雞傳染性支氣管炎疫苗的效力檢驗方法及其應用的製作方法
2023-10-05 22:31:54 1
專利名稱：雞傳染性支氣管炎疫苗的效力檢驗方法及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種雞傳染性支氣管炎滅活疫苗的效力檢驗方法及其應用，屬於生物 技術領域。
背景技術：
雞傳染性支氣管炎(Infectious bronchitis, IB)是由雞傳染性支氣管炎病毒 (Infectious bronchitis virus, IBV)引起的雞的急性、高度接觸性傳染病，臨床主要表現 為咳嗽、氣管囉音、打噴嚏、腎臟病變、產蛋雞群產蛋量及蛋品質下降。各種日齡、性別和品 種的雞對該病都有易感性，以6周齡以下的雛雞更易感染。沒有獲得母源抗體的雛雞感染 IBV後可引起永久性的輸卵管損傷，到性成熟喪失產蛋能力。產蛋雞群感染IBV後導致產蛋 量下降，蛋形不整、畸形和質量低下，受精率降低，IB還使雞的增重和飼料報酬降低。多年 來IB給我國的養雞業帶來極大的經濟損失，因此對該病的預防也越來越重要。目前在生產中廣泛應用滅活疫苗免疫是控制雞傳染性支氣管炎的有效辦法。檢驗 疫苗效力的方法有攻毒保護試驗、雞產蛋效能實驗、利用雞胚或者氣管環組織培養進行病 毒分離試驗等。上述實驗所需時間較長，可控性差，評價結果時常因使用的動物級別不同， 檢驗結果也常有誤差。本發明可用檢測HI (血球凝集抑制)抗體效價的方法代替本動物攻 毒試驗，結果準確、重複性強、操作簡單、時間短，具有普遍推廣的意義。
發明內容
有鑑於此，本發明的主要目的在於提供一種雞傳染性支氣管炎滅活疫苗的效力檢 驗方法，包括如下步驟1)用雞傳染性支氣管炎活疫苗首次免疫雞，免疫14 28日後採血分離血清，用雞 傳染性支氣管炎滅活疫苗加強免疫1次，21 35日後採血並分離血清。2)分別測定兩次血清的血球凝集抑制效價，以兩次血球凝集抑制效價之比判斷疫 苗的效力。優選地，本發明所述雞傳染性支氣管炎活疫苗首次免疫方法為點眼或滴鼻免疫。更優選地，本發明所述雞傳染性支氣管炎活疫苗首次免疫方法為點眼免疫。優選地，本發明所述首免的免疫量為1羽份，每羽份病毒含量> IO3 5EID500優選地，本發明所述雞傳染性支氣管炎滅活疫苗加強免疫方法為皮下注射或肌肉注射。更優選地，本發明所述雞傳染性支氣管炎滅活疫苗加強免疫方法為肌肉注射。優選地，本發明所述加強免疫的免疫量為1羽份，每羽份的量為0. 3ml 0. 8ml。更優選地，本發明所述加強免疫的免疫量為0. 5ml/羽。優選地，本發明所述加強免疫在首次免疫後14 28日。更優選地，本發明所述加強免疫在首次免疫後21日優選地，本發明所述血球凝集抑制效價之比為血球凝集抑制效價的幾何平均滴度之比。優選地，本發明所述血球凝集抑制效價的測定方法，包括如下步驟1)雞傳染性支氣管炎血球凝集試驗HA (血球凝集)抗原二倍系列稀釋。將25 μ 1紅細胞懸液加入含有25 μ 1稀釋抗 原的反應孔內，充分振蕩，在2 8°C靜置40min，判定結果時將反應板傾斜與水平呈45° 角，對照孔內和HA陰性孔的紅細胞完全沉澱到孔底中心，呈淚珠樣流淌；HA陽性孔的紅細 胞均勻分布在孔底或呈鋸齒樣凝集。使紅細胞凝集的最大稀釋倍數為該抗原的HA效價；2)血清樣品的處理將血清樣品置於56°C水浴中滅活30min，2000r/min離心lOmin，取上清待檢；3)雞傳染性支氣管炎血球凝集抑制試驗在96孔V型微量反應板，每行第2孔開始，每孔加入25 μ 1稀釋液至12孔，分別 在1、2和12孔加入待檢血清25 μ 1，從第2孔開始倍比稀釋血清至第10孔，棄去25 μ 1。向 1 11孔加入4ΗΑ單位抗原25 μ 1，充分振蕩，置室溫30min。每孔加入1 % V/V雞紅細胞 懸液25 μ 1，輕輕混勻2 8°C靜置40min。判定結果時將反應板傾斜45°，紅細胞完全沉 澱到孔底中心呈淚珠樣流淌為HI陽性；紅細胞均勻分布在孔底不流動者為HI陰性。完全 抑制紅細胞凝集的最高稀釋倍數為待檢血清的HI抗體效價。優選地，本發明所述加強免疫後的血清的HI抗體幾何平均滴度較首次免疫的血 清HI抗體幾何平均滴度高3倍以上時，疫苗判為合格。本發明的另一方面在於本發明所述雞傳染性支氣管炎滅活疫苗的效力檢驗方法 在雞傳染性支氣管炎滅活疫苗的質量控制中的應用。優選地，本發明所述疫苗的質量控制包括攻毒保護率與產蛋效能的控制。技術效果首先，本發明採用了測定血清中血球凝集抑制效價的方法來評價疫苗的免疫效 力。該方法大大縮短了測定時間，操作誤差小，可控性強，批間差異小，同時也減少了用動物 攻毒保護試驗來檢驗效力時常常因為實驗動物級別不同，檢測結果常有的誤差。其次，本發明的血球凝集抑制效價的測定方法簡便、快速、具有特異性強等特點， 可用於疫苗免疫效力檢驗。IB抗體檢測方法主要包括病毒中和試驗、瓊脂擴散試驗、血球凝 集/血球凝集抑制試驗和ELISA抗體檢測試劑盒，國外相關試劑盒價格昂貴，且國內尚無可 用於臨床檢測滅活苗抗體的試劑盒。為快速準確進行疫苗免疫效力檢測，本發明建立了雞 傳染性支氣管炎病毒血球凝集/血球凝集抑制試驗方法，該方法具有特異性和敏感性。再次，本發明測定血清中血球凝集抑制效價的方法是通過兩次免疫，兩次採血兩 次測定血清中血球凝集抑制效價的方法，通過對兩次效價的比較，特別是通過兩次血球凝 集抑制效價的幾何平均滴度之比，來判斷疫苗的免疫效力。該方法比現有技術僅免疫一次 或測定一次血球凝集抑制效價的方法，誤差更小，批間差異更小，試驗結果更加準確。最後，本發明檢測方法可直接應用於雞傳染性支氣管炎滅活疫苗的質量控制中， 通過建立血球凝集抑制效價與攻毒保護率和產蛋效能的關係，直接評價疫苗的質量對家雞 養殖的重要指標的影響程度，尤其是對雞傳染性支氣管炎的防治率與產蛋率進行了研究， 對現實生產有重要的指導意義。
具體實施例方式本發明實施例中，檢測了雞傳染性支氣管炎滅活疫苗，本發明還試驗了其他類型 的雞傳染性支氣管炎滅活疫苗，如亞單位滅活疫苗、基因工程滅活疫苗等，其免疫雞後均能 引起抗原抗體免疫反應，同樣可以使用本發明之檢測方法判定其疫苗的效力。本發明實施例中，檢測了兩次免疫兩次採血兩次血清凝集效價，超過兩次以上的 免疫，採用前兩次的血清凝集效價結果進行評價。本發明實施例中，兩次疫苗的血清凝集效價之比是通過計算幾何平均滴度之比來 確定的，其他常用的效價統計方法也可以做為疫苗效力的評價標準。本發明試驗了使用下述步驟的雞傳染性支氣管炎滅活疫苗的效力檢驗方法1)用雞傳染性支氣管炎活疫苗首次免疫雞，免疫14 28日後採血分離血清，用雞 傳染性支氣管炎滅活疫苗加強免疫1次，21 35日後採血並分離血清。2)分別測定兩次血清的血球凝集抑制效價，以兩次血球凝集抑制效價之比判斷疫 苗的效力。本發明雞傳染性支氣管炎活疫苗首次免疫方法為點眼或滴鼻免疫。本發明首免的免疫量為1羽份，每羽份病毒含量彡IO35EID500本發明實施例中雞傳染性支氣管炎滅活疫苗加強免疫方法為皮下注射或肌肉注 射。本發明加強免疫的免疫量為1羽份，每羽份的量為0. 3ml 0. 8ml。本發明加強免疫在首次免疫後14 28日。優選地，本發明實施例中加強免疫在首次免疫後21日本發明試驗了血球凝集抑制效價的測定方法，包括如下步驟1)雞傳染性支氣管炎血球凝集(HA)試驗HA抗原二倍系列稀釋。將25 μ 1紅細胞懸液加入含有25 μ 1稀釋抗原的反應孔 內，充分振蕩，在2 8°C靜置40min，使紅細胞凝集的最大稀釋倍數為該抗原的HA效價。2)血清樣品的處理將血清樣品置於56°C水浴中滅活30min，2000r/min離心lOmin，取上清待檢。3)雞傳染性支氣管炎血球凝集(HI)抑制試驗待檢血清系列倍比稀釋，加4HA單位凝集抗原2 8°C作用30min，加等體積紅細 胞懸液2 8°C靜置40min，完全抑制紅細胞凝集的待檢血清最高稀釋倍數為其血球凝集抑 制效價。結果判定時應注意，必須在抗原對照孔(第11孔)中紅細胞完全凝集而血清對照 孔(第12孔)中的紅細胞完全不凝集時才有效。該血球凝集抑制效價的測定方法簡便、快速、具有特異性強等特點，可用於疫苗免 疫效力檢驗。IB抗體檢測方法主要包括病毒中和試驗、瓊脂擴散試驗、血球凝集/血球凝集 抑制試驗和ELISA抗體檢測試劑盒，國外相關試劑盒價格昂貴，且國內尚無可用於臨床檢 測滅活苗抗體的試劑盒。為快速準確進行疫苗免疫效力檢測，我們建立了雞傳染性支氣管 炎病毒血球凝集/血球凝集抑制試驗方法，該方法具有特異性和敏感性。為使本發明更加容易理解，下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這 些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍，下列實施例中未提及的具體實驗 方法，通常按照常規實驗方法進行。
實施例1雞傳染性支氣管炎滅活疫苗的效力檢驗方法一.疫苗免疫用3周齡SPF雞10隻，點眼接種雞傳染性支氣管炎活疫苗(H12tl毒株)1羽份 (IO3-5EID50), 21日後分別採血，分離血清，各用雞傳染性支氣管炎滅活疫苗加強免疫接種 (肌肉注射)1羽份(0. 5ml), 28日後分別採血，分離血清。將兩次血清分別測HI抗體效價。二 .雞傳染性支氣管炎血球凝集抑制(HI)試驗1.雞傳染性支氣管炎HI抗原血球凝集價測定(1)吸取25 μ 1濃度為0. 01mol/L pH為7. 2的PBS，加到V型微量反應板各孔；(2)取25 μ 1雞傳染性支氣管炎血球凝集抑制抗原加入反應板第一孔中，並做4個
孔重複；(3)將25 μ 1病毒抗原在反應板上橫向作2倍倍比稀釋；(4)各孔加入25 μ 1的(V/V)雞紅細胞；(5)用微量振蕩器混勻，4°C作用40min。直到紅細胞對照孔完全沉澱為止。以使 100%紅細胞凝集的抗原最高稀釋倍數作為判定終點，表示一個血球凝集單位(1HA單位)。2. 4HA單位抗原的配製根據測定的抗原血球凝集(HA)效價，用PBS配製4HA單位抗原(1)將配置好的4HA單位抗原用PBS稀釋，使4HA單位抗原的稀釋度為1 2、 1 3、1 4、1 5、1 6、1 7 ；(2)在每一稀釋度的25 μ 1抗原中加25 μ IPBS ；(3)再加入1 % (V/V)雞紅細胞懸液25 μ 1，混勻，4°C靜置40min後判定結果；(4)結果判定如果1 4稀釋為100%紅細胞凝集終點，表明配製的是4HA單位抗原；如果100% 紅細胞凝集終點是1 5或1 6則表明配製的4HA單位抗原實際上是高於4個單位；如 果100%紅細胞凝集終點是1 2或1 3則表明配製的4HA單位抗原實際上是低于于4 個單位。應當適當的調整使抗原工作液為4HA單位。3.血球凝集抑制試驗(1)取96孔V型微量反應板，每孔加入25 μ IPBS ；(2)分別吸取25 μ 1待檢血清，加至每塊板的第一排各相應孔內，並在每塊板上設 標準陽性血清和陰性血清對照，然後2倍系列稀釋；(3)分別向各孔中加入含4ΗΑ單位的抗原25μ 1，4°C靜置30min ；(4)每孔加入雞紅細胞懸液25μ 1，輕輕混勻，4°C靜置40min ；(5)結果判定將反應板傾斜，凡血清反應孔與紅細胞對照孔中紅細胞以同樣速度從孔底流淌者 判為血球凝集抑制。當陰性血清HI效價< 31og2、陽性血清HI效價與規定效價相比誤差 ^ llog2時，實驗方可成立。三.疫苗評價以完全抑制4HA單位抗原的血清最高稀釋度作為HI效價。若二免血清的HI抗體 幾何平均滴度較首免血清HI抗體幾何平均滴度高3倍以上時，疫苗判為合格。
6
實施例2雞傳染性支氣管炎滅活疫苗免疫實驗動物的HI抗體價與攻毒保護率之間的平行 關係用3批疫苗每批將30隻21日齡的SPF雞分為3組，每組10隻，各點眼接種傳染 性支氣管炎活疫苗(H12tl毒株)1羽份(IO3 5EID5tl),在正壓隔離器裡飼養觀察(同時設立不 免疫對照組10隻)，免疫後21日分別採血分離血清測HI抗體，同時每隻各肌肉注射雞傳染 性支氣管炎滅活疫苗加強免疫，第一組1羽份(0. 5ml)，第二組1/2羽份(0. 25ml)，第三組 1/3羽份(0. 17ml)。加強免疫28日後分別採血分離血清測HI抗體，同時連同不免疫對照 組分別用雞傳染性支氣管炎M41強毒每羽滴鼻攻毒103_°EID5(I，作攻毒實驗。一免、二免待檢血清通過血球凝集抑制試驗測定HI，以血清反應孔與紅細胞對照 孔中紅細胞以同樣速度從孔底流淌者判為血球凝集抑制，且陰性血清HI效價< 31og2、陽 性血清HI效價與規定效價相比誤差< llog2，以完全抑制4HA單位抗原的血清為最高稀釋 度作為HI效價。結果如下表1。攻毒後在負壓隔離器中飼養觀察，4天後採集每隻雞的氣管拭子，置3ml含抗生素 的肉湯中。每份樣品經尿囊腔接種19日齡SPF雞胚5枚，每胚接種0.2ml，分離病毒。5個 雞胚中至少有2個雞胚出現雞傳染性支氣管炎特異性病變判為病毒分離陽性。結果如下表 1。表1雞傳染性支氣管炎滅活疫苗不同免疫劑量免疫抗體與攻毒保護率相關性
權利要求
一種雞傳染性支氣管炎滅活疫苗的效力檢驗方法，其特徵在於包括如下步驟1)用雞傳染性支氣管炎疫苗首次免疫雞，免疫14～28日後採血分離血清，用雞傳染性支氣管炎滅活疫苗加強免疫1次，21～35日後採血並分離血清；2)分別測定兩次血清的血球凝集抑制效價，以兩次血球凝集抑制效價之比判斷疫苗的效力。
2.根據權利要求1所述方法，其特徵在於，所述雞傳染性支氣管炎活疫苗首次免疫方 法為點眼或滴鼻免疫。
3.根據權利要求1所述方法，其特徵在於，所述首免的免疫量為1羽份，每羽份病毒含 量彡 IO3-5EID500
4.根據權利要求1所述方法，其特徵在於，所述雞傳染性支氣管炎滅活疫苗加強免疫 方法為皮下注射或肌肉注射。
5.根據權利要求1所述方法，其特徵在於，所述加強免疫的免疫量為1羽份，每羽份的 量為 0. 3ml 0. 8ml。
6.根據權利要求1所述方法，其特徵在於，加強免疫在首次免疫後21日。
7.根據權利要求1所述方法，其特徵在於，所述血球凝集抑制效價之比為血球凝集抑 制效價的幾何平均滴度之比。
8.根據權利要求1所述方法，其特徵在於，所述血球凝集抑制效價的測定方法，包括如 下步驟1)雞傳染性支氣管炎血球凝集試驗HA抗原二倍系列稀釋。將25 μ 1紅細胞懸液加入 含有25 μ 1稀釋抗原的反應孔內，充分振蕩，在2 8°C靜置40min，判定結果時將反應板傾 斜與水平呈45°角，對照孔內和HA陰性孔的紅細胞完全沉澱到孔底中心，呈淚珠樣流淌； HA陽性孔的紅細胞均勻分布在孔底或呈鋸齒樣凝集，使紅細胞凝集的最大稀釋倍數為該抗 原的HA效價；2)血清樣品的處理將血清樣品置於56°C水浴中滅活30min，2000r/min離心 IOmin,取上清待檢；3)雞傳染性支氣管炎血球凝集抑制試驗在96孔V型微量反應板，每 行第2孔開始，每孔加入25 μ 1稀釋液至12孔，分別在1、2和12孔加入待檢血清25 μ 1，從 第2孔開始倍比稀釋血清至第10孔，棄去25 μ 1，向1 11孔加入4ΗΑ單位抗原25 μ 1，充 分振蕩，置室溫30min，每孔加入1 % V/V雞紅細胞懸液25 μ 1，輕輕混勻2 8°C靜置40min， 判定結果時將反應板傾斜45°，紅細胞完全沉澱到孔底中心呈淚珠樣流淌為HI陽性，紅細 胞均勻分布在孔底不流動者為HI陰性，完全抑制紅細胞凝集的最高稀釋倍數為待檢血清 的HI抗體效價。
9.根據權利要求1所述的雞傳染性支氣管炎滅活疫苗的效力檢驗方法，其特徵在於， 加強免疫後的血清的HI抗體幾何平均滴度較首次免疫的血清HI抗體幾何平均滴度高3倍 以上時，疫苗判為合格。
10.根據權利要求1所述方法，其特徵在於，所述方法在雞傳染性支氣管炎疫苗的質量 控制中的應用。
11.根據權利要求10所述方法，其特徵在於，所述疫苗的質量控制包括攻毒保護率與 產蛋效能的控制。
全文摘要
本發明公開了一種雞傳染性支氣管炎滅活疫苗的效力檢驗方法，同時本發明還可應用於疫苗的質量控制，具體包括攻毒保護率與產蛋效能的控制。實驗證實該發明使用檢測HI抗體效價的方法代替本動物攻毒試驗，方法簡便、快速、結果準確、重複性強、特異性強等特點，具有普遍推廣的意義。
文檔編號G01N33/543GK101957362SQ201010273228
公開日2011年1月26日 申請日期2010年9月2日 優先權日2010年9月2日
發明者喬榮岑, 孫進忠, 張許科 申請人:洛陽普萊柯生物工程有限公司