.1克，蒸 餾，收集180-182'C餾分。稱15克，加蒸餾水溶解，定容於250ml容量瓶。放入棕色 瓶，冰箱保存備用。取乾燥的葡萄糖標準品，準確配製濃度為25(^g/ml。分別取O.O， 0.1， 0.2， 0.3， 0.4， 0.5， 0.6， 0,7， C ftr〗,放入試管，再分別補加蒸餾水至1. Oml， 加入苯酚試劑1. Oml,再加入濃硫酸5. Oml，冷卻後於490nm處測定光吸收值，以'濃度 對光吸收值作標準曲線。錦葵多糖同法配製25-20(^g/ml範圍內濃度， 1.0ml後再 加入1. Oml苯酚試劑，5. Oml濃硫酸，冷卻後測490nm處光吸收值，對照標準曲線計 算錦葵多糖的含量。
權利要求
1.一種從海濱錦葵中分離製備錦葵多糖的工藝，其特徵是探集海濱錦葵鮮根，洗淨，烘乾，粉碎，乾粉中加入1∶15的蒸餾水，用超聲儀超聲提取，超聲條件溫度60℃，功率200W，時間1小時，超聲結束後，用兩層紗布過濾，濾液存放，濾渣再用上述條件重複一次，兩次濾液合併，減壓蒸發，得濃縮液，加入乙醇使最終濃度為70％，攪拌後低溫靜置10-12小時，虹吸去上清，將沉澱抽濾，烘乾，得錦葵多糖粗品。
2. 根據權利1所述從海濱錦葵中分離製備錦葵多糖的工藝，其特徵是錦葵粗多 糖產品，加適量蒸餾水溶解，加入等體積20%三氯乙酸，靜置12小時以上，離心去、沉 澱，上清液為去蛋白多糖溶液，減壓濃縮，再對蒸餾水透析去除三氯乙酸，得除蛋白 錦葵多糖溶液。
3. 根據權利2所述製備從海濱錦葵中分離製備錦葵多糖的工藝，其特徵是用 DEAE-纖維素柱層析進行分離，上樣液以合適濃度上樣，洗脫液為0-lmol/LNaCL梯 度，分部收集，用苯酚-硫酸法檢測糖濃度，得到糖濃度-洗脫體積曲線，根據洗脫曲 線辨別分離峰，分別合併有效洗脫部分，減壓濃縮後用95%乙醇調乙醇最終濃度為 80%，靜置過夜，用砂芯漏鬥抽濾多糖，再分別用95%乙醇、無水乙醇脫水，烘乾， 得錦葵多糖，錦葵多糖簡稱JKDT，兩個組分分別是JKDT-2A、 JKDT-2B。
4. 根據權利3所述方法得到的JKDT-2A，其特徵是進行sephacryl-200柱層析， 柱層析後得JKDT-3A、 JKDT-3B、 JKDT-3C，根據以上方法，從海濱錦葵根中分離得 到四個純組分分別是JKDT-2B、 JKDT-3A、 JKDT3B、 JKDT-3C。
5. 根據權利要求4所述方法製備的海濱錦葵多糖純品在製備具有調節免疫功能 的保健食品中的應用。
6. 根據權利要求4所述方法製備的海濱錦葵多糖純品在製備治療腫瘤藥物中的 應用。
全文摘要
本發明屬於生化分離技術領域，具體涉及海濱錦葵多糖的製備工藝及用途，本發明從海濱錦葵中分離、純化錦葵多糖工藝，從新鮮海濱錦葵根、得乾粉，超聲，乙醇沉澱，三氯乙酸去蛋白，DEAE-柱層析，sephacryl-200再層析。共得到四個組分JKDT-2B、JKDT-3A、JKDT-3B、JKDT-3C。該產品可製成片劑、口服液、膠囊作為保健品給免疫低下者使用。還可進一步製成治療腫瘤的藥品。
文檔編號C08B37/00GK101638444SQ200910032020
公開日2010年2月3日 申請日期2009年7月7日 優先權日2009年7月7日
發明者張太平, 張鶴雲, 佩 欽 申請人:南京大學