一種分離的李斯特單核增生菌噬菌體及其應用的製作方法

2023-10-29 16:57:57 2

專利名稱：：一種分離的李斯特單核增生菌噬菌體及其應用的製作方法
技術領域：
：本發明涉及到能夠特異性裂解李斯特單核增生菌""ter/amoTOcytogenes)蘭'株的噬菌體分離物和其作為生物殺菌劑在食品及在抗感染中的應用。屬於生物工程領域。
背景技術：
：李斯特菌是近十幾年來報導較多的病原菌之一，該菌分布十分廣泛，且該菌在4'C時仍能夠緩慢生長。食品是該菌致病的主要載體,肉類,蛋類,禽類，海產品，乳製品，蔬菜等都已被證實是李斯特菌的感染源。易感者為新生兒、孕婦、40歲以上的成人，免疫功能缺陷者。由該菌引起的人畜共患性疾病已成為全球性疾病。在西方國家，李斯特翁的感染最近呈上升趨勢，曾經在美國、加拿大、法國等國家引起嚴重的食品中毒事件，已成為--個典型的環境衛生問題。最新資料表明，北京零售鮮肉和蒸煮肉製品上李斯特單核增生菌的汙染率分別為8%和4%。李斯特單核增生菌己在許多類型的西式肉製品如法蘭克福香腸，鹹牛肉和蒸煮火腿中檢出。歐洲和加拿大的即食肉製品中其檢出率在13%到50%之間.在速凍食品中李斯特菌汙染率較高達14.3%,隨著我國現代化食品加工業的發展,一旦存在此菌的汙染源,就可導致大量產品的汙染.由於李斯特菌其低溫增值的特性，容易達到感染的菌量。目前防治細菌感染的傳統方法主要為大量使用抗生素和添加化學殺菌物質。廣泛應用抗生素非但成本高而且已經催生很多超級耐藥細菌，而應用化學製劑殺菌不但對環境造成汙染，且對人類健康造成危害。噬菌體(bacteriophage,phage)是一種細菌病毒，可以特異性感染並裂解一種或少數幾種細菌。一類噬菌體感染細菌後將其遺傳物質整合到細菌的DNA裡，隨著細齒的繁殖而繁殖，一旦外界條件合適就裂解細菌細胞，而引起細菌死亡，這種噬菌體叫做溫和噬菌體。另一類噬菌體一旦感染細菌，就利用細菌合成子代噬菌體，然後裂解細菌細胞而釋放，這種
發明內容本發明的一個目的是開發對李斯特單核增生菌具有強烈裂解作用的噬菌體分離物，該分離物可以單獨或混合使用可以特異性的部分或完全滅活李斯特單核增生菌，為工業化生產噬菌體殺菌劑提供噬菌體株來源。本發明的另一目的是開發一種新型的安全的生物殺菌劑作為食品添加劑防止由李斯特單核增生菌引起的食品汙染，避免由於食用該菌汙染的食品引起的細菌感染。本發明的又一目的是提供一種用於食品特別是方便即食產品生產環境的安全的生物淨化殺菌劑用以防止食品加工過程中造成的李斯特單核增生菌汙染。本發明的再一目的是為治療由李斯特單核增生菌引起的感染提供潛在治療藥物。本發明從自然界中分離得到噬菌體分離物，該噬菌體分離物包括一種或多種對李斯特單核增生菌具有裂解作用的噬菌體，經純化可得噬菌體單體。證明該噬菌體分離物中的噬菌體單獨或混合使用對李斯特單核增生菌具有實質裂解作用。上述分離出的噬菌體單體(單增李斯特菌噬菌體，拉丁名ListeriaMonocytogenesBacteriophage)命名為BPH-LM-1對李斯特單核增生菌均有廣譜的殺菌能力。噬菌體BPH-LM-1保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)(地址北京市朝陽區大屯路中國科學院微生物研究所)，保藏日期2007年11月13日，保藏編號2254。本發明中噬菌體BPH-LM-1經小鼠毒理實驗，給予1011pfu/kg的噬菌體樣品對實驗小鼠未見異樣，連續給予15天後，將小鼠斷頸處死，屍檢，違發現其內臟有異樣變化。與其他實驗結果相同。該噬菌體是安全的。本發明中噬菌體BPH-LM-1可以單獨或混合使用，在液體中的殺菌極限為終濃度7X105pfU/ml，g卩，在對數生長期內的李斯特單核增生菌中加入該噬菌體單體或混合物，可以在4-6h內完全滅活該菌。本發明中噬菌體可應用於液體食品，包括但不限於乳製品、飲料等防止李斯特單核增生菌的汙染。本發明中噬菌體BPH-LM-1可以單獨或混合使用，對被李斯特單核增生菌汙染的固體食品表面噴灑106pfu/ml-107Pfu/ml數量級的噬菌體，108pfu/ml-1011pfu/ml的效果尤佳，可以在24小時內完全滅活李斯特單核增生菌。且在一個月內李斯特單核增生菌檢驗呈陰性。提示本發明中噬菌體可應用於防止固體食品，包括但不限於方便即食產品的李斯特單核增生菌汙染。本發明中的噬菌體BPH-LM-1可以單獨或混合使用，可以作為殺菌劑噴灑於食品生產車間，可特異性、持續防止該環境中李斯特單核增生菌的生存和繁殖，防止食品加工過程中的汙染。本發明中的噬菌體BPH-LM-1可以單獨或混合使用，可作為一種潛在藥物治療由李斯特單核增生菌引起的細菌感染。本發明中噬菌體可以和其他噬菌體聯合使用，以或得較寬的噬菌範圍。本發明中噬菌體可以和其他抗菌劑混合使用，在獲得抗菌廣譜性的同時，對李斯特單核增生菌特異性殺滅。能與該發明中噬菌體聯合使用的抗菌劑包括但不限於抗生素和化學抗菌劑。本發明中噬菌體可應用於工業生產，可由宿主菌李斯特單核增生菌特異性擴增，可應用標準病毒純化方法高度純化，作為食品抗菌添加劑防止食品中李斯特單核增生菌汙染。本發明採用的噬菌體BPH-LM-1為單增李斯特菌噬菌體，拉丁名ListeriaMonocytogenesBacteriophage,保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)(地址北京市朝陽區大屯路中國科學院微生物研究所)，保藏日期2007年ll月13日，保藏編號2254。圖1為溫度對本發明所述的噬菌體BPH-LM-1的影響曲線2為本發明所述的噬菌體生長曲線圖3為本發明所述的噬菌體在固體食品火腿腸中的殺菌能力圖4為本發明所述的噬菌體在液體食品牛奶中的殺菌能力具體實施方法實施案l噬菌體的篩選和純化(一)樣品的採集及處理本發明中樣品採自珠海本地，包括中山大學第五附屬醫院未處理汙水、珠海市市內下水道汙水、排汙入海口處海水、珠海市家禽養殖場、珠海市養豬場、珠海市屠宰場。採集的樣品用NaOH調節，使pH約為7.0，經過4000r/min離心15min，用0.45um濾膜過濾得上清液。.取過濾除菌後的樣品75ml，加入25ml4倍LB培養基。(二)樣品中針對李斯特單核增生菌的噬菌體特異性擴增在處理好的樣品中加入預先擴增好的李斯特單核增生菌(0D600約為l.O，加入比例為l:100)，將其置於恆溫搖床30。C，250r/min培養6-8h。(三)斑點實驗測定特異性噬菌體李斯特單核增生菌雙層檢測平板的製備高溫滅菌0.75%-2.0%LB固體培養基，室溫放置至約40-60°C，取10-15ml傾倒至培養皿內，均勻鋪於皿底，室溫放置30min，使其凝固。將經過高溫滅菌的0.2%-0.9%1^瓊脂糖培養基融化，40°C-48。C水浴保溫。取李斯特單核增生菌0.2ml-0.8ml,加入步驟2中0.5。/。LB瓊脂糖3.6-5ml，混勻，倒入步驟l製得的培養皿內，室溫放置凝固。將李斯特單核增生菌雙層檢測平板3(TC保溫培養lh。取上述經李斯特單核增生菌擴增後的樣品lml，8000r離心15min，上清液經0.22um過濾膜過濾除菌。取5ul點於李斯特單核增生菌雙層檢測平板上，3(TC過夜培養，觀察有無噬斑，如果有進行步驟(四)。(以上操作均為無菌條件)(四)噬菌體樣品的分離及噬菌體樣品的擴增將步驟(三)中在李斯特單核增生菌雙層檢測平板中呈現噬斑的樣品，經過適當比例稀釋，按如下步驟純化。將製備好的LB平板，37。C平衡0.5h，使其表面溫度達到室溫(如果在室溫條件下放置可省去這一步)取0.4ml對數生長期(OD6000.4-0.8之間)、0.1ml擴增後的樣品和4ml0.5。/。agaroseLB混勻，倒於平板上，輕輕振蕩，使其鋪平，室溫放置約0.5小時，使表面徹底凝固。將雙層平板37。C培養4-6h觀察。挑選單個噬菌斑。將挑選出來的噬菌體單克隆，加入2ml對數生長期的相應菌種中，3(TC培育2h-6h，觀察待菌液變澄清，代表殺菌完全。重複3-5次，得到噬菌體單克隆樣品。並將其命名為Bra-LM-l。(五)噬菌體的純化應用宿主菌李斯特單核增生菌將噬菌體BPH-LM-1高度擴增，待培養基澄清後，8000g，離心10min，取出雜質，加入固體聚乙二醇(PEG8000)至終濃度為10%w/v，攪拌溶解，4。C過夜，4°C，8000g離心2(Mn，棄沉澱，重懸於緩衝液(100mMNaCl，5mMMgS04,lOmMTris-HClpH7.2)中，於37°C，保溫30min，期間振蕩數次。加入氯仿，漩渦混合30min，3000g離心5min，小心收集水相，將噬菌體懸液置氯化銫(p=1.4，1.6)密度梯度內lOOOOg，4'C離心2h，置強光下，收集乳狀條帶。4'C過夜透析除去鹽份，重複一次。將得到的噬菌體透析液4'C保存待用。實施例2噬菌體計數方法(效價)將所得噬菌體樣品按IO倍比例稀釋，取其中一定稀釋比例的樣品100ul，用實施例1的步驟(四)中的方法鋪雙層平皿，取合適比例的平皿計算噬斑個數，一個噬斑代表一個噬菌體單體。細菌計數方法(效價)採用標準平皿法計數噬菌體穩定性檢測l.溫度對噬菌體的影響在實驗前一天，檢測噬菌體的效價，將噬菌體樣品，分別放於4°C、室溫、37°C、50°C、70°C，保溫lh後測定效價。由此得到溫度對噬菌體的影響。將噬菌體在4。C、室溫和37'C保溫，在ld、5d、10d、15d、30d測定效價結果顯示在4。C、室溫、37'C保溫2h在誤差允許的範圍呢，噬菌體BPH-LM-1的效價幾乎沒有變化，說明在此溫度下噬菌體穩定性良好。在5(TC時，2h後效價降為原來的19%，而在7(TC時，2h能將噬菌體完全滅活(如表l)。表l設定溫度下保溫2h對噬菌體效價的影響表tableseeoriginaldocumentpage8在4'C放置噬菌體在一月內效價仍能夠保持原來的57%;室溫和37"C結果相同，效價下降較慢，5d時效價下降不足10%，分別為原來的93%和91%，在一月內效價是原來效價分別為16%和15%，仍維持在較高水平(如圖1)。2.ph對噬菌體殺菌能力的影響將噬菌體樣品分別於pHl-14，室溫保存2h，然後檢測其效價。結果，對於噬菌體BPH-LM-l最適pH為6-9，噬菌體的效價幾乎沒有變化。當pH為10的時候仍保持28%的活性。但是當pH〈5或pHMl效價下降很快(表2)。表2pH對噬菌體BPH-LM-1的影響tableseeoriginaldocumentpage83.高濃度鹽溶液對噬菌體的影響加入氯化鈉調整噬菌體樣品溶液的鹽濃度，使鹽濃度分別達到0.1M、0.3M、0.5M、1M、3M保存2h，將其稀釋，和對照組相比，檢測效價的變化。結果，顯示小劑量(0.1-0.3M)的NaCl有助於噬菌體的保存，且高濃度鹽對噬菌體沒有明顯的影響(表3)。表3鹽濃度對噬菌體的影響。tableseeoriginaldocumentpage9實施例3毒理實驗昆明小鼠，清潔級，體重22土3g，2月齡(合格證號SCXK(京)2004-0001)，由協和醫科大學試驗動物研究中心提供。試驗動物飼養於清潔級飼養室，室溫18-22°C，相對溼度40%-70%，12h日照和昏暗循環。實驗小鼠20隻，雌雄各半，適應性飼養3天後，隨機分為兩組(噬菌體組、對照組)，每組10隻(雌雄各5隻)，給予噬菌體組計量為10fu/kg的噬菌體BPH-LM-1，對照組給予等量生理鹽水，連續給藥15d,將實驗鼠斷頸處死，檢査內臟情況。觀察結果顯示，此計量的噬菌體BPH-LM-l對小鼠日常行為沒有影響。解剖檢查內臟未見異常。實施例4檢測噬菌體在固體食品中的殺菌效果此部分選取火腿腸作為試驗樣品，將火腿腸切為lcm左右方體，用於試驗。製備lX103pfu/ml、lX104pfu/ml的李斯特單核增生菌溶液。製備1X108pfu/ml的噬菌體樣品。火腿腸樣品分別置於上述菌液中，浸泡lh，取出置於無菌廣口瓶內，無菌環境下晾乾。上述火腿腸樣品取出一部分置於噬菌體樣品中，置於無菌廣口瓶中晾乾。將上述製備樣品置於室溫(約20-25。C)培養。檢測樣品總李斯特單核增生菌含量。結果證明，lX108pfU/ml的噬菌體溶液可以在1天內完全殺滅李斯特單核增生菌，且能夠對食品提供長久的保護(結果如圖3)。實施例4檢測噬菌體樣品在液體中的殺菌效果1.噬菌體計數方法(效價)將所得噬菌體樣品按10倍比例稀釋，取其中一定稀釋比例的樣品100lil，用步驟(四)中的方法鋪雙層平皿，取合適比例的平皿計算噬斑個數，一個噬斑代表一個噬菌體單體。2.細菌計數方法(效價)採用標準平皿法計數3.液體中殺菌效果實驗將噬菌體樣品按10倍比例稀釋，其中一部分按實施例2中方法測定效價，另一部分按如下方法檢測殺菌效果，取上述經稀釋的噬菌體樣品100ul，加入到2ml對數生長期的李斯特單核增生菌(3.4X107pfu/ml)中，30°C，250r/min培養。按照MOI(噬菌體/細菌)=0.1，接種噬菌體。3(TC保溫，然後分別於20min、40min、60min、90min、120min、240min測定噬菌體效價。結果顯示,BPH-LM-1的殺菌極限為105數量級，級當液體中噬菌體的含量達到105pfu/ml時，噬菌體可以給液體中完全殺滅李斯特單核增生菌。噬菌體潛伏期在20-40min內，在20min時，液體中李斯特單核增生菌的個數小於lpfu/ml.而在4h內無細菌增殖(如圖4)。權利要求1.一種噬菌體BPH-LM-1，保藏號為2254。2.權利要求1所述的噬菌體在防止李斯特單核增生菌汙染方面的應用。3.權利要求1所述的噬菌體作為一種食物添加劑用於防止食物李斯特菌汙染方面的應用。4.權利要求l所述的噬菌體在作為殺菌劑噴灑於食品生產車間，用於防止該環境中李斯特菌的生存和繁殖，防止食品加工過程中的汙染方面的應用。5.權利要求1所述的噬菌體作為一種治療李斯特菌感染的藥物的應用。全文摘要本發明公開了一種分離的李斯特單核增生菌噬菌體及其作為生物殺菌劑在食品和抗感染中的應用。所述的分離出的噬菌體單體(單增李斯特菌噬菌體，拉丁名ListeriaMonocytogenesBacteriophage)命名為BPH-LM-1對李斯特單核增生菌均有廣譜的殺菌能力。噬菌體BPH-LM-1保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)(地址北京市朝陽區大屯路中國科學院微生物研究所)，保藏日期2007年11月13日，保藏編號2254。文檔編號C12N7/00GK101220350SQ20071003141公開日2008年7月16日申請日期2007年11月16日優先權日2007年11月16日發明者磊劉,張智英申請人:珠海市晉平科技有限公司