連接蛋白半通道的特異性調節劑的製作方法

2023-09-24 12:38:30 2

本發明涉及鑑定由連接蛋白形成的半通道的特異性調節化合物(阻斷劑)的方法、在此方法學下所鑑定的化合物的新用途和包括這些化合物以用於治療與由連接蛋白形成的半通道的活性增加相關的疾病的藥物組合物，所述疾病諸如炎性疾病、血管紊亂、心律失常、慢性損傷、視網膜神經保護，疼痛治療，骨骼肌去神經支配，肌營養不良，缺血後再灌注(例如：心臟或腦梗塞)，脊髓損傷和以由連接蛋白形成的半通道的活性增加為特徵的遺傳疾病。

背景技術：

連接蛋白(connexin)為內在膜蛋白，其在原生質膜中呈六邊形布置，即稱之為連接子或半通道。兩個半通道可通過它們的胞外片段結合在一起以便形成通道間隙連接或者間隙連接，這允許許多物質在細胞間直接轉移(Sáez,Merthoud et al.2003)。在過去的十年裡，已經顯示出在生理條件下，半通道在代謝產物和營養物的轉移中發揮了重要作用(Chandrasekhar and Bera 2012)，而且其在細胞間信號分子(諸如ATP、穀氨酸、前列腺素E2和NAD+)的釋放中也發揮了重要作用，提供了用於自分泌和旁分泌信號在膜中的路徑(Wang,De Bock et al.2012)。但是，在不同的病理條件下，由連接蛋白形成的半通道的活性被上調，且顯著促進細胞變性的結果(Sáez,Schalper et al.2010)。

最近通過X射線晶體學的至解析度的連接蛋白的晶體結構測定(Maeda et al.2009)顯示半通道是間隙連接的保守動機，且它們可被看作結構單元模塊(Yeager,2009)。由連接蛋白26形成的半通道結構顯示每個單體由4個跨膜α螺旋(TM1-TM4)、2個胞外環(E1、E2)、1個胞內環以及一個N-端螺旋結構域(NTH)和C-端結構域組成。每個連接包含6個原體的布置且連接蛋白26的每個單體包含典型的四螺旋束，其中任何相鄰的螺旋對是反平行的(Maeda and Tsukihara,2011)。連接蛋白26的第二種結構的布置如下：各自地，TM1、TM2和E1面向孔；TM3、TM4和E2分別位於半通道的周邊中，所述半通道在膜脂或胞外環境之前；TM2和TM1位於細胞質中的一半被NTH覆蓋，且它們沒有被暴露(圖1)。

數條研究表明由連接蛋白形成的通道的特異性抑制劑的應用能夠在癲癇，心律失常，癌症，中風或其它狀況中具有治療作用(Spray,Rozental et al.2002)。雖然通過電生理技術和採用重組蛋白的體外實驗已經可以鑑別據說能直接作用在半通道或者通道以調節它們的功能的藥物，但是對於大部分(若非全部)到目前為止所報導的由連接蛋白形成的半通道抑制劑，它們的活性通過何種精確機制來調節以及轉運的特性仍舊未知(Juszczak and Swiergiel 2009)。此外，到目前為止所描述的所有化合物在微摩爾濃度都是有效的，這顯示它們幾乎不具有選擇性且它們中的許多還阻斷了由panexin形成的半通道(Varselis and Srinivas 2013)。因此，迫切地需要藥理學工具以進一步明確它們的功能並驗證它們作為藥理學靶標，用於發展針對基於連接蛋白功能紊亂的疾病的新的治療方法(Bodendiek and Raman 2010)。

目前存在數種連接蛋白調節劑，但是它們中的大多數同時影響由連接蛋白形成的半通道和通道的活性。此外，抑制連接蛋白表達的反義RNA或者嗎啉代的使用消除了半通道和間隙連接兩者的表達。因此，現有技術中所描述的化合物顯示出幾乎沒有功效和非特異性的作用機制或非特異性繼發於其它修飾連接蛋白活性的治療靶標(例如激酶)的藥理學作用。

在現有階段中存在描述了調節由連接蛋白形成的半通道的活性的組合物和方法的例如EP1469875,US7153822,WO2003063891,US20040092429,US20070042964 y WO2006134494專利或專利申請。在這樣的文獻所提出的機制中，存在連接蛋白43的C-端片段中的酪氨酸殘基的磷酸化，通過採用肽模擬物阻斷了2個半通道的結合，所述肽模擬物與半通道或者其跨膜區之間的結合區域類似，所述跨膜區修飾半通道的形成。但是，這些化合物對通過半通道的轉運沒有選擇性，而且它們還非特異性地影響間隙連接通道，。

此外，專利申請WO2007002139要求保護一種在視網膜細胞中通過降低響應於本地高血壓的連接蛋白介導的ATP釋放的神經保護方法。在此申請中，指定半通道阻斷劑可以為甲氟喹，甲氯滅酸，視黃酸，18-α-巨青黴烯酸(18-alpha-gliciretinic acid)，氟滅酸，尼氟酸(riflumic acid)，生胃酮，肽模擬物或其組合。但是，這些化合物對由連接蛋白形成的半通道沒有選擇性，因為它們還阻斷了間隙連接通道，藥理學作用依賴於ATP的轉運，所述ATP能夠通過另外的方式轉運到半通道。

在其它實例中，諸如申請WO2009148613，引入反義寡核苷酸、幹擾RNA或者siRNA的應用以抑制位於兩細胞之間的細胞間通道的表達，所述細胞間通道作為細胞表面的半通道。但是，這些寡核苷酸特異性調節連接蛋白43同工型(在人類中存在20種額外的連接蛋白)，且它們僅允許用於經皮給藥、靜脈注射或者沉積給藥(deposit administration)形式的製劑。

在申請JP2011506446中，描述了抗體或者結合抗原的片段的應用，其在慢性炎性疾病中並沒有效，因為會產生強烈的排斥反應或過敏反應。鑑於此，對於具有調節由連接蛋白形成的半通道的形成、打開或者活性功能的藥物的極大興趣是顯而易見的。

在申請US20110223204中，調節試劑的採用被要求保護，所述調節試劑為反義寡核苷酸、核酶、RNAi或者具有長度在15-35個核苷酸之間並具有與連接蛋白43的mRNA反義序列至少70％同源性的siRNA。這些生物學衍生物可僅通過同工型連接蛋白43選擇，且其具有阻止由連接蛋白43形成的半通道和間隙連接的形成的效果。間隙連接的形成的阻斷對器官表達連接蛋白43的正常活動是有害的副作用。此外，所述的化合物顯示了對寡核苷酸的普遍限制作用，例如它們不能口服給藥，而且它們應當以另一種靜脈注射的藥物形式類型進行製劑。

文獻US20090143425描述了衍生自喹啉類影響間隙連接的化合物。但是，這些化合物並不是由連接蛋白形成的半通道的選擇性抑制劑。

申請US20090163440描述了離子通道的調節，特別是由連接蛋白43組成的通道的調節，其中所採用的用於調節它們的藥物選自已知的不同的離子通道調節劑：氨氯地平，苄普地爾，地爾硫卓，達舒平，恩卡尼，非洛地平，加洛帕米，伊拉地平，脈律定，尼卡地平，硝苯地平，尼莫地平，尼群地平，普魯卡因胺，奎尼丁，河豚毒素，戊脈安。在所述文獻中的以上描述的所有選擇中，僅有奎尼丁顯示出針對連接蛋白通道的非特異性和低效價的活活性。

在專利申請US20120135960和US20110172188中，描述了甲氟喹在眾多之中被描述為連接蛋白阻斷試劑。但是，甲氟喹是對由連接蛋白Cx26、Cx32、Cx36、Cx43和Cx50形成的間隙連接通道的非選擇性阻斷劑。此化合物沒有選擇性抑制由所述連接蛋白形成的半通道。

文獻US20080131528、US20060228433和US20080096854描述了恢復間隙連接功能的組合物的採用。這些組合物的目的是為了提高間隙連接的活性。但是，對於此種化合物，沒有已知的對由連接蛋白形成的半通道的抑制效果。

從已經描述的內容衍生出目前由可獲得的連接蛋白形成的半通道的阻斷劑還抑制間隙連接，所述間隙連接在協調許多組織中的電荷代謝反應中起到了重要作用。因此，期望獲得特異性針對半通道的阻斷化合物，其中所述化合物對間隙連接通道沒有影響，這能夠應用於以理性的方式對各種疾病設計治療方法，最小化所不期望的副作用。

對於確定新藥的方法學，在現階段存在多種研究較大特異性的化合物的方法。例如，文獻US2014141099公開了藥物開發方法，特別是Aurora激酶抑制劑和所述促使Aurora B蛋白構像改變的藥效團(其兩步法結合常數為Ki*)，且它還涉及具有所述藥效團的特性的化合物。所述選擇Aurora B抑制劑的方法包括測定Ki、測定Ki*和篩選具有預設Ki/Ki*的化合物的步驟。對於Ki*的測定，預先將所研究的化合物與激酶Aurora孵育；稀釋被測試混合物，並且持續測定Ki*一段時間。

為了尋找對特定受體具有較大親和力的化合物，專利文獻US8131527公開了一種成纖維細胞生長因子(FGF)受體調節劑化合物的鑑定方法，所述FGF受體對FGF具有比對VEGFR2更大親和力，，所述方法包括多個步驟：由給定的化學式表示的藥效團進行設計和/或選擇調節劑；然後根據步驟(a)對所述調節劑進行模擬表示；FGF蛋白或者至少圍繞Asp641的形成結合位點的FGF蛋白的一部分發生原子協調；根據步驟(b)或者一個或多個FGF殘基調整一個或多個候選調節劑以便確定所述候選調節劑能夠與FGF反應的可能性，其中所限定的初始化學式的NHs與Asp641的羧酸的一個或者兩個氧形成氫鍵；可選地，被研究的所述調節劑能夠基於裝配階段的結果被修飾；以及將被研究的所述調節劑與FGF和/或VEGFR2接觸以便確定所述候選調節劑對於受體之一具有優選的接觸親和力的能力。

此外，對於專利申請WO20004012683，其公開了一種鑑定用於疾病的治療化合物，所述疾病由具有SET域的蛋白的有機體引起，其包括分析被研究的化合物調節所述蛋白的至少一個「可藥」區域的活性的能力，其中所述調節能力指示出候選治療化合物。

而且，從此些文獻和現有階段中可獲得的信息，推測得知沒有背景研究揭示出有效和特異性鑑定和選擇能夠選擇性調節由連接蛋白形成的半通道的活性的化合物的方法。

附圖說明

圖1.連接蛋白半通道的基本結構的示意性圖示。

連接蛋白半通道的二級結構由連接蛋白原體的六聚體排布組成。每個原體的域由名稱表示並由不同灰度編碼且由箭頭表示。膜平面由黑線表示。

圖2.半通道的合成抑制劑的生物學評估的分析方案。

其中將Cx43細胞培養物在96孔黑色培養板中傳代培養，並經過3次溴化乙啶吸收分析，以螢光計中發射的螢光作為評估指標。。

圖3.HeLa Cx43-EGFP中的溴化乙啶吸收。DCFS的效果。

A：培養中的細胞。B：HeLa Cx43-EGFP中的溴化乙啶吸收圖表。C：胞外DCSF誘導Cx43中溴化乙啶的進入；示出DCSF的效果，其被抑制分子(MX)(10nM)阻斷(P<0.05，n＝4).

圖4.用無鈣離子(或Ca2+)並含有EGTA的生理鹽水，清洗HeLa細胞中的由連接蛋白43形成的半通道的單元流。

圖5.隨時間變化的耦合發生率。

圖6.由溴化乙啶的轉移評估細胞耦合。

A：HeLa-Cx43細胞(轉染有連接蛋白43)中不同抑制劑的效果。B：細胞耦合指數。

圖7.由機械壓力驅動的由panexine1(Panx1)形成的半通道的功能狀態。

技術實現要素：

當描述本發明的化合物、組合物和步驟時，下列術語具有以下所示的意思，除非另有說明。

術語「C1-3烷基」指包括1-3個碳原子的烴鏈。

術語「C1-3烷氧基」指包括1-3個碳原子結合到氧原子的烴鏈。

術語「治療有效量」指當對需要治療的患者實施治療時，實施的足夠的量。

術語「治療」，如在說明書中所使用的，指人類患者中疾病或病理性醫療狀況的治療，包括：

(a)預防疾病或病理性醫療狀況的發生，即對患者的預防性治療；

(b)緩解疾病或病理性醫療狀況，即引起患者疾病或病理性醫療狀況的衰退；

(c)抑制疾病或病理性醫療狀況，即延遲患者的疾病或病理性醫療狀況的發展；或者

(d)緩解患者的疾病或病理性醫療狀況的症狀。

「與連接蛋白活性相關的疾病或病理性醫療狀況」的表達包括目前知曉的或者未來被發現的與由連接蛋白26和/或43形成的半通道活性增加相關的疾病和/或階段的所有狀態。疾病或狀況的此些狀態包括，但不限於，炎性疾病、血管紊亂、心律失常、慢性損傷、視網膜神經保護、纖維變性、疼痛治療、骨骼肌去神經支配、肌營養不良、脊髓損傷以及以由連接蛋白形成的半通道的活性增加為特徵的遺傳疾病。

術語「藥物可接受的鹽」指從可用於給予患者(諸如哺乳動物)的鹼或酸製備的鹽。所述鹽能夠從無機或有機藥物可接受鹼和從無機或有機藥物可接受酸獲得。

衍生自藥物可接受酸的鹽包括下述酸：乙酸，苯磺酸，苯甲酸，canfosulfonic，檸檬酸，etanosulfonic，富馬酸，葡萄糖酸，穀氨酸，溴酸(bromhidric)，氯化氫(clorhidric)，乳酸，馬來酸，蘋果酸，扁桃酸，metanosulfonic，黏酸，硝酸，泛酸，磷酸，琥珀酸，磺酸，酒石酸，對甲苯磺酸，xinafoic(1-羥基-2-萘甲酸)及其類似物。所述鹽特別優選地為那些衍生自富馬酸，溴酸，氯化氫，乙酸，硫酸，甲磺酸，xinafoic和酒石酸。

衍生自藥物可接受的無機鹽包括鋁，氨，鈣，銅，三價鐵，亞鐵，鋰，鎂，錳，錳，鉀，鈉，鋅和類似鹽。特別優選的為鋁、鈣、鎂、鉀和鈉鹽。

衍生自藥物可接受的有機鹼的鹽包括初級、二級和三級的鹽，包括胺取代的、環胺、天然來源的胺或類似物，諸如精氨酸，甜菜鹼，咖啡因，膽鹼N，N'-二苄基乙二胺，二乙胺，2-二乙基氨基乙醇，2-二乙基乙醇胺(2-diethylamineetanol)，乙醇胺，乙二胺，N-乙基嗎啉，N-乙基哌啶，葡糖胺，組氨酸，異丙胺，賴氨酸，甲基葡糖胺，嗎啉，哌啶，聚胺樹脂，普魯卡因，嘌呤，可可鹼，三乙胺，三甲胺，三丙胺，氨基丁三醇及類似物。

術語「溶劑化物」指由一個或多個溶質分子，即本發明的化合物或其藥學上可接受的鹽之一和溶劑的一個或多個分子形成的複合物或聚集物。所述溶劑化物通常是具有基本固定的摩爾比的溶質和溶劑的結晶固體。代表性的溶劑包括，例如，水、甲醇、乙醇、異丙醇、乙酸和類似物。當所述溶劑為水時，形成的溶劑化物為水合物。

術語「或其藥物上可接受的鹽或其立體異構體的溶劑化物中的一個」包括化學式(A-G)所示化合物的鹽、溶劑化物和立體異構體的所有組合。

術語「可藥區域」是指核酸、多肽、複合物和類似物，並且其涉及形成半通道的連接蛋白的區域，其用於或可能用於結合降低或抑制半通道的活性的試劑。

對於多肽，可藥區通常指多肽的區域，區域上的數個胺基酸能夠與藥劑交互作用。對於多肽或其化合物，可藥區域的實例為口袋、結合位點、多肽的結構域之間的界面、多肽的溝槽或表面複合物或輪廓或多肽表面、或者能夠與其它分子(諸如細胞膜)相互作用的複合物。特別地，連接蛋白中的可藥區域將對應一個口袋，所述口袋受殘基限制，所述殘基對應在連接蛋白中一個原體的殘基3-10(NTH)、29-40(TM1)、74-93(TM2)的片段和另一個相鄰的原體的殘基29-40(TM1)，或者對應其它連接蛋白的等價殘基。本發明涉及鑑定特異性和有效調節由連接蛋白形成的半通道的化合物(阻斷劑)的方法，此方法所鑑定的化合物以及包括所述化合物的藥物組合物。

在本發明的一個實施方式中，提供這些化合物使用方法，以及治療與由連接蛋白形成的半通道活性增加相關的有用藥物的製備方法，所述疾病諸如炎性疾病、血管紊亂、心律失常、慢性損傷、視網膜神經保護，疼痛治療，骨骼肌去神經支配，肌營養不良，脊髓損傷以及以由連接蛋白形成的半通道的活性增加為特徵的遺傳疾病。

治療患者的炎性疾病的應用包括給予患者有效治療量的化合物，所述化合物抑制由連接蛋白形成的半通道的活動，打開或轉運。

在本發明中，基於治療靶標的三維結構採用了一種鑑定藥物的方法以解決獲得有效且特異性調節由連接蛋白形成的半通道的化合物的技術問題。本申請基於應用於連接蛋白的結構的藥物鑑定的策略的目的是獲得用於調節由連接蛋白形成的半通道的具有較高親和力和選擇性的新藥劑，所述藥劑通過特異性降低了對患者的副作用。

通過細胞膜的滲透試驗和顯微數據流的測量檢測所述化合物的生物活性。

根據本發明鑑定由連接蛋白形成的半通道的特異性抑制化合物的方法，首先分析不同人類連接蛋白的治療性靶標的結構，並由此生成其它連接蛋白的比較模型。為了製備用於分子耦接的蛋白，首先完成了由人類連接蛋白26形成的半通道的晶體結構。

比較模型建立在化合物與受N-端螺旋(NTH)結構域限制的口袋結合的假說上，即是化合物對由N-端螺旋(NTH)結構域、原體的螺旋結構TM1和TM2的跨膜片段和相鄰原體的螺旋結構TM1的跨膜片段的結合，阻止了會引起由連接蛋白形成的半通道的開啟/激活的必要構象變化。

採用程序Modeller v9.2(Sali,1995)生成了由人類連接蛋白26或者43形成的總共500個半通道模型，並且根據內部DOPE評分篩選最好模型用於進一步分析和優化。通過採用在網絡伺服器SAVES(http://nihserver.mbi.ucla.edu/SAVES)上可獲得的工具進行結構驗證。

在模擬篩選程序之前，採用FILTER v2.1(OpenEye Scientific Software,Santa Fe,NM)程序，對化學化合物資料庫OpenNCI進行過濾，以便消除鹽和反離子，並且然後通過OMEGA v2.4.6(OpenEye Scientific Software,Santa Fe,NM)程序將其轉變為同等物，由此提供大約195000種化合物和異構體。，在由連接蛋白26形成的半通道的修飾的修飾的晶體結構和由連接蛋白43形成的半通道模型中，採用程序FRED v2.2.5(OpenEye Scientific Software,Santa Fe,NM)對他們執行全面分子耦合協議。採用FRED受體程序鑑定和製備由連接蛋白26形成的半通道的結合位點和由連接蛋白43形成的半通道的模型。

採用由人類連接蛋白26組成的半通道結構和由人類連接蛋白43形成的半通道模型實施模擬篩選過程以便鑑定潛在的由連接蛋白形成的半通道的調節劑，所述由人類連接蛋白43形成的模型是通過採用人類連接蛋白26的結構作為樣式，比較建模發展而來。

採用Chemgauss3打分功能獲得、優化在受體位點(100)的候選配體結合模型。使用PLP、Chemscore和Chemgauss3的評價功能，通過一致性打分獲得用於綜合分子耦合程序和優化的結合模型的一致性結構。最後，採用force field CHARMm22en DiscoveryStudio v2.1(Accelrys Inc.,San Diego)，對分類最好的1000種化合物的結合模型進行最小化。

該協議使用共軛梯度算法，允許從所有耦合的配體的質量中心將內殘基的側鏈最小化，直到能量梯度的均方根(RMS)的收斂標準為0,001kcal/mol。

採用PLP,LigScore,PMF and LUDI評價功能，評價獲得的每個複合物的結合能量。採用Discovery Studio v2.1中可利用的一致性評分協議，對具有抑制潛力的化合物進行最終鑑定，。從這個新的分類，對結果進行目測觀察，發現100個最優結果的化合物，且在對由連接蛋白26或連接蛋白43形成的半通道顯示最優親和力的組中選出40種化合物。

基於在半通道表達有缺陷並轉染了不同連接蛋白的細胞的實驗測試，以便評估和/或確認它們的通過細胞膜運輸的調節能力。評價滲透示蹤分子的運輸，並與已知的由連接蛋白形成的通道的抑制劑(諸如β甘草次酸(BGA)和生胃酮(CBX))相比較。

在沒有二價陽離子的胞外培養基中進行細胞培養，以便增加由連接蛋白形成的半通道的開啟概率。此外，用panexine 1轉染不表達半通道的親本細胞，且機械刺激以誘導由panexine 1形成的半通道的開啟，作為陰性對照。

通過其在由panexine 1形成的半通道上的作用，評估抑制由連接蛋白形成的半通道的分子被。利用對染料的耦合技術和通過雙電壓固定的電生理學，將在納摩爾範圍內抑制由連接蛋白形成的半通道的分子作為細胞內結合通道可能的抑制劑進行研究。

分子應該在毫摩爾範圍內不抑制由連接蛋白形成的細胞間通道，並且不影響由panexine 1形成的半通道，其抑制採用全細胞模型中電壓固定方法的由連接蛋白形成的半通道的電流的作用。本發明提供了新的抑制由連接蛋白26和/或43形成的半通道的化合物。

本發明的目的在於提供一種對由連接蛋白形成的半通道具有抑制潛力的化合物的鑑定方法，其中針對對應於由連接蛋白26或連接蛋白43形成的半通道的晶體結構或者比較模型，採用了配體模擬篩選方法。所述方法特徵在於評價化合物對應於連接蛋白26中的殘基3-10(NTH)、29-40(TM1)、74-93(TM2)和鄰近原體中的殘基29-40(TM1)的片段或者其它連接蛋白中的等同殘基的片段的殘基，在結合位點處的相互作用能。

本發明的方法可以檢測被鑑定為能抑制由缺乏二價陽離子的胞外培養基或向細胞膜施加正電壓所誘導的由連接蛋白形成的半通道的開啟/激活的化合物，由此避免半通道的開啟的機制的依賴。本發明的另一個目的是為了提供一種藥物組合物，其包有效治療量的根據本發明鑑定的的由連接蛋白形成的半通道的一個或多個特異性抑制劑的化合物，所述化合物會進入待治療細胞的作用位點。所述藥物組合物包括至少本發明的一種化合物，優選包括至少一種藥學上可接受的載體。本發明的另一個目的是由連接蛋白形成的半通道的一種或多種調節劑在製備用於治療或者預防與由連接蛋白26或連接蛋白43形成的半通道的過度激活相關的疾病的藥物中的應用，其中所述由連接蛋白形成的半通道的調節劑會到達所述細胞中的所述作用位點。

本發明下所獲得的化合物能夠被用於製備用於預防和/或治療炎性疾病、血管紊亂、心律失常、慢性損傷、視網膜神經保護，疼痛治療，骨骼肌去神經支配，肌營養不良，脊髓損傷和以由連接蛋白形成的半通道的活性增加為特徵的遺傳疾病，其中所述組合物包括治療有效量的一種或多種試劑，所述試劑在待處理細胞中抑制由連接蛋白形成的半通道的開啟/激活。

通過根據本發明的方法鑑定的化合物僅阻斷半通道，而不阻斷由連接蛋白形成的細胞內通道或者由panexine 1形成的半通道。抑制由連接蛋白形成的半通道的所述新化合物直接結合至半通道，並相較於現有文獻中描述的化合物具有更好的親和性和強度。

簡言之，獲得根據本發明的特異性抑制連接蛋白半通道的化合物的方法包括下述步驟：

·生成並驗證討論中的由連接蛋白形成的半通道的比較模型；

·分析結構並定義連接蛋白的相互作用位點作為參考；

·以三維形式產生化學化合物的資料庫，包括每個化合物的部分載荷和最佳幾何形狀，消除鹽和反離子；

·進行模擬篩選以便鑑定由連接蛋白形成的半通道的抑制劑；

·基於能量功能篩選由連接蛋白形成的半通道的阻斷化合物，所述能量功能可以評估各化合物對連接蛋白的相對親和力作為參考；評估所述化合物對半通道表達缺陷並被不同連接蛋白轉染的細胞通過細胞膜運輸的調節能力作為參考；確定所鑑定的化合物會抑制受胞外二價陽離子缺乏誘導的或者通過向細胞膜施加正電壓誘導的由連接蛋白形成的半通道的開啟/激活；以及

·根據它們對半通道的作用，對抑制由連接蛋白形成的半通道的分子進行分類。

藥物組合物

藥物製劑可以以單位劑量的形式方便地提供，而且它們可以通過藥物領域公知的任何方法進行製備。所有方法包括將有效成分或成分與載體接觸。一般地，所述製劑被製備為將有效成分與以統一方式完好分開的液體載體或固體載體接觸，且然後，如果需要，根據需要的配方形成產品。

本發明的用於口服給藥的適當製劑可以表示為膠囊或者片劑(其中它們中的每一個包含預定量的活性成分)；粉末或者顆粒；溶液或水液體的懸浮液或者非水液體的懸浮液；或者水包油液體乳液或油包水液體乳液。所述活性成分同樣可以注射劑，混有蜂蜜的藥用粉末、糖漿或者厚藥膏的形式提供。

糖漿製劑一般將存在於以液體為載體的化合物或其鹽的懸浮液或溶液中。典型的皮膚和經皮給藥的製劑包括常規水性或非水性載體，例如乳霜、軟膏、洗液或者厚軟膏，或者它們是藥膏、貼劑或膜的形式。

實施例

實施例1：

阻斷由連接蛋白(26或43)形成的半通道的開啟/激活的體外測試.

利用連接蛋白26或42轉染的HeLa細胞進行體外測試，測試不同示蹤分子的能力，以評估化合物降低這些分子運輸作用的能力。

表1：對5μM濃度的滲透示蹤物的抑制率

體外最有效抑制劑為例4，其具有20nM的IC50和100％有效性，緊接著為例5，其具有50nM的IC50和100％有效性.

作為參照，採用生胃酮或甘草次酸(CBX，ABG)作為對照，其是廣泛應用的連接蛋白阻斷劑，顯示出100nM的IC50和100％有效性。

因此，本發明的抑制劑在體外顯示出適當的連接蛋白26和43的半通道的開啟/激活的阻斷活性。

實施例2：由連接蛋白26或連接蛋白43形成的半通道的活性的阻斷化合物的應用。

所述方法包括把由連接蛋白26或43形成的半通道選擇性或特異性地與至少兩種以下化合物的治療有效量(在納摩爾範圍中)接觸：

A：(R)-2-(4-氯苯芬基)-2-氧代-1-糠基乙基喹啉-2-羧酸乙酯，

B：(4-(4-氯苯基)哌嗪-1-基)丙烷，

C：乙酸2,2-雙([1,1'-聯苯]-4-基)酸，

D：(2R，5S，8R，9S，10S，13S，14S，17S)-2-氟-10,13-二甲基-3-氧代十六氫-1H-環戊二烯並[a]芴(fenantren)-17-苯甲酸乙酯，

E：(3S，5S，8R，9S，10S，13S，14S，17S)-3-乙醯氧基-10,13-二甲基十六氫-1H-環戊二烯並[a]芴(fenantren)-17-環己烷羧酸酯，F：(3S，8R，9S，10R，13S，14S，17R)-17-乙炔基-17-羥基-10,13-二甲基-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13，14,15,16,17-十四氫-1H-環庚三烯並[a]芴(fenantren)-3-基3-環己基丙酸酯(ciclohexilpropanoate)

G：雙(4-甲基-2-嗎啉喹啉-6-基)甲烷

A和D的結果最優，因為它們成為由連接蛋白形成的半通道的強有力抑制劑，而且它們不影響間隙連接通道或者由panexin形成的半通道。

實施例3：生物評價

採用用連接蛋白26或43轉染的小鼠HeLa細胞。為了評價針對連接蛋白半通道的每個化合物的活性，在每個實驗前24h，將103個用連接蛋白轉染的HeLa細胞接種在多孔(90)板的孔中。然後，用含有正常水平的二價陽離子(Ca2+and Mg2+)的洛克(locke)溶液或者不含二價陽離子的洛克(locke)溶液中清洗細胞，所述locke溶液還含有5μm溴化乙錠。同時，採用不同濃度的每種候選化合物處理細胞並孵育5分鐘。

如圖表2所示，將用連接蛋白43(Cx43)轉染的HeLa細胞接種在多孔(96)板中，並在24h後，在存在或者不存在討論的化合物的情況下，評價無陽離子溶液(DCFS)中的乙啶攝取。通過螢光計測量激發的螢光來評價乙啶攝取。如果抑制劑存在的情況下，螢光值等於或者接近用含有二價陽離子溶液孵育的細胞中所測量的螢光值，則所述化合物對應於由連接蛋白形成的半通道的抑制劑。相反，如果由暴露於DCFS中的可能的抑制劑的細胞發出的螢光值，等於僅由DCFS(沒有討論中的化合物)孵育的細胞的螢光值，則所述化合物不是由連接蛋白形成的半通道的抑制劑。採用不同濃度的每種化合物進行相同的試驗以便確定最小的有效濃度(EC50)。

在至少40個細胞中浸泡在對照培養基中，接著是DCFS，施用10nM抑制分子(R)-2-(4-氯苯腈)-2-氧代-1-糠基噻吩並喹啉-2-羧酸酯(化合物4或抑制分子)，用DCFS洗滌，然後新應用10nM抑制分子(MX)。

在圖3中，左上面板(A)對應於顯微圖像，其中可以注意到HeLa細胞所表達的結合有綠色螢光蛋白(EGFP)的連接蛋白43出現在顯微視野中。在右側，所示螢光顯示視野中所有細胞均表達連接蛋白43。底部左側面板顯示基線條件(胞外培養基中存在Ca2+)處的乙啶攝取，且底部右側面板示出了用一種沒有二價陽離子的溶液(DCFS)替換胞外溶液，5分鐘以後的乙啶攝取，所述DCFS能增加半通道的活性。圖表(B)用任意單位(AU)的「上染率」表示半通道的活性，、在至少40個孵育在DCFS的對照培養基的細胞中，應用10nM抑制分子(R)-2-(4-氯苯芬基(4-chlorofenil))-2-氧代-1-糠基乙基喹啉(fenilethlyquinoline)-2-羧酸乙酯(化合物4或抑制分子)，用DCFS清洗，接著應用10nM新的抑制分子(MX)。很明顯，採用上染率評價所述抑制分子的抑制半通道的活性。面板(C)示出乙啶每分鐘的攝取速度或速率被抑制分子完全抑制，且其效果被DCFS清洗部分逆轉。

在用不含鈣離子(或Ca2+)的鹼性溶液孵育HeLa細胞中，由連接蛋白43形成的半通道的單位電流非常頻繁(參見圖4，兩個上部示蹤圖)。但是，10nM化合物4(抑制分子)的應用強烈地抑制了由連接分子43形成的半通道的活性(兩個底部示蹤圖1和3)。

圖5描繪了用連接蛋白26轉染的細胞很好的耦合於間隙連接通道。採用螢光黃微注射評價的細胞的耦接發生率接近100％(黑色框)。其還顯示了添加1nM化合物4沒有顯著降低耦合率(白色框)，表明由連接蛋白26形成的間隙連接通道的功能狀態沒有被影響。

圖6表明應用1nM化合物4(抑制分子)沒有抑制間隙連接通道介導的細胞耦合，而其它被評價的化合物完全或者部分抑制由連接蛋白43形成的間隙連接通道。

被機械應力激活的由panexine 1(Panx1，圖7)形成的半通道的功能狀態沒有被100nM化合物4的應用所抑制，但是其被5μm生胃酮完全阻斷。結果表明納摩爾範圍濃度的化合物4抑制由連接蛋白形成的半通道，且不抑制由panexine 1形成的那些半通道，且還表明所述化合物沒有抑制由連接蛋白形成的間隙連接通道。因此，所述化合物是由高度特異性連接蛋白形成的半通道的抑制劑。

參考文獻

Bodendiek,S.B.and G.Raman(2010)."Connexin modulators and their potential targets under the magnifying glass."Curr Med Chem 17(34):4191-4230.

Chandrasekhar,A.and A.K.Bera(2012)."Hemichannels:permeants and their effect on development,physiology and death."Cell Biochemistry and Function 30(2):89-100.

Juszczak,G.R.and A.H.Swiergiel(2009)."Properties of gap junction blockers and their behavioural,cognitive and electrophysiological effects:animal and human studies."Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry 33(2):181-198.

Saez,J.C.,V.M.Berthoud,M.C.Branes,A.D.Martinez and E.C.Beyer(2003)."Plasma membrane channels formed by connexins:their regulation and functions."Physiol Rev 83(4):1359-1400.

Saez,J.C.,K.A.Schalper,M.A.Retamal,J.A.Orellana,K.F.Shoji and M.V.Bennett(2010)."Cell membrane permeabilization via connexin hemichannels in living and dying cells."Exp Cell Res 316(15):2377-2389.

Spray,D.C.,R.Rozental and M.Srinivas(2002)."Prospects for rational development of pharmacological gap junction channel blockers."Curr DrugTargets 3(6):455-464.

Verselis,V.K.and M.Srinivas(2013)."Connexin channel modulators and their mechanisms of action."Neuropharmacology 75(0):517-524.

Wang,N.,M.De Bock,E.Decrock,M.Bol,A.Gadicherla,M.Vinken,V.Rogiers,F.F.Bukauskas,G.Bultynck and L.Leybaert(2012)."Paracrine signaling through plasma membrane hemichannels."Biochim Biophys Acta.