一種酪氨酸酶及其工程菌、製備方法和應用

2023-10-29 13:44:45

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1.本發明屬於酶的基因工程技術領域，具體涉及迭代飽和突變技術獲得酶活力提高的酪氨酸酶突變體及其製備。


背景技術：

2.酪氨酸酶(tyrosinase,tyr,ec 1.14.18.1)又稱多酚氧化酶和兒茶酚氧化酶等，是一種參與黑色素合成的「3」型雙核含銅金屬酶。在分子氧存在的條件下，酪氨酸酶可以單酚為底物進行兩次連續的反應，首先，將單酚作為底物進行催化，生成鄰苯二酚，進一步以鄰苯二酚為底物，氧化生成醌類物質，醌類物質會自發的聚合形成黑色素。酪氨酸酶廣泛存在於人體、動植物以及微生物中，在不同來源的酪氨酸酶中，其活性位點是高度保守的，均有六個組氨酸殘基協調兩個銅離子激活酪氨酸酶活性。
3.在哺乳動物體內，酪氨酸酶催化生成的黑色素，可以起到動物皮膚、毛髮等組織細胞中的染色作用，幫助眼睛與皮膚抵禦紫外線輻射，哺乳動物酪氨酸酶功能的衰退與缺失還會引起白化病和白癜風，常見的帕金森病也與其有關；在植物中酪氨酸酶更多被稱為多酚氧化酶，參與單寧和黃酮類的酚類聚合物的合成，引起水果和蔬菜等植物的褐變；在昆蟲體內酪氨酸酶常以酶原形式存在，在昆蟲的不同部位完成不同的生理功能，是昆蟲角質硬化唯一用到的酶，在節肢動物中還參與到傷口癒合等生理過程。
4.目前，酪氨酸酶已在多個領域中具有廣泛應用。在生物醫藥的應用方面，目前左旋多巴主要的合成方法是化學合成，存在反應過程複雜和需要金屬催化劑等問題，而左旋多巴是酪氨酸酶以酪氨酸為底物的第一個產物，因此，可以利用酪氨酸酶催化酪氨酸合成左旋多巴；在蛋白質交聯方面，在食品加工中，蛋白質會因為其所處條件的變化發生蛋白質的交聯，使其結構發生變化，對食品的特性影響很大，直接導致產品的營養與性質的改變，相比於傳統交聯劑，酪氨酸酶的底物特異性更廣泛，目前已有很多使用酪氨酸酶作為肉類、奶製品和植物蛋白食品的交聯劑的應用；在環境保護方面，苯酚、甲酚等酚類化合物具有毒性且不易降解，大多數酚類化合物被認為是環境汙染物，對泌尿系統、消化系統、呼吸系統和神經系統造成負面影響。通過離子交換、光催化和酶生物催化降解法去除酚類化合物。酪氨酸酶由於其可以酚類物質為底物，催化生成醌類物質，可以對苯酚等有毒有機物進行催化脫毒；在生物檢測方面，酪氨酸酶由於可以特異性識別酚類物質而被開發出一些生物檢測器，用於檢測例如紅酒等樣品中的多酚含量。
5.酪氨酸酶幾乎存在於自然界的各個領域，參與各種生物學功能。目前已經有多種包括真菌、細菌、動物等不同來源的酪氨酸酶被分離純化，並成功獲得了多個來源酪氨酸酶的晶體結構。研究發現，不同來源的酪氨酸酶胺基酸殘基數目相差較大，但大部分成熟的酪氨酸酶蛋白的分子量為35-50kda左右。
6.酶分子改造是改善蛋白質功能和活性的重要手段，主要包括定向進化、理性設計和半理性設計，在對蛋白質結構及其催化位點不了解的情況下多選擇定向進化手段對酶分子進行改造，隨著更多的蛋白質結構被解開和計算機對蛋白質結構預測的發展，越來越多
的採取理性設計和半理性設計對酶分子進行改造，通過對蛋白質結構及其催化機制的分析，理性的分析和選擇可能影響蛋白質活性的和功能的胺基酸位點，通過定點突變獲得較少突變體，建立篩選體系，達到快速高效篩選得到理想突變體的目的，相比於定向進化，具有更高的效率和更少的工作量。
7.芽孢桿菌表達系統與常用的大腸桿菌表達系統相比，可將表達產物分泌到胞外，有利於對產物的分離純化，芽孢桿菌屬遺傳背景研究清晰、生長速度快、對培養基要求低等優點，被廣泛應用於農業、食品、醫藥、工業等領域。
8.在本發明中，對野生型酪氨酸酶基因進行迭代飽和突變獲得高活力的酪氨酸酶突變基因，並且實現了其在解澱粉芽孢桿菌表達系統中的高效表達，得到了產高活力酪氨酸酶的突變體菌株。


技術實現要素：

9.基於現有技術存在的問題，為了進一步推動酪氨酸酶在工業領域的應用，需對其現有性質作進一步的提升，本發明的目的在於提供一種高活力酪氨酸酶的突變體。
10.實現本發明目的的技術路線概述如下：
11.對來自阿耶波多氏桿菌(bacillus aryabhattai)tccc 111983的酪氨酸酶進行突變獲得的突變體g43r進行迭代飽和突變，其編碼基因為tyrm1，利用大腸桿菌表達系統篩選得到tyr突變體g43r/m61h、g43r/m61h/a232c、g43r/m61h/a232c/q214d、g43r/m61h/a232c/q214d/v217a、g43r/m61h/a232c/q214d/v217a/f197w，及其編碼基因tyrm2、tyrm3、tyrm4、tyrm5、tyrm6，並實現了各突變體在解澱粉芽孢桿菌中的高效表達，通過發酵、提取等技術獲得酶活力提高的tyr突變體。
12.本發明提供的技術方案之一，是一種酪氨酸酶突變體，所述突變體是在seq id no.1所述的野生型酪氨酸酶基礎上發生g43r、m61h、a232c、q214d、v217a、f197w等突變中的至少一種獲得的；
13.進一步地，所述酪氨酸酶突變體為g43r/m61h突變體，具有seq id no.5所示的胺基酸序列；
14.更進一步地，所述g43r/m61h突變體的編碼基因tyrm2具有seq id no.6所示的核苷酸序列；
15.進一步地，所述酪氨酸酶突變體為g43r/m61h/a232c突變體，具有seq id no.7所示的胺基酸序列；
16.更進一步地，所述g43r/m61h/a232c突變體的編碼基因tyrm3，具有seq id no.8所示的核苷酸序列；
17.進一步地，所述酪氨酸酶突變體為g43r/m61h/a232c/q214d突變體，具有seq id no.9所示的胺基酸序列；
18.更進一步地，所述g43r/m61h/a232c/q214d突變體的編碼基因tyrm4，具有seq id no.10所示的核苷酸序列；
19.進一步地，所述酪氨酸酶突變體為g43r/m61h/a232c/q214d/v217a突變體，具有seq id no.11所示的胺基酸序列；
20.更進一步地，所述g43r/m61h/a232c/q214d/v217a突變體的編碼基因tyrm5，具有
seq id no.12所示的核苷酸序列；
21.進一步地，所述酪氨酸酶突變體為g43r/m61h/a232c/q214d/v217a/f197w突變體，具有seq id no.13所示的胺基酸序列；
22.更進一步地，所述g43r/m61h/a232c/q214d/v217a/f197w突變體的編碼基因tyrm6，具有seq id no.14所示的核苷酸序列。
23.本發明提供的技術方案之二，是包含上述突變體編碼基因的重組質粒或重組菌株；
24.進一步地，所述重組質粒採用的表達載體為pet22b，或pbsa43質粒；
25.進一步地，所述重組菌株採用的宿主細胞為大腸桿菌bl21，或解澱粉芽孢桿菌cgmcc no.11218；
26.優選地，所述重組菌株是將突變體編碼基因與表達載體pbsa43連接後在宿主解澱粉芽孢桿菌cgmcc no.11218中表達所得。
27.本發明提供的技術方案之三，是上述重組質粒或重組菌株的應用，特別是在生產酪氨酸酶中的應用。
28.本發明提供的技術方案之四，是技術方案一所述酪氨酸酶突變體的應用，具體是在單酚氧化中的應用，特別是應用於生物醫藥、食品加工、環境保護、生物檢測等技術領域中。
29.本發明的實驗方案具體如下：
30.1、tyr突變體編碼基因的獲得，包括如下步驟：
31.(1)以seq id no.4所示的g43r突變體編碼基因tyrm1為出發基因，構建表達載體pet22b-tyrm1，進行迭代飽和突變；
32.(2)將突變後的tyr編碼基因，通過構建重組質粒後轉入大腸桿菌bl21中，經篩選獲得酶活力提高的tyr突變體，經測序獲得tyr突變體編碼基因tyrm2、tyrm3、tyrm4、tyrm5、tyrm6，將含有酶活力提高的tyr突變體編碼基因的質粒pet22b-tyrm2、pet22b-tyrm3、pet22b-tyrm4、pet22b-tyrm5、pet22b-tyrm6保存。
33.2、所述tyr突變體g43r、g43r/m61h、g43r/m61h/a232c、g43r/m61h/a232c/q214d、g43r/m61h/a232c/q214d/v217a、g43r/m61h/a232c/q214d/v217a/f197w的酶學特性如下：
34.(1)比活：tyr突變體g43r的比活為218.7u/mg，tyr突變體g43r/m61h、g43r/m61h/a232c、g43r/m61h/a232c/q214d、g43r/m61h/a232c/q214d/v217a、g43r/m61h/a232c/q214d/v217a/f197w的比活分別為292.0u/mg、377.4u/mg、469.9u/mg、550.4u/mg、677.8u/mg。
35.(2)最適反應溫度：60℃。
36.(3)最適ph：5.0。
37.3、含有酪氨酸酶編碼基因的解澱粉芽孢桿菌重組菌株及以其製備酶活力提高的酪氨酸酶的過程，包括如下步驟：
38.(1)將tyr突變體編碼基因tyrm2、tyrm3、tyrm4、tyrm5、tyrm6與解澱粉芽孢桿菌表達質粒pbsa43通過連接得到新的重組質粒pbsa43-tyrm2、pbsa43-tyrm3、pbsa43-tyrm4、pbsa43-tyrm5、pbsa43-tyrm6；
39.(2)將重組質粒轉入解澱粉芽孢桿菌cgmcc no.11218中，經卡納黴素(kan)抗性篩
選，酶切驗證得到重組菌株，之後將重組菌株進行培養發酵，得到酪氨酸酶。
40.在本發明中採用如下定義：
41.1.胺基酸和dna核酸序列的命名法
42.使用胺基酸殘基的公認iupac命名法，用單字母或三字母代碼形式。dna核酸序列採用公認iupac命名法。
43.2.酪氨酸酶突變體的標識
44.採用「原始胺基酸位置替換的胺基酸」來表示tyr突變體中突變的胺基酸。如gly43arg，表示位置43的胺基酸由野生型tyr的gly替換成arg，位置的編號對應於seq id no.1中野生型tyr的胺基酸序列編號。
45.在本發明中，小寫斜體tyr表示野生型酪氨酸酶tyr的編碼基因，小寫斜體tyrm1表示突變體g43r的編碼基因，小寫斜體tyrm2、tyrm3、tyrm4、tyrm5、tyrm6分別表示突變體g43r/m61h、g43r/m61h/a232c、g43r/m61h/a232c/q214d、g43r/m61h/a232c/q214d/v217a、g43r/m61h/a232c/q214d/v217a/f197w的編碼基因，信息如下表。
[0046][0047]
有益效果：
[0048]
1、本發明利用迭代飽和突變技術對tyr突變體g43r進行突變，得到酶活力提高的突變體g43r/m61h、g43r/m61h/a232c、g43r/m61h/a232c/q214d、g43r/m61h/a232c/q214d/v217a、g43r/m61h/a232c/q214d/v217a/f197w，在解澱粉芽孢桿菌表達系統內發酵酶活最高值分別為3040.4u/ml、3591.7u/ml、4798.8u/ml、5228.6u/ml、6901.9u/ml。
[0049]
2、本發明使用了解澱粉芽孢桿菌表達系統實現酶活力提高的tyr突變體的高效表達。
附圖說明：
[0050]
圖1為野生型tyr、突變體g43r和本發明突變體g43r/m61h、g43r/m61h/a232c、g43r/m61h/a232c/q214d、g43r/m61h/a232c/q214d/v217a、g43r/m61h/a232c/q214d/v217a/f197w蛋白純化樣品的sds-page圖；
[0051]
其中：m為protein marker，1為野生型tyr超濾濃縮樣品、2為突變體g43r超濾濃縮
樣品、3為突變體g43r/m61h超濾濃縮樣品、4為突變體g43r/m61h/a232c超濾濃縮樣品、5為突變體g43r/m61h/a232c/q214d超濾濃縮樣品、6為突變體g43r/m61h/a232c/q214d/v217a超濾濃縮樣品、7為突變體g43r/m61h/a232c/q214d/v217a/f197w超濾濃縮樣品。
具體實施方式：
[0052]
下面結合實施例對本發明的技術內容做進一步說明，但本發明不只限於這些實施例，不能以下述實施例來限定本發明的保護範圍。
[0053]
本發明實施例所用培養基如下：
[0054]
lb培養基(g/l)：酵母提取物5.0，胰蛋白腖10.0，nacl 10.0，其餘為水。
[0055]
培養基的固態培養基添加2％瓊脂。
[0056]
本發明野生型酪氨酸酶tyr來自阿耶波多氏桿菌(bacillus aryabhattai)，胺基酸如seq id no.1所示：
[0057]
msnkykvrknvlsltdaekrdfiravlilkkkgiydryiawhgaagkfhtppssdrnaahmssaflpwhreyllrferdlqsidsevtlpywewetdaqlqdpsqsqiwsadfmggngnpkkdfivdtgpfvagrwttideqgnpsgglkrnfgatkeaptlptrddvlnalkitkydtppwdmtsqnsfrnqlegfingpqlhnrvhrwvggqmgvvptapndpvfflhhanvdriwavwqmvhrnqnyqpmkngpfgqnfrdpmypwnttpedvmnhrklgyvydielrkskrss。
[0058]
以下將通過具體實施例對本發明作進一步解釋說明。
[0059]
實施例1：tyr突變體的獲得
[0060]
1.突變位點的選擇：對tyr蛋白質結構及催化機制進行分析，選擇了銅離子結合位點周圍胺基酸殘基(trp41、gly43、ala59、met61、trp68、arg70、leu203、asn205、val207、arg209、his230和ala232)、底物結合位點周圍胺基酸殘基(gln214、met215、gly216、val217、val218和pro219)和介導水分子去質子化保守胺基酸位點周圍胺基酸殘基(glu195、gly196、phe197、ile198、asn199、gly200、pro201、gln202、leu203、asn205)。按照銅離子結合位點周圍胺基酸殘基、底物結合位點周圍胺基酸殘基和介導水分子去質子化保守胺基酸位點周圍胺基酸殘基三個區域的順序，對每個區域選擇的位點逐一進行迭代飽和突變。
[0061]
2.反向pcr：以seq id no.4所示的g43r突變體編碼基因tyrm1為出發基因，與pet22b質粒連接構建表達載體pet22b-tyrm1，以重組質粒pet22b-tyrm1為出發模板利用反向pcr進行迭代飽和突變，反向pcr所用引物及反應體系如下：
[0062]
[0063][0064][0065]
註：上述反向pcr所需試劑來自東洋紡(上海)生物科技有限公司的kod-plusmuragenesiskit。
[0066]
將反應體系按上述配比混勻後，進行反向pcr反應，程序設置如下：
[0067][0068]
pcr反應結束後，將pcr產物進行消化去模板後使自身環化連接，通過轉化大腸桿菌bl21，塗布於含氨苄青黴素(100μg/ml)的lb固體培養基，37℃培養箱靜置培養12h，得到轉化子。
[0069]
3.篩選方法：本實驗採用螢光檢測法進行酪氨酸酶單酚酶活力的測定，螢光光譜儀可以在275nm的激發波長下測量穩定酪氨酸的螢光，發射光通過280-420nm掃描獲得，激發與發射單色儀的狹縫寬度設置在3-5nm。由於發酵上清存在目的蛋白，可以直接用發酵上清進行篩選，螢光強度越低，代表底物消耗量越大，證明酶活性更高。
[0070]
4.突變體文庫的篩選：在96孔板1中每個孔中加入200μl含氨苄青黴素(100μg/ml)的lb液體培養基，隨後，用滅過菌的牙籤挑取每一個轉化子的單克隆至96孔板中，挑取過程中儘可能使得每次都剛好沾到少量的菌。將96孔板轉移至搖床培養，160rpm，37℃培養48h。然後採用低溫離心機(4℃)，4000rpm離心10min，取10μl發酵上清加入到200μl反應液中，60℃反應5min，檢測反應體系的螢光強度。
[0071]
溶液：(1)2mmol/ll-酪氨酸溶液：準確稱取36mgl-酪氨酸，用tris-hcl(ph7.0)溶解並定容至100ml，4℃冰箱保藏；
[0072]
(2)0.2mol/l硼酸溶液：用700ml去離子水溶解12.37g的硼酸，定容至900ml。
[0073]
(3)0.2mol/l硼砂溶液：用80ml去離子水溶解1.907g的硼砂，定容至100ml。
tyrm5、cgmcc no.11218/pbsa43-tyrm6。
[0089]
實施例3：酶活力提高的酪氨酸酶在解澱粉芽孢桿菌重組菌中的表達及製備
[0090]
1.將解澱粉芽孢桿菌重組菌株cgmcc no.11218/pbsa43-tyrm1、cgmcc no.11218/pbsa43-tyrm2、cgmcc no.11218/pbsa43-tyrm3、cgmcc no.11218/pbsa43-tyrm4、cgmcc no.11218/pbsa43-tyrm5、cgmcc no.11218/pbsa43-tyrm6分別接種於含卡納黴素(50μg/ml)lb液體培養基中，37℃，220r/min培養過夜；
[0091]
2.按1％接種量轉接於50ml的lb培養基中，37℃，220r/min培養48h，4000r/min離心15min後收集上清獲得高活力tyr粗酶液，以l-酪氨酸為底物在60℃，ph＝7.0的條件下，測定tyr突變體粗酶液酶活力。
[0092]
3.隨後收集發酵液上清，先以25％飽和度的硫酸銨鹽析除去雜蛋白，再把飽和度加大到65％，沉澱目的蛋白。溶解後透析除鹽，再將鹽析脫鹽後得到的活性組分用0.02mol/ltris-hcl(ph 8.0)緩衝液溶解，上樣至離子交換層析柱後用同樣的緩衝液先洗脫未吸附的蛋白，再用含0～1mol/lnacl的0.02mol/ltris-hcl(ph 8.0)緩衝液梯度洗脫，收集目的蛋白。離子交換得到的活性組分先用含0.15mol/l nacl的0.02mol/l tris-hcl(ph8.0)緩衝液平衡，上樣至凝膠柱後用相同的緩衝液以0.5ml/min的速度洗脫，獲得純化的酶液。純化後酶液經冷凍乾燥製得高活力tyr純酶酶粉。蛋白純化樣品的sds-page圖件圖1。
[0093]
實施例4：酪氨酸酶酶活力測定
[0094]
1.酪氨酸酶酶活測定原理
[0095]
螢光光譜儀可以在275nm的激發波長下測量穩定酪氨酸的螢光，發射光通過280-420nm掃描獲得，激發與發射單色儀的狹縫寬度設置在3-5nm。由於發酵上清存在目的蛋白，可以直接用發酵上清進行篩選，螢光強度越低，代表底物消耗量越大，證明酶活性更高。
[0096]
2.本發明採用的酪氨酸酶酶活測定方法與步驟
[0097]
在終體積為3ml反應體系中加入0.14ml 2mmol/l的酪氨酸溶液(終濃度為70μm)，1μl羥胺，用硼酸鹽溶液補足至3ml，在60℃下保溫1min，加入20μl酶液(實施例3獲得的tyr粗酶液)吹吸混勻，反應5min，將反應的初始的螢光強度和反應後的螢光強度記錄下來。樣品均含有3組平行實驗。
[0098]
空白對照：100℃處理酶液10min使酶失活，使用熱失活的酶液作為對照，反應體系及方法同上。
[0099]
註：溶液：(1)2mmol/l l-酪氨酸溶液：準確稱取36mg l-酪氨酸，用tris-hcl(ph7.0)溶解並定容至100ml，4℃冰箱保藏；
[0100]
(2)0.2mol/l硼酸衝液：用700ml去離子水溶解12.37g的硼酸，定容至900ml。
[0101]
(3)0.2mol/l硼砂溶液：用80ml去離子水溶解1.907g的硼砂，定容至100ml。
[0102]
(4)硼酸鹽緩衝液：將900ml硼酸溶液與100ml硼砂溶液混合，混合均勻後的ph為7.4。
[0103]
3.酪氨酸酶活的定義及計算
[0104]
酶活定義：在一定反應條件下(如未特別說明，條件為：60℃，ph7.0)，每分鐘消耗1μmol的l-酪氨酸所需要的酶量定義為一個酶活力單位，記為u/ml。
[0105]
酶活力計算：
[0106]
酶活力：u/ml＝x
×v1
/y
×
δt
×v2
[0107]
式中：x代表從反應開始到結束，螢光強度的變化量；
[0108]v1
代表反應體系的總體積(μl)；
[0109]
δt代表從反應開始到結束所用時間(min)；
[0110]v2
代表在反應體系中酶液的體積(μl)；
[0111]
y代表以檢測酪氨酸螢光強度的標準曲線的斜率。
[0112]
酶比活(u/mg)＝酶活力/蛋白濃度。
[0113]
4.對實施例3解澱粉芽孢桿菌表達系統所得發酵液酶活進行測定，g43r突變體酶活為2087.5u/ml，g43r/m61h、g43r/m61h/a232c、g43r/m61h/a232c/q214d、g43r/m61h/a232c/q214d/v217a、g43r/m61h/a232c/q214d/v217a/f197w突變體分別為3040.4u/ml、3591.7u/ml、4798.8u/ml、5228.6u/ml、6901.9u/ml。
[0114]
實施例5：利用高活力突變體g43r/m61h/a232c/q214d/v217a/f197w以單酚為底物合成雙酚
[0115]
以l-酪氨酸為底物，tyr為催化劑製備左旋多巴為例。在50ml l-酪氨酸濃度為0.5mmol/l，銅離子濃度為2μmol/l，抗壞血酸濃度為2mmol/l的反應體系中，tyr突變體g43r/m61h/a232c/q214d/v217a/f197w酶添加量為250u，反應條件為35℃、ph 7.0，在反應5min、15min、30min、60min和120min時取樣檢測左旋多巴的產率，左旋多巴的產率分別為27.39％、48.63％、65.27％、81.64％和84.5％。
[0116]
以上所述實施例僅表達了本發明的幾種實施方式，其描述較為具體和詳細，但並不能因此而理解為對專利範圍的限制。應當指出的是，對於本領域的普通技術人員來說，在不脫離本專利構思的前提下，上述各實施方式還可以做出若干變形、組合和改進，這些都屬於本專利的保護範圍。因此，本專利的保護範圍應以權利要求為準。