細胞培養方法

2023-09-24 12:22:35 2

專利名稱：細胞培養方法
技術領域：
本發明涉及培養哺乳動物細胞、特別是可分泌異源和/或重組體蛋白的哺乳動 物細胞、更具體地講是可分泌血液蛋白質比如凝血因子VDI (在下文中稱為「因子通」、或僅 稱為「FVIII」)、ADAMTS-13、弗林蛋白酶或凝血因子ΥΠ (在下文稱為「因子ΥΠ」、或僅稱為 「FVII」)的哺乳動物細胞的方法。
背景技術：
凝血因子VDI是在哺乳動物中發現的微量血漿糖蛋白，並且在因子X的活化中作為 IXa的輔因子被包含。因子VDI的遺傳性缺乏導致出血病症A型血友病，該疾病能夠用純化的 因子VDI成功地治療。該因子VDI能夠由血漿中萃取出來，或者能夠通過基於重組DNA的技術 而製備。在血漿中，其作為與von Willebrand因子(vWF)的複合物而循環。重組因子VDI (rFVIII)能夠被用載有編碼因子VDI分子的DNA序列的載體轉染的中 國倉鼠卵巢(CHO)細胞生產。某些情況下，重組因子VDI與重組von Willebrand因子(rwf) 一起被共同產生，後者可穩定因子通。這種共同生產可能涉及到表達FVIII和VWF的各個 細胞系的共培養、或者兩種蛋白質在相同細胞中的共表達。參見US 5250421 (遺傳學研究 所)和 Kaufman 等((1989)Mol. Cell. Biol. 9，1233-1242)。在用於製備重組體因子VDI的典型方法中，細胞在培養基中培養並且將因子VDI分泌 入培養基中。然後因子FVIII可以，任選地作為與vWF的複合物，被從培養基中純化出來。由於在本技術領域已知的方法中得到相對低的產率，所以重組因子VDI的生產是昂 貴的。單位細胞產量與可以得到的其他重組體蛋白的產量相比趨於較低。如果培養基不補 充動物產品比如血清，培養基可能僅支持相對低的細胞密度。這會降低單位體積培養基的 產量。然而，人們期望不用動物產品來補充培養基，以便降低病毒及其他可傳染性試劑的汙 染風險。用於生產FVIII的無動物蛋白培養基已知例如被US 6936441 (巴克斯特公司)報 道了。本發明提供了用於生產血液蛋白質包括rFVIII的方法，其中產率與本技術領域 已知的方法相比得到了提高。

發明內容
本發明的第一個方面提供了一種在細胞培養上清液中培養分泌異源蛋白質的哺 乳動物細胞的方法，其中該細胞培養上清液保持在設定在X士0.9°C的溫度下，其中X為 35. 1至36. 5的值，附帶條件是溫度被設定為低於37°C。本發明的第二個方面提供了一種在細胞培養上清液中培養分泌異源蛋白質的哺 乳動物細胞的方法，其中，該細胞培養上清液被保持在設定為X士0. 05的pH，其中X為7. 15
4至7. 20的值，附帶條件是pH被設定為大於7. 10。本發明的第三個方面提供了一種在細胞培養上清液中培養分泌異源蛋白質的哺 乳動物細胞的方法，其中該細胞培養上清液的CO2濃度為1-10%。本發明的第四個方面提供了一種在包含細胞培養上清液的容器中連續培養分泌 FVIII的哺乳動物細胞的方法，其中，在細胞培養上清液中的細胞密度通過在線(in-line) 傳感器測量，並且新鮮培養基進入容器的流入量被自動地控制，從而保持細胞的密度在期 望的範圍內。
具體實施例方式在本發明第一個方面的過程中，其中哺乳動物細胞被培養的細胞培養上清液被保 持在設定為X士0. 9°C的溫度下，其中X為35. 1至36. 5的值，附帶條件是溫度被設定為低於 37 °C。在優選的實施方式中，溫度被設定為36 士 0. 9 °C、優選36 士 0. 5 °C、更優選36 士 0. 2 °C， 並且最優選36 °C ；或者35. 1 士 0.9°C、優選35. 1 士 0. 5°C、更優選35. 1 士 0. 2°C，並且最優選 35. I0C ；或者 36. 5士0. 90C >36. 5士0. 5°C、更優選 36. 5士0. 2°C，並且最優選 36. 5°C。術語「細胞培養上清液」是在其中培養哺乳動物細胞的培養基。該培養基不允許 被與可能被加至培養物中的補料培養基相混，雖然補料培養基也優選在為細胞培養上清液 所設置的溫度處被加至培養物中。術語「培養物」，我們是指細胞培養上清液和在其中培養 的哺乳動物細胞。通常，在37°C下培養哺乳動物細胞。令人驚訝的是，申請人發現，在較低 溫度比如36°C下培養哺乳動物細胞可提高重組體蛋白的產率。術語「培養」或「保持」的溫度，我們指的是過程控制系統所設置的溫度，換句話說， 是預期的、目標溫度。顯然，隨時間過去、以及在培養容器中從一個位置到另一個位置，培養 物的溫度將有小的變化。在此我們述及的「培養」或「保持」的設定為X士Y°c的溫度，我們 指的是設置值為從X+Y 1至乂4 °C。如此，例如，其中X是36.0士0.9°C，設定值被設定為 從35. 1到36. 9的值。對於X的每一個優選值，設定值是在X士0.9°C、士0.8°C、士0. 7°C、 士0.6°C、士0. 5°C、士0.4°C、士0. 3°C、士0. 2°C、或者 士0. 1°C的範圍內。優選較窄的範圍。 X的一個設定值是最優選的。對於任何給定的設定值，可以發生輕微的溫度變化。典型地，可以發生這種變化， 因為加熱和冷卻裝置僅在溫度已經稍微偏離設定值之後才被啟動。在該情形中，視情況而 定，設定值是x(士Y)，並且當溫度變化士z°c時啟動加熱或冷卻裝置。典型地，溫度在加熱 或冷卻裝置被啟動之前偏離設定值的可允許的偏差度可以被過程控制系統編程。溫度可以 被受恆溫器控制的加熱和冷卻裝置控制到最接近士0. 5°C、士0. 4°C、士0. 3°C、士0. 2°C或甚 至士0. 1°C。較大的溫度差別也可以被編程，比如士0.9°C、士0.8°C、士0. 7°C或士0.6°C。 溫度也可以受培養容器在特定溫度的加熱池中的浸沒情況所控制。可信地，因為不斷地採 用加熱，沒有偏離設定值。由於細胞培養上清液的溫度測量誤差，所以產生了另一個變化起 源。在細胞培養設備中使用的典型溫度計可以具有士0. 3°C或士0. 2°C、甚至士0. 1°C的變 化。若設定值被設定為在X士Y°C範圍內的值，並且溫度的容許偏差是士Z°C (即， 視情況而定，當溫度偏離士Z°c時，加熱器或冷卻器被啟動)，則這還可以表示為(X-Y至 X+Y) 士Z°C的設定值。對於每個可能的X值，如上所述，可想到士Y°C與士z°c的所有組合，附帶條件是溫度被設定為低於37°C。在一個優選的實施方式中，溫度被設定為36士Y°C。優選溫度被設定為 (35. 4-36. 6) 士0. 3 "C、士0. 2 °C、士0. 1 °C 或士0 ；或者(35. 5-36. 5) 士0. 4 "C、士0. 3 "C、 士0. 2°C、士0. 1°C或 士0 ；或者(35. 6-36. 4) 士0. 5°C、士0. 4°C、士0. 3°C、士0. 2°C、士0. 1°C 或 士0 ；或者(35. 7-36. 3) 士0. 6°C、士0. 5°C、士0. 4°C、士0. 3°C、士0. 2°C、士0. 1°C或 士0 ；或 者(35. 8-36. 2) 士0. 7°C、士0. 6°C、士0. 5°C、士0. 4°C、士0. 3°C、士0. 2°C、士0. 1°C或 士0 ；或 者(35. 9-36. 1) 士0. 8°C、士0. 7°C 士0. 6°C、士0. 5°C、士0. 4°C、士0. 3°C、士0. 2°C、士0. 1°C 或 士0 ；或者 36士0. 9°C、士0. 8°C、士0. 7°C、士0. 6°C、士0. 5°C、士0. 4°C、士0. 3°C、士0. 2°C、 士0. 1°C或 士0°C。在另一個優選的實施方式中，溫度被設定為35. 1 士Y°C。優選溫度被設定為 (34. 5-35. 7) 士 0. 3 °C、士 0. 2 °C、士0. 1 °C 或士0 ；或者(34. 6-35. 6) 士 0. 4 °C、士 0. 3 °C、 士0. 2°C、士0. 1°C或 士0 ；或者(34. 7-35. 5) 士0. 5°C、士0. 4°C、士0. 3°C、士0. 2°C、士0. 1°C 或 士0 ；或者(34. 8-35. 4) 士0. 6°C、士0. 5°C、士0. 4°C、士0. 3°C、士0. 2°C、士0. 1°C或 士0 ；或 者(34. 9-35. 3) 士0. 7°C、士0. 6°C、士0. 5°C、士0. 4°C、士0. 3°C、士0. 2°C、士0. 1°C或 士0 ；或 者(35. 0-35. 2) 士0. 8°C、士0. 7°C、士0. 6°C、士0. 5°C、士0. 4°C、士0. 3°C、士0. 2°C、士0. 1°C 或士0 ；或者 35. 1 士0.9 "C、士0.8 "C、士0.7 "C、士0.6 "C、士0.5 "C、士0.4 "C、士0.3 "C、 士0. 2°C、士0. 1°C或 士0°C .在另一個優選的實施方式中，溫度被設定為36. 5士Y °C。優選溫度被設定為 (36. 1-36. 9) 士0 ；或者(36. 2-36. 8) 士0. 1°C 或士0 ；或者(36. 3-36. 7) 士0. 2°C、士0. 1 V 或 士0 ；或者(36. 4-36. 6) 士0. 3°C、士0. 2°C、士0. 1°C或 士0 ；或者 36. 5士0. 4°C、士0. 3°C、 士0. 2°C、士0. 1°C或 士0。在本發明第二個方面的過程中，細胞培養上清液被保持在設定為X士0. 05的pH 下，其中，X為從7. 15到7. 20的值，附帶條件是PH被設定為大於7. 10。在優選的實施方式 中，PH被設定為7. 20 士0. 05、優選7. 20 士0. 03、更優選7. 20 士0. 01、並且最優選7. 20 ；或者 7. 15士0. 05、優選7. 15士0. 03、更優選7. 15士0. 01、並且最優選7. 15。在生產重組體蛋白的 普通方法中，細胞培養上清液被保持在PH 7.1。令人吃驚的是，申請人發現，在更高的pH、 比如pH 7. 2處培養哺乳動物細胞，可提高重組體蛋白的產率。術語「培養」或「保持」的pH，我們指的是過程控制系統所設置的pH，換句話說，是 預期的、目標PH。在此述及的「在其下培養」或「在其下保持」的設定為X士Y的pH，我們是 指設定值為從X+Y到X-Y。對於每一個優選的X值，設定值是在χ士0.05、士0.04、士0.03、 士0.02或士0.01範圍內的值。優選範圍較窄。X的一個設定值是最優選的。對於任何給定的設定值，可以發生輕微的pH變化。典型地，可以發生這種變化，因 為控制PH的手段，例如通過添加酸或鹼、或者改變鼓泡速度，是僅在pH已經稍微偏離設定 值之後才被啟動。典型地，控制PH至最接近士0.05、士0.04、士0.03、士0.02或士0. 01的 PH單位。若pH設定值被設定為在X士 Y範圍內的值，並且容許偏差是士Z，則該設定值還可 以被表示為(X-Y至X+Y) 士Z的設定值。對於每個可能的X數值，如上所述，所有士Y和士Z 的組合，附帶條件是pH被設定為大於7. 10。在一個優選的實施方式中，pH被設定為7. 20士Y。優選pH被設定為
6(7. 15-7. 25) 士0 ；或者(7. 16-7. 24) 士0. 1 或士0 ；或者(7. 17-7. 23) 士0. 2、士0. 1 或士0 ；或 者(7. 18-7. 22) 士 0. 3、士 0. 2、士 0. 1 或 士 0 ；或者(7. 19-7. 21) 士 0. 4、士 0. 3、士 0. 2、士 0. 1 或 士 0 ；或者 7. 20 士 0. 5、士 0. 4、士 0. 3、士 0. 2、士 0. 1 或 士 0.在另一個優選的實施方式中，pH被設定為7.15 士 Y。優選pH被設定為 (7. 11-7. 19) 士0 ；或者(7. 12-7. 18) 士0. 1 或 士0 ；或者(7. 13-7. 17) 士0. 2、士0. 1 或士0 ；或 者(7. 14-7. 16) 士 0. 3、士 0. 2、士 0. 1 或 士 0 ；或者 7. 15 士 0. 4、士 0. 3、士 0. 2、士 0. 1 或 士 0.在本發明第三個方面的過程中，細胞培養上清液的CO2濃度為1至10%，例如 4. 0-9. 0 %、5. 5-8. 5 % 或約 6-8 %。通常，由於細胞產生的CO2不被從細胞培養上清液中除去，所以CO2濃度高於此濃 度。令人驚訝的是，申請人已發現，CO2濃度保持在10%以下會提高重組體蛋白的產率。如 果補料培養基被脫氣(例如，通過空氣鼓泡穿過該培養基)、以及在生物反應器中的細胞培 養上清液被鼓泡，會有助於dC02保持較低。優選本發明頭三個方面中每一個的方法被操作得相對於本發明其他方面中一個 或多個的方法而包括特定的限定特徵。換句話說，其中，溫度被保持在X士0. 9°C，其中X為 35. 1至36. 5°C的值；優選也還保持pH在X士0. 05，其中X為7. 15到7. 20的值；並且CO2濃 度在10%以下。若PH被保持在X士0. 05，其中X為7. 15至7. 20的值；則有利的是還保持 溫度在X士0. 9°C，其中X為35. 1至36. 5°C的值；並且/或者CO2濃度在10%以下。若CO2 濃度被保持在10%以下；則有利的是還保持pH在X士0. 05，其中X為7. 15至7. 20的值；並 且/或者溫度在X士0.9°C，其中X為35. 1至36. 5°C的值。監控這三個限定參數(溫度、PH和CO2濃度)的方式是本技術領域眾所周知 的，並且一般依賴於被插入生物反應器中、或者被包括在穿過培養基循環的迴路中、或者 被插入培養基的抽取樣本中的探針。合適的在線(10)2傳感器及其應用在文獻Pattison et al (2000) Biotechnol. Prog. 16 :769_774 中被描述。合適的在線 pH 傳感器是 Mettler Toledo InPro3100/125/Ptl00(Mettler-Toledo Ingold公司，Bedford，麻州)。用於測量除 pH和p02之外的dC02的合適脫機系統是BioProfile pHOx (Nova生物醫學公司，Waltham, 麻州)。在該系統中，通過電位電極測量在3-200毫米汞柱範圍內的dC02，不精確性分辯率 是5%。可以在37°C的溫度下在該系統中測量pH，37°C的溫度接近在生物反應器中的細胞 培養上清液溫度。改變限定參數以便保持其在預定水平的方式也是眾所周知的。例如，保 持溫度恆定通常涉及到加熱或冷卻生物反應器或補料培養基(如果其是補料分批法或者 連續法)；保持PH恆定通常涉及到選擇和提供足夠的合適緩衝液(典型地是碳酸氫鹽)並 且根據需要向補料培養基中添加酸比如鹽酸、或者鹼比如氫氧化鈉、碳酸氫鈉或其混合物； 保持CO2濃度常數通常涉及到調節鼓泡速度(參見下文)、或者調節液面上空間CO2的流動。 在線PH探針的校準可以隨時間、比如在數天或數周培養細胞的整個期間變化是有可能的。 在該情形中，可以有利於通過使用由最近校準的脫機探針獲得的測量值來重新設置在線探 針。合適的脫機探針是BioProfile pHOx (Nova生物醫學公司，Waltham，麻州)。本發明人已發現，就活性蛋白質的生產而言，提高pH(例如通過添加NaOH)不足以 取得最大益處。取而代之的是，優選降低CO2濃度。一般來講，人們願意保持該工藝的其他 參數恆定。然而，本發明人發現，優選降低CO2濃度，但優選允許無需添加NaOH就使PH例 如從7. 1升高至7. 15或7. 2。
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哺乳動物細胞培養需要氧氣用於細胞生長。一般來講，這可通過將氧氣經過進樣 口壓入培養物而提供。還必需除去由於細胞呼吸而積累的co2。這通過鼓泡而實現，即，使 氣體穿過生物反應器以便攜帶並吹洗co2。通常，這還可以通過使用氧而進行。然而，本發 明人發現，優選使用空氣代替。研究發現，通常情況下，在鼓泡CO2時普通的惰性氣體比如 氮與使用空氣相比效果較小。假定空氣含約20%的氧氣，人們或許認為將使用5倍的空氣。 然而，已發現在大規模培養中這是不夠的，特別是在2500L規模下培養時。在2500L生物反 應器中，使用7至10倍多的空氣、優選約9倍多的空氣。例如，在標準大氣條件下，2500L生 物反應器用氣泡大小為10 μ m的O2以0. 02 VVH(每小時每體積培養物的O2體積)速率進 行鼓泡。根據本發明的方法，使用相同的2500L生物反應器，將會用空氣以IOym的氣泡大 小以0. 18VVH的速率進行鼓泡。因此，已經發現使用驚人高的容量的空氣來提供足夠的供氧並且除去不希望有的 CO2。在生產期期間，優選通過空氣鼓泡來除去CO2，如上所述。在使用大容量生物反應 器的情形中尤其如此，否則其中細胞培養上清液將會累積CO2至有害的高水平。然而，在培 養開始、或小規模培養時，比如為1升或2. 5L規模，液面上空間(head space)可以被0)2覆 蓋。在這樣的條件下，仍然可以取得低水平的dC02。如果pH太過鹼性，用CO2覆蓋該液面 上空間也可以被採用，來將PH降低至設定值。細胞可以是任何能夠優選在生產工藝(S卩，至少1升)中被培養以便生產期望蛋 白質比如FVIII的哺乳動物細胞。其例子包括被SV40(C0S-7，ATCC CRL 1651)轉化的猴 腎CVl細胞系；人胚腎細胞系(293或用於在懸浮培養中生長的293細胞亞克隆，Grahamet al，J.Gen Virol.，36 :59 [1977])；幼倉鼠腎細胞(BHK，ATCC CCL 10);中國倉鼠卵巢細 胞 /-DHFR，比如 DUKX-Bll 亞克隆(CHO，Uriaubhe 和 Chasin，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77 4216[1980])；小鼠塞爾託利細胞(TM4, Mather. Biol. Reprod. ,23 :243_251 [1980])； 猴腎細胞(CVl ATCC CCL 70)；非洲綠猴腎細胞(Vero-76, ATCC CRL-1587)；人宮頸癌 細胞(HeLa, ATCC CCL 2)；犬腎細胞(MDCK，ATCC CCL 34)；布法羅大鼠肝細胞(BRL 3A， ATCC CRL 1442)；人肺細胞(W138, ATCC CCL 75)；人肝細胞(HEPESG2, HB 8065)；小鼠乳 腺瘤(MMT 060562，ATCC CCL51) ；TRI 細胞(Mather et al.，AnnalsN. Y. Acad. Sci.，383 44-68 [1982]) ；MRC 5細胞；FS4細胞；以及人肝癌細胞系(HEPESG2)。優選細胞系是齧齒動 物細胞系，尤其是倉鼠細胞系比如CHO或BHK。製備可表達重組體蛋白的穩定的CHO細胞克隆的一種優選方法如下所述。基本上 按照US 5，250，421 (Kaufman等，遺傳學研究所公司)中描述的方法，用DHFR表達載體轉 染DHFR缺乏型CHO細胞系DUKX-BII，以便允許表達相應的重組體蛋白。用氨甲蝶呤對轉 染進行選擇。通過在提高氨甲蝶呤濃度中增殖細胞，實現了用於表達重組體蛋白的相應編 碼區域和DHFR基因的擴增。如果合適的話，基本上按照US 6，100，061 (Reiter等，Immuno Aktiengesellschaft)中描述的方法，可以採用CHO細胞系用於在血清和/或無蛋白的培養 基中培養。選擇的用於培養寄主細胞系的基礎培養基對於本發明而言不是關鍵的，並且可以 是在本技術領域已知的適合於培養哺乳動物細胞的那些培養基中的任何一種或組合的。培 養基比如Dulbecco改進Eagle培養基、Ham' s F-12培養基、Eagle最低必需培養基和RPMI-1640培養基等可在市場上買到。生長因子比如重組胰島素的添加是任選的。歷史上，一直在含有動物血清的培養基中培養動物細胞。然而，這樣的培養基是 不完全限定的並且帶有感染的風險。本領域的技術人員因此已設計出「無蛋白質的」培養 基，其或者完全不含任何蛋白質，或者至少不含任何不是通過重組方式生產的蛋白質。由於 因子VDI的不穩定本性，在無蛋白質的條件下，基因工程寄主細胞的生產率被嚴重降低。人 血清白蛋白通常被用作無血清培養基補充物，用於重組蛋白的生產。該白蛋白本身可穩定 FVIII，並且存在於血清衍生的白蛋白製品中的雜質還可以對白蛋白的穩定化作用做出貢 獻。因子比如脂蛋白已經被鑑定作為用於在無血清條件下生產重組因子VDI的人血清白蛋白 的代替者。優選的培養基包括在US 6171825 (拜耳公司)和US 6936441 (巴克斯特公司)中 公開的那些培養基。US 6171825中的培養基由改進的Dulbecco最低必需培養基和Ham' s F-12培養 基組成(50 50，以重量計地)，補充有重組胰島素、鐵、多元醇、銅和任選的其他痕量金屬。胰島素應該是重組體，並且可以由禮萊公司作為「Nucellin」胰島素得到)。它能 夠被以0. 1至20 μ g/ml (優選5-15 μ g/ml、或者約10 μ g/ml)的濃度加入。鐵優選呈Fe2+ 離子形式，例如作為FeSO4 EDTA提供，並且能夠以5-100 μ m(優選約50 μ m)的濃度存在。 合適的多元醇包括聚(氧化乙烯)和聚(氧化丙烯)的非離子型嵌段共聚物，其分子量的 範圍是約1000至約16，000。尤其優選的多元醇是Pluronic F_68 (BASF溫多特公司)，其 平均分子量是8400，並且由中心嵌段聚(氧化丙烯)(20wt% )和在兩個末端的嵌段聚(聚 (氧化乙烯)組成。也可使用購自Unichema Chemie BV的Synperonic F-68。其他的多元 醇包括 Pluronic F_61、F_71 和 F-108。可以以相當於 50_800nM CuSO4、優選 100_400nM、通 常約250nM的含量添加銅(Cu2+)。包含一組痕量金屬比如錳、鉬、矽、鋰和鉻能夠導致進一 步提高因子VDI產量。BHK細胞在這些無蛋白質的基礎培養基中生長良好。US 6936441的培養基也是基於DMEM和Ham' s F12為50/50的混合物，但是包括 在0. 1和100g/L之間、優選在1和5g/L之間的大豆蛋白腖或酵母提取物。作為尤其優選 的實施方式，可以使用大豆萃取物例如大豆蛋白腖。大豆蛋白腖的分子量可以小於50kD、優 選小於10kD。添加平均分子量是350道爾頓的超濾的大豆蛋白腖已經證明特別有利於重組 細胞系的生產。大豆分離蛋白的總氮含量為約9.5%，並且游離胺基酸含量為約13%或約 7-10%。尤其優選的培養基具有下述組合物合成基本培養基(例如50/50 DMEM/Ham' s F12) 1 至 25g/L ；大豆蛋白腖 0.5 M 50g/L ；L-穀氨醯胺 0. 05 至 lg/L ；NaHCO3O. 1 至 10g/L ； 抗壞血酸0. 0005至0. 05g/L ；乙醇胺0. 0005至0. 05 ；以及亞硒酸鈉1至15 μ g/L。任選 地，可以向培養基中添加非離子表面活性劑比如聚丙二醇(例如Pluronic F-6UPluronic F-68、Pluronic F-71或Pluronic F-108)作為消泡劑。該試劑一般被用於保護細胞不受 通氣(「鼓泡」)的負面影響，因為在沒有添加表面活性劑的情況下上升並破裂的氣泡可以 損害那些在氣泡表面處的細胞。非離子表面活性劑的含量範圍可以在0. 05和10g/L中間、優選在0. 1和5g/L之 間。另外，培養基還可以含有環糊精或其衍生物。優選無血清和蛋白質的培養基含有蛋白 酶抑制劑比如絲氨酸蛋白酶抑制劑，其適合於組織培養並且是源於合成或源於植物。
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在另一個優選的實施方式中，可額外地向上述培養基中添加下述胺基酸混合物 L-天冬醯胺(0. 001至lg/L ；優選0. 01至0. 05g/L ；特別優選0. 015至0. 03g/L)、L_半胱氨 酸(0. 001 至 lg/L ；優選 0. 005 至 0. 05g/L ；特別優選 0. 01 至 0. 03g/L)、L-胱氨酸(0. 001 至 lg/L ；優選 0. 01 至 0. 05g/L ；特別優選 0.015 M 0. 03g/L)、L_ 脯氨酸(0. 001 至 1. 5g/L ； 優選0. 01至0. 07g/L ；特別優選0. 02至0. 05g/L)、L_色氨酸(0. 001至lg/L ；優選0. 01至 0. 05g/L ；特別優選 0. 015 至 0. 03g/L)和 L-穀氨醯胺(0. 05 至 10g/L ；優選 0. 1 至 lg/L)。 可以將這些胺基酸分別地或組合地添加至培養基。尤其優選組合添加含有上述所有述及的 胺基酸的胺基酸混合物。在特定的實施方式中，使用的無血清和蛋白質的培養基額外含有上述胺基酸混合 物和經純化的、超濾的大豆蛋白腖的組合。US 6936441的培養基特別非常適合於培養CHO細胞，但是同樣可以用於其他的細 胞。更合適的培養基是在US 2007/0212770(Grillberger等；巴克斯特國際公司、巴 克斯特保健股份有限公司)中公開的無寡肽的培養基。優選培養基是通過利用碳酸氫鹽離子、典型地作為碳酸氫鈉提供而被緩衝。適當地，培養基的滲透壓度在210和650m0sm(毫克滲透壓)之間，優選270至 450m0sm,更優選310至350m0sm，並且最優選320m0sm。優選上清液的滲透壓度保持在本發 明全部方法的一個或多個這些範圍內。培養可以是任何普通型的培養，比如分批、補料分批或者連續式，但是優選是補料 分批式或連續式。合適的連續培養包括重複分批培養、恆化培養、恆濁培養或灌注培養。分批培養從所有的營養和需要的細胞開始，並且培養進行直至完成，即，直到營養 被耗盡或者由於某種原因培養被停止。補料分批培養是一種分批方法，從意義上講，其從細胞和營養開始，但是其然後以 一種控制方式用進一步的營養進行補料，以便限制細胞的培養。該補料分批策略典型地在 生物工業生產中被採用，以便在生物反應器中達到較高細胞密度。該補料溶液通常是高度 濃縮物，以避免生物反應器的稀釋。營養受控制的添加直接影響到培養物的生長速率，並且 允許避免溢流新陳代謝(形成新陳代謝副產品)和氧氣限制(厭氧生活)。最常見的情況 是，生長限制性的營養是葡萄糖，其作為高度濃縮葡萄糖漿(例如600-850g/L)被供應至培 養物。不同的策略能夠被用於控制在補料分批法中的培養。例如，任何溶解氧張力(DOT、 PO2)、攝氧率(OUR)、葡萄糖濃度、乳酸鹽濃度、pH和氨水濃度能夠通過保持參數恆定而被用 於監控和控制培養物生長。在連續培養中，營養被添加，並且典型地，培養基被抽出，以便除 去不希望有的副產品並保持穩定狀態。合適的連續培養法被是重複的分批培養、恆化培養、 恆濁培養和灌注培養。CHO細胞，例如，可以在灌注合適的培養基的攪拌罐或氣升罐中培養，灌注速度是 每天2至10個體積交換，並且氧濃度在40%和60%之間、優選約50%。另外，該細胞可以 利用恆化器方法進行培養，採用上述給定的優選PH值，氧濃度在10%和60%之間(優選約 20%),以及稀釋率D為0. 25至1. 0、優選約0. 5。在重複的分批培養、亦稱串聯次培養(serial subculture)中，細胞被置於培養基中並且生長至期望的細胞密度。為避免衰退期開始和細胞死亡，在細胞達到它們的最大濃 度之前用完全生長培養基稀釋培養物。稀釋量和頻數變化範圍很大，並且取決於細胞系的 生長特點和培養方法的便利性。該方法能夠根據需要被多次重複，除非細胞和培養基在次 培養中被棄去，培養物的體積將隨每次稀釋而逐級增加。增加的體積可以通過使反應器尺 寸足夠大以允許在容器內部稀釋、或者通過將稀釋的培養物分配入數個容器而被加工。這 類培養的基本原理是保持細胞處於指數生長狀態。串聯次培養的特徵在於，培養物的體積 始終逐級增加，可以有多次收穫，細胞持續生長，並且該方法能夠如期持續下去。在恆化器和恆濁器方法中，抽出的培養基含有細胞。因此，保持在細胞培養容器中 的細胞必須生長以保持穩定狀態。在恆化器方法中，典型地通過控制稀釋率即新鮮培養基 加入速度來控制生長速率。細胞被在次最大生長速率下培養，這通過限制稀釋率而實現。生 長速率典型地較高。相反，在恆濁器方法中，稀釋率被設定為在給定工作條件比如pH和溫 度下細胞能夠取得的允許最大生長速率。在灌注培養中，抽出的培養基沒有細胞，因為大多數細胞被保持在培養容器中，例 如被保持在抽出的培養基所流過的薄膜上。然而，典型地，這樣一種薄膜不會保留100%的 細胞，並且如此當培養基被抽出時一部分被除去。對於以非常高的生長速率操作灌注培養 可以不是關鍵的，因為主要的細胞被保留在培養容器中。連續培養，特別是重複的分批培養、恆化器培養和恆濁器培養，典型地被以較高的 生長速率操作。根據普通的實踐，典型的是設法保持生長速率在最大值、或者接近最大值， 努力得到最大體積生產率。以每一時間間隔每體積培養物的蛋白質量或活性的單位測量體 積測定生產率。較高的細胞生長等同於每天生產出較大體積的培養物，並且因此通常被認 為反映了較高的體積生產率。本發明的發明人意外地發現，在特定的實施方式中，最大體積 生產率不是在細胞的最大生長速率處獲得的。如實施例中所述，在恆化培養中表達弗林蛋 白酶的CHO細胞克隆的最大生長速率是在36. 5°C的溫度下觀察到的，但是最大體積生產率 是在35. 1°C處觀察到的。儘管由於在較低溫度下導致較低的生長速率，得到較低的收穫體 積，但產生的重組蛋白含量卻大得多，以至於總之越低的溫度培養是產量越高。適當地，在本發明的第一、第二或第三個方面中，細胞培養上清液被保持在一個溫 度下，其被設定為低於觀察到最大生長速率時溫度至少0. 5°C、優選至少1. 0°C的溫度。本 實施方式中，優選培養是連續培養，特別是重複的分批培養、恆化器培養或恆濁器培養。哺乳動物細胞比如CHO和BHK細胞一般地被培養為懸浮培養液。也就是說，細胞 被懸浮於培養基中，而不是粘附在固體支持物上。細胞可以可選地被固定化在載體上、尤其 是在微載體上。多孔載體，比如Cytoline 、Cytopore 或Cytodex ，可以是特別合適的。通常在細胞培養物中監控細胞密度。原則上，高細胞密度將被認為是期望的，因 為，假如要保持單位細胞生產率，這應該導致每生物反應器體積較高的生產率。然而，實際 上提高細胞密度可能對細胞有害，並且單位細胞生產率被降低。因此需要監控細胞密度。迄 今，在哺乳動物細胞培養方法中，這已經通過如下方法進行抽取培養液樣本，在顯微鏡下 或者使用細胞計數裝置比如購自德國Reutlingen市Scharfe Systems有限公司的CASY TT 裝置分析它們。我們目前已發現，利用合適的導入(或導入培養基穿過、並且懸浮細胞經過 其、然後返回到生物反應器的迴路)生物反應器本身的探針來分析細胞密度是有利的。這 些探針是可從Aber儀器公司商業購買的，例如Biomass Monitor 220、210、220或230。在
11培養物中的細胞可用作在電場影響下的微小電容器，因為絕緣的細胞膜允許堆積電荷。得 到的電容能夠被測量；這取決於細胞類型，並且與活細胞的濃度成正比。10至25mm直徑的 探針使用兩個電極來把射頻場施加到生物質和第二對電極上，以便測量最終的極化細胞的 電容量。得到的信號的電子加工產生輸出信號，其是活細胞濃度的一種精確測量手段。該 系統對具有滲漏的細胞膜、培養基、氣泡和碎片的細胞不敏感。典型地，細胞密度是1. OxlO6至5. OxlO6個細胞/ml、適當地為1. OxlO6至3. 5xl06 個細胞/ml、適當地為1. 4xl06至2. 8xl06個細胞/ml、優選為1. 6xl06至2. 6xl06個細胞/ ml、最優選1. SxlO6至2. 4xl06個細胞/ml。向優選範圍的較高端提高細胞濃度能夠提高體 積生產率。儘管如此，可聯想到包括作為範圍較高端和較低端的上述設定值中任何一個的 細胞密度的範圍。培養典型地在生物反應器中進行，該生物反應器通常是1升至10000升容量例如 5、10、50、100、1000、2500、5000或8000升的不鏽鋼、玻璃或塑料容器。該容器通常是剛性
的，但是軟質塑膠袋能夠被使用，特別是對於較小規模而言。這些容器一般是「一次使用」類 型。通過本發明的頭三個方面中的任何一種方法生產的異源的或重組的蛋白質優選 是血液蛋白質。術語「血液蛋白質」，我們包括存在於或能夠存在於人或動物血液中的任何 蛋白質，包括被改造成用於靜脈注射的蛋白質。合適的血液蛋白質包括血清白蛋白，凝血 因子 I、Π、ΙΙΙ、ν、νΠ、νΠΙ、ΙΧ、Χ、XL、Xn和 XIII，弗林蛋白酶、von Willebrand(馮維勒布 蘭特)因子，組織纖溶酶原激活物，白介素，幹擾素，金屬蛋白酶比如ADAMTS蛋白酶(例如 ADAMTS-13)，免疫球蛋白比如IgG、IgM、IgA或IgE和免疫球蛋白片段。合適的抗體或免 疫球蛋白片段包括Fab 樣分子(Better 等，(1988) Science, 240,1041) ；Fv 分子(Skerra 等，(1988) Science 240,1038)；單鏈Fv (ScFv)分子，其中VH和VL伴侶結構域通過柔韌的 寡肽被連接(Bird 等，(1988) Science，242，423 ;Huston 等，(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85,5879)以及包含分離的V結構域的單域抗體(dAbs) (Ward等，(1989)Nature. 341， 544)。免疫球蛋白和它們的片段可以被「人源化」。換句話說，齧齒動物來源的可變域可以 被融合於人類來源結構域的恆區，從而使得到的抗體保留了齧齒動物親代抗體的抗原專一 性(Morrison et a/(1984)Proc. Natl. Acad. Sci. USA81，6851-6855)。在一種優選的實施方式中，細胞培養物被用於任選地與馮維勒布蘭特因子(vWF) 一起生產因子VIL能夠將vWF單獨地加入培養基中，並且優選是重組體。作為另一種選擇， vWF能夠通過在培養物中包括分泌vWF的細胞、以及分泌FVIII的細胞而被共同生產。然 而，優選FVIII和VWF被共表達，即，每個細胞可同時分泌FVIII和VWF。重組VWF可以按 照在文獻Schlokat等(1995)，「重組von Willebrand因子的大規模生產」，Thrombosisand HaemOStaSiS.78，1160或US 6114146 (巴克斯特公司)中描述的方法得到。後一專利還公 開了能夠被用於與分泌FVIII的細胞共同生產vWF的細胞。在US 5250421(遺傳學研究 所)和Kaufman等(1989)，Mol. Cell Biol. 9，1233-1242中公開了共表達這兩種蛋白質的 細胞。在此使用的術語「因子VT表示具有凝血因子VDI活性的任何多肽或多肽複合體。激 活的因子VDI在因子X向因子Xa的轉化中具有輔助因子功能，該轉化在存在磷脂和鈣離子 的條件下被因子IXa啟動。通常，在合適的測定中，由促進因子X向因子Xa的轉化的程度
12能夠估計出活性因子VDI的數量。在典型的測定中，因子Xa水解特定的顯色底物，從而釋出 生色團，其數量通過分光光度法確定。可商業購買的測定試劑盒包括因子VDI顯色分析試 劑盒(Dade Behring，瑞士 ；US 6，100,050)；以及 Coatest 因子VDI試劑盒(Chromogenix，瑞 典)。在人類身上的因子VDI濃度限定為1 IU/ml血液。Coatest因子VDI試劑盒能夠確定相 當於至少0.01 IU/ml血液的FVIII活性。要被認為是如上限定的因子通，多肽或多肽複合 體必須具有至少天然因子VDI的活性，以使得當以與天然因子VDI相同的納摩爾濃度存在 於血液中時，其活性可通過Coatest因子VDI測定法檢測。用於本發明方法的生產的合適的FVIII是天然的、全長FVIII。豬FVIII可以根 據本發明被生產出來，但是更優選人FVIII。作為天然FVIII的替代物，能夠製備出變體 和同功異質體。本技術領域已知例如美國專利No. 5422260、4749780、4868112、4877614和 5171844所述的變體和缺失衍生物。術語「重組因子VDI的缺失衍生物」被定義為具有因子 VDI活性、由全長因子VDI多肽通過刪除一個以上胺基酸而衍生的一種以上多肽鏈。優選地，所 述缺失衍生物沒有大部分B結構域，但是保留了 B結構域的氨基端和羧基端序列部分，這些 序列對於在體內將最初的翻譯產物蛋白水解加工成兩個多肽鏈而言是必不可少的。鑑定為 "r-VID SQ」的這樣一種因子VDI缺失衍生物的生產在WO 91/09122中被描述。術語「r-VDI SQ」定義為由全長因子VDI衍生並缺乏胺基酸743至1636的多肽鏈。缺乏全部或部分B結構 域的進一步的FVIII變體在US 6358703中有描述。在US 5854021中公開了用於轉化CHO和293S細胞的合適載體。表達FVIII的 BHK細胞可以按照在文獻Wood等(1984) ,Nature. 312,330-337中公開的方法製備出來，或 者由ATCC作為培養物CRL-8544得到。表達刪除B結構域的FVIII變體的CHO細胞在文獻 Lind et al (1995)，Eur. J. Biochem. 232，19-27 和 US 5661008 中有描述。三個這樣的細胞 類型被保藏在德國微生物菌種保藏中心，包藏編號為DSM 6415, DSM 6417、以及DSM6416。當FVIII和VWF被共同生產時，它們之間的複合體可以通過如下步驟進行提純 離心培養基以除去細胞，然後在不會引起複合體分離的條件下，將得到的液體加載到含有 FVIII或VWF的抗體、或者可特異性地結合FVIII或VWF的肽的固定化固體支持物上。合適 的方法在US 6307032 (巴克斯特公司)和US 5200510 (ZymoGenetics)中有教導。FVIII (任選地與vWF複合)然後可以被配製並以已知的方式使用。例如，按照在 例如在中US 6586573 (巴克斯特國際公司)、W0 94/07510或US 6599724中公開的方法，已 經在不含動物性蛋白質的培養基中生產出的FVIII優選被配製在無蛋白質的組合物中，並 且用於治療A型血友病病人。若本發明的方法被用於生產FVIII，則優選細胞培養上清液被保持在設定為 36 士0. 9°C、優選36 士0. 5°C、更優選36 士0. 2 °C、並且最優選36 °C的溫度和/或被設定為 7. 20 士 0. 05、優選7. 20 士 0. 03、更優選7. 20 士 0. 01、最優選7. 20的pH並且/或者細胞培養 上清液的溶解CO2濃度為1至10%、優選4.0至9.0%、更優選5. 5至8.5%。優選地，這些 參數中的至少兩個是在優選的限定範圍內，即，溫度和PH、溫度和dC02、或pH和dC02。最優 選所有三個參數被控制在優選的限定範圍內。如實施例中所示，當本發明被用於生產FVIII時，優選在細胞培養上清液中包括 銅。典型地，細胞在包含4ppb Cu2+的細胞培養上清液中被培養。優選地，在細胞培養上清 液中Cu2+的濃度是至少5ppb，並且優選至少7、10、15或25ppb。
在可供選擇的優選實施方式中，細胞培養物被用於生產ADAMTS-13。ADAMTS-13，亦稱可切割von Willebrand因子的蛋白酶(vWF_cp)，是金屬蛋白酶 家族的成員。其具有通過切割在vWF中殘基Tyr-842和Met_843之間的肽鍵將大VWF多聚 體代謝為較小形式的能力。該金屬蛋白酶被Ca2_/Ba2激活，並且不被絲氨酸或半胱氨酸蛋 白酶抑制劑抑制。不足的yon Willebrand因子(vWF)降解已經與血栓性血小板減少性紫 癜(TTP)有關。在遺傳性的TTP中，ADAMTS-13缺失或者功能性缺損；而在非家族性的、獲 得性形式的TTP中，在大部分病人中可短暫地觀察到抑制ADAMTS-13活性的自體抗體。人類ADAMTS-13基因的克隆和表達在文獻Plaimauer等，2002，Blood. 15 ； 100(10) :3626-32中有描述。與cDNA的完全序列一起的人類ADAMTS-13基因的克隆和表達 也在US 2005/0266528A1 (Laemmle等)中被公開。用於本發明方法生產的合適的ADAMTS-13 是天然的、全長ADAMTS-13，優選人類ADAMTS-13。作為天然FVIII的替代物，能夠製備出變 體和同功異質體。在此使用的術語「ADAMTS-13」表示具有ADAMTS-13活性、特別是切割vWF中在殘基 Tyr-842和Met_843之間肽鍵的能力的任何多肽或多肽複合體。通常，活性ADAMTS-13的數 量可以通過功能性測定、比如使用修飾的馮維勒布蘭特因子肽作為ADAMTS-13的底物的功 能性測定而確定(Tripodi 等· J. Thromb. Haemost. 2008 年 9 月；6 (9) 1534-41)。優選的確 定r-hu ADAMTS13活性的方法在文獻Gerritsen et al. 「基於降低的降解vWF的膠原結合 親合力的切割von Willebrand因子(vWF)的蛋白酶的測定用於診斷血栓性血小板減少性 紫癜(TTP)的工具」，Thromb Haemost. 1999 ；82 =1386-1389中被公開。在該測定中，IU相當 於在庫存的正常人血漿中ADAMTS-13活性的水平。要被認為是如上限定的ADAMTS-13，多肽 或多肽複合體必須具有天然ADAMTS-13活性的至少1%。ADAMTS-13的數量還可以通過測量 ADAMTS-13抗原而確定，例如使用在文獻Rieger et al,2006,Thromb Haemost 200695(2) 212-20中公開的ELISA方法。按照Plaimauer等(2002，參見前述)和US 2005/0266528A1中描述的方法， 通過在哺乳動物細胞培養物中表達，可以製備出蛋白水解活性的重組ADAMTS-13。在文 獻 Plaimauer B, Scheiflinger F. Semin Hematol. 2004Jan ；41 (1) :24_33 中公開了表達 ADAMTS-13的細胞的重組培養方法。用於表達ADAMTS-13的優選的細胞類型包括HEK-293 細胞和CHO細胞。US 2005/0266528A1 和 Zheng 等，2001，Blood. ,98 1662-1666 公開 了純化 ADAMTS-13的方法。可以根據慣常的方法將純化的ADAMTS-13進行配製並且進行治療性使 用，例如用於治療TTP。若本發明的方法被用於生產ADAMTS-13，則優選細胞培養上清液被保持在設定為 36. O士0. 9°C、優選36. O士0. 5°C、更優選36. O士0. 2°C、並且最優選36. 0°C的溫度和/或被 設定為7. 15 士0. 05、優選7. 15 士0. 03、更優選7. 15 士0. 01、最優選7. 15的pH ；並且/或者 細胞培養上清液具有1至10 %、優選4. 0至9. 0 %、更優選5. 5至8. 5 %的溶解CO2濃度。優 選地，這些參數中的至少兩個是在優選的限定範圍內，即，溫度和pH、溫度和dC02、或pH和 dC02。最優選所有三個參數被控制在優選的限定範圍內。在可供選擇的優選實施方式中，細胞培養物被用於生產弗林蛋白酶。弗林蛋白酶，也被稱為PACE(配對鹼性胺基酸切割酶)，屬於枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶組，其在切割前體蛋白酶中、尤其在分泌腺合成中起重要作用(Van de Ven et al.，Crit. Rev. Oncogen.，4 :115_136，1993)。它是鈣依賴性絲氨酸內切蛋白酶 (endoprotease)，在結構上安排成數個功能區，即信號肽、前體肽、催化結構域、同型B或 P-結構域、位於C-末端的半胱氨酸富集域、橫膜結構域和細胞質尾部。該蛋白酶裂解位點 包含特徵為胺基酸序列Arg-X-Lys/Arg-Arg的識別序列。該蛋白酶一弗林蛋白酶可切割特 別地在該共有序列之後的前體肽(Hosaka et al.，1991，J. Biol. Chem. 266 12127-12130)。完整的弗林蛋白酶被併入高爾基體的膜系統，並且其在那裡具有功能活性 (Bresnahanet al.，J. Cell Biol. 1990 ;111 :2851_9)。一旦將新合成的弗林蛋白酶前體 由內質網轉運到高爾基體隔室，前體肽就會自身催化地分兩個加工步驟被除去(Anderson 等，EMBO J. 1997 ；16 :1508_18)。弗林蛋白酶還經由紅細胞漿質囊泡(endosomal vesicles) 在轉運高爾基體網絡(trans-Golgi network)和細胞表面之間循環，從而在兩種前體蛋白 質轉運穿過組成性分泌路徑、以及分子進入內吞路徑期間加工它們。弗林蛋白酶的細胞分 配至加工隔室通過其細胞質尾部內部的限定的結構特點而被引導(Teuchert等，J.Biol. Chem. 1999；74 :8199_07)。因為天然弗林蛋白酶的過量表達會消極地影響連續培養的細胞培養物的生 長，所以人們已經設法降低溶液中弗林蛋白酶對細胞的毒性影響。已經發現C-末端 功能區對於弗林蛋白酶的功能活性並非是必需的，並且體外表達的75-80kD的天然弗 林蛋白酶的平截形式能夠作為被分泌蛋白質而在細胞上清液中被檢測出來(Wise等， PNAS. 1990 ;87 :9378-82)。這種天然分泌的平截弗林蛋白酶也被稱為「棚式(shed)弗林 蛋白酶」 (Vidricaire 等，Biochem. Biophys. Res. Comm. 1993 ；195 1011-8 ；Plaimauer 等， Biochem. J.，2001 ；354 689-95)，並且是N-末端被切割的橫跨膜部分(Vey等，J. Cell Biol. 1994 ；127 1829-42)。通過基因工程平截的弗林蛋白酶蛋白，其中橫跨膜和細胞質結構域的編碼部 分已經被刪除，已經描述所述結構域中分別刪除胺基酸Δ 714-794 (Leduc等，J.Biol. Chem. 1992 ；267 14304-8 ；Molloy 等，J. Biol. Chem. 1992 ；267 16396-402)和胺基酸 Δ 716-794( "So I-PACE", Wasley 等，J. Biol. Chem. 1993 ；268 8458-65 ；Rehemtulla 和 Kaufman，Blood. 1992 ；79 :2349_55)和胺基酸 Δ 705-794 (Hatsuzawa 等，J.Biol· Chem. 1992 ；267 16094-9).額外包含一個半胱氨酸富集區域的缺失的弗林蛋白酶突變 體也已被描述(Hatsuzawa 等，J. Biochem. 1992 ；101 :296_301 ；Creemers 等，J. Biol. Chem. 1993；268 :21826_34)。WO 2008/141824(巴克斯特國際公司、巴克斯特保健股份有限公司)公開了一種 平截的缺少胺基酸578至794，即Δ 578-794的人類弗林蛋白酶。在此使用的術語「弗林蛋白酶」表示具有弗林蛋白酶蛋白質分解活性的任何多肽 或多肽複合體。弗林蛋白酶、平截的弗林蛋白酶或者弗林蛋白酶衍生物的蛋白質分解活性的評價 能夠通過任何合適的測試進行，例如使用由弗林蛋白酶對其特異的二鹼基裂解位點所組成 的螢光底物(Schlokat 等，Biotechnol. Appl. Biochem. 1996 ；24 :257_67)。所述測定的 1 個單位被定義為於30°C下在1分鐘內由螢光底物Boc-Arg-Val-Arg-Arg-AMC釋放Ipmol 的7-氨基-4-甲基香豆素(AMC)所用弗林蛋白酶的量。用於該測試的限定的量典型地是0. 625U/ml。作為另一種選擇，還可以通過將弗林蛋白酶與前體蛋白質、例如前體rvWF—起 孵育足夠的時間來測量蛋白質分解活性。例如通過Western blotting能夠分析前體rvWF 的加工程度。能夠通過ELISA測試來測量弗林蛋白酶抗原的定量。合適的ELISA測試手段 是購自明尼蘇達州R&D系統公司的人弗林蛋白酶DuoSet、Mn (目錄編號DY1503)，其中小鼠 抗人弗林蛋白酶被用作捕獲抗體，並且生物素化山羊抗人弗林蛋白酶被用作檢測抗體。用於本發明方法生產的合適的弗林蛋白酶是天然的、全長弗林蛋白酶，優選人類 弗林蛋白酶。作為天然的替代物，能夠製備出變體和同功異質體，包括如上所述的那些。用於使用弗林蛋白酶或弗林蛋白酶變體轉化哺乳動物細胞、特別是CHO細胞的合 適載體，連同用於純化如此生產的弗林蛋白酶的方法一起在WO 2008/141824(巴克斯特國 際公司、巴克斯特保健股份有限公司)中有描述。WO 91/06314 (荷蘭生物技術公司)描述 了弗林蛋白酶表達載體、在哺乳動物細胞特別是C0S-1細胞中表達弗林蛋白酶的方法、以 及通過重組方式產生的弗林蛋白酶的純化。WO 92/09698 (遺傳學研究所和Chiron公司) 描述了弗林蛋白酶或者單獨、或者與vWF或因子IX結合一起在CHO細胞中的表達。在細胞培養期間，前體rVWF被內源產生的弗林蛋白酶加工成其成熟形式，該弗林 蛋白酶在許多細胞類型中以相對低的水平被表達(Wise等，1990，PNAS. 87 :9378_9382)。通 過異源弗林蛋白酶與前體rVWF的共表達，前體-rVWF加工能夠被更有效率地完成。作為 另一種選擇，WO 2008/141824建議，純化的弗林蛋白酶可以適合於用作促進rVWF加工的試 劑。若本發明的方法被用於生產弗林蛋白酶，則優選細胞培養上清液被保持在設定為 35. 1 士 0.9°C、優選35. 1 士 0. 5°C、更優選35. 1 士 0. 2°C、並且最優選35. 1°C的溫度和/或被 設定為7. 15 士0. 05、優選7. 15 士 0. 03、更優選7. 15 士0. 01、最優選7. 15的pH ；並且/或者 細胞培養上清液具有1至10 %、優選4. 0至9. 0 %、更優選5. 5至8. 5 %的溶解CO2濃度。優 選地，這些參數中的至少兩個是在優選的限定範圍內，即，溫度和pH、溫度和dC02、或pH和 dC02。最優選所有三個參數被控制在優選的限定範圍內。在可供選擇的優選實施方式中，細胞培養物被用於生產因子ΥΠ。「因子ΥΠ多肽」包括野生型因子ΥΠ (即，具有在美國專利No. 4，784，950中公開的氨 基酸序列的多肽)，以及相對於野生型因子νπ顯示出基本上相同的或提高的生物活性的因 子VD變體，並且因子νπ變體相對於野生型因子νπ具有基本上改變的或降低的生物活性。術 語「因子VT應當包括呈未被切割的(酶原)形式的因子ΥΠ多肽，以及已經被蛋白水解加工 從而產生它們各自的生物活性形式的(可以被稱為因子Vila)的那些多肽。典型地，因子 νπ在殘基152和153之間被切割而產生因子Vila。術語「因子ΥΠ多肽」還包括多肽，包括其 中因子VIIa生物活性相對於野生型因子VIIa的活性已經基本上改變或稍微降低的變體在 內。這些多肽包括，但不限於，其特定的胺基酸序列中已經導入變化的因子ΥΠ或因子Vila， 所述變化改變或破壞了多肽的生物活性。因子VIIa在凝血中的生物活性來自其⑴結合組織因子(TF)並且(ii)催化因子 IX或因子X的蛋白水解切割從而產生活化的因子IX或X (分別為因子IXa或因子Xa)的能 力。因子νπ多肽的生物活性(「因子νπ生物活性」)可以按照例如美國專利No. 5，997，864或 WO 92/15686中描述的方法，通過使用缺乏因子ΥΠ的血漿和促凝血酶原激酶來測量製品促 進凝血的能力而被定量。在該測定中，生物活性被表示為相對於對照樣品的凝固時間減少，並且通過與含有1個單位/mL因子ΥΠ活性的庫存人血清標準相比較而被轉算成「因子ΥΠ單 位」。作為另一種選擇，因子VIIa生物活性可以通過下述方法定量(i)測量因子Vila(或 因子ΥΠ多肽)在包含包埋於類脂膜和因子X中的TF的體系中產生活化因子X (因子Xa) 的能力(Persson 等，J. Biol. Chem. 272 =19919-19924,1997) ； (ii)測量在含水體系中的因 子X水解情況；(iii)使用基於表面胞質基因共振的儀器測量因子VIIa(或因子ΥΠ多肽) 對TF的物理結合(Persson，FEBS Letts. 413 =359-363,1997) ； (iv)測量合成的底物被因 子VIIa(或因子ΥΠ多肽)體外水解的情況；或者(ν)測量在不取決於TF的體外系統中凝血 酶的產生。作為另一種選擇，可以通過ELISA確定FVII抗原。合適的ELISA是購自Assay Pro 公司(St Charles 市，密蘇裡州)的 AssayMax Human Factor ΥΠ (FVII)ELISA 試劑盒， 目錄編號EF1007-1，其使用了單克隆抗人FVII作為捕獲抗體，並且生物素化多克隆抗人 FVII作為檢測抗體。優選的用於天然(野生型)因子VIIa和/或因子VIIa變體的體外蛋白水解測定 是在微孔板(MaxiSorp，Nunc，丹麥)中進行，如US 2007/0219135 (Novo Nordisk保健公司) 所述。因子 VIIa(IOnm)和因子X (0. 8mM)在 100ml 含有 0. IM NaCl、5mM CaCl2 和 lmg/ml 牛血清白蛋白的50mM HEPES，pH 7. 4中被孵育15分鐘。然後通過添加的50mL含有0. IM NaCl、20mM EDTA和lmg/ml牛血清白蛋白的50mM HEPES，pH 7. 4來終止因子X切割。通過 添加終濃度0. 5mM的顯色底物Z-D-Arg-Gly-Arg-對硝基苯胺(S-2765，Chromogenix,瑞 典)，測量產生的因子Xa的量。在SpectraMax 340板中連續地測量在405nm處的吸光度。 在減去不包含FVIIa的空白孔吸光度之後，在10分鐘期間讀出吸光度，可以用來計算變體 的蛋白水解活性與野生型因子VIIa的蛋白水解活性之間的比率比率=(A405nm因子 VIIa 變體)/(A4tl5nm 因子 VIIa 野生型)。在該測定的變化中，FVII被確定。促凝血酶原激酶被包括在內。樣品中的FVII與 Ca2+離子和產生少量FXa的組織因子形成複合物。FXa將FVII活化成FVIIa。可在市場上買到的FVII活性測定手段是購自Aniara (Mason,俄亥俄州)的 HEM0CL0TFVII試劑盒，目錄編號ACK081K，其中促凝血酶原激酶鈣引起的凝血被測量。相對於野生型因子VIIa具有基本上相同或提高的生物活性的因子ΥΠ變體包括這 樣的變體當在凝固性測定、蛋白水解測定、或如上所述TF結合性測定中的一個或多個中 測試時，相對於已經在相同細胞類型中產生的因子Vila，顯示出至少約25%、優選至少約 50%、更優選至少約75%、並且最優選至少約90%的比活力。相對於野生型因子VIIa具有 基本上降低的生物活性的因子ΥΠ變體包括這樣的變體當在凝固性測定、蛋白水解測定、或 如上所述TF結合性測定中的一個或多個中測試時，相對於已經在相同細胞類型中產生的 野生型因子Vila，顯示出小於約25%、優選小於約10%、更優選小於約5%、並且最優選小 於約1 %的比活力。相對於野生型因子ΥΠ具有基本上改變的生物活性的因子ΥΠ變體包括，但 不限於，顯示出不取決於TF的因子X蛋白質分解活性的因子ΥΠ變體和結合TF但是不切割 因子X的那些變體。與野生型因子ΥΠ相比較是否顯示出基本上相同的或更好的生物活性、 或者可選地相對於野生型因子ΥΠ顯示出基本上改變的或降低的生物活性的因子ΥΠ的變體， 包括，但不限於，具有因插入、缺失、或取代一個以上胺基酸而不同於野生型因子ΥΠ的氨基 酸序列的多肽。具有與野生型因子Vn基本上相同生物活性的因子Vn變體的非限制性例子包括S52A-FVIIa、S60A_FVIIa(Lino 等，Arch. Biochem. Biophys. 352 182-192，1998)；在美 國專利No. 5，580，560中公開的顯示出提高的蛋白水解穩定性的因子VIIa變體；在殘基 290和291之間或者在殘基315和316之間已經被蛋白水解切割的因子VIIa(M0llerup 等，Biotechnol. Bioeng. 48 :501_505，1995)；氧化形式的因子 Vila(Kornfelt 等，Arch. Biochem. Biophys. 363 :43_54，1999)；在 PCT/DK02/00189 中公開的因子 ΥΠ變體；以及在 W002/38162中公開的顯示出提高的蛋白水解穩定性的因子ΥΠ變體(Scripps研究所)；在 WO 99/20767 (明尼蘇達大學)中公開的具有修飾的Gla結構域並且顯示出增強的膜結合性 的因子ΥΠ變體；以及在WO 01/58935 (Maxygen ApS)中公開的因子ΥΠ變體。與野生型因子VIIa相比具有提高的生物活性的因子Vn變體的非限制性例子包括 在 WO 01/83725、 WO 02/22776、 WO 02/077218、 WO 03/27147、 WO 03/37932、 WO 02/38162 中公開的因子ΥΠ變體(Scripps研究所)；以及在JP 2001061479中公開的具有增強活性的 因子VIIa變體(Chemo-Sero-Therapeutic研究所)。相對於野生型因子ΥΠ具有基本上降 低或改變的生物活性的因子VD變體的非限制性例子包括R1 52E-FVIIa(Wild-goose等， Biochem. 29 :3413_3420，1990)、S344A-FVIIa(Kazama 等，J. Biol. Chem. 270 :66_72，1995)、 FFR-FVIIa(Hoist 等，Eur. J. Vase. Endovasc. Surg. 15 :515_520，1998)、以及缺乏 Gla 結構 域的因子 VIIa(Nicolaisen 等，FEBS Letts. 317 :245_249，1993)。在產生FVII之後，可以將多肽從培養基中提純出來。因子ΥΠ多肽的純化可以包 括例如，在抗因子Vn抗體柱子上進行親和色譜(參見，例如，Wakabayashi等，J. Biol. Chem. 261 :11097，1986 ；以及 Thim 等，Biochem. 27 :7785，1988)；以及使用因子 XIIa 或具有 胰蛋白酶樣特異性的其他蛋白酶比如，例如，因子IXa、激肽釋放酶、因子Xa、以及凝血酶， 通過蛋白水解切割進行活化。參見,例如Osteoid et al,Biochem 11:2853(1972) ；Thomas, 美國專利 No 4，456，591 ；以及 Hedner et al, J Clin Invest 71:1836(1983)。作為另一 種選擇，因子VD可以使其穿過離子交換層析柱子比如Mono Q (Pharmacia)等而活化。因子Vn或活化的因子Vn可以被配製，並且按已知的方式使用。例如，其可以在治療 血友病患者的出血中使用。若本發明的方法被用於生產因子VL則優選細胞培養上清液被保持在設定為 36. 5 士 0. 9°C、優選36. 5 士 0. 5°C、更優選36. 5 士 0. 2 °C、並且最優選36. 5°C的溫度和/或被 設定為7. 20 士0. 05、優選7. 20 士0. 03、更優選7. 29 士0. 01、最優選7. 29的pH ；並且/或者 細胞培養上清液具有1至10%、優選4. 0至9. 0%、更優選5. 5至8. 5%的溶解CO2濃度。優 選地，這些參數中的至少兩個是在優選的限定範圍內，即，溫度和pH、溫度和dC02、或pH和 dC02。最優選所有三個參數被控制在優選的限定範圍內。以下用實施例進一步闡明本發明，但並不是對本發明作任何限制。實施例1 基礎細胞培養物FVIII 生產典型的培養物是通過使用在文獻Kaufman等(1989)，MoI. Cell. Biol. 9 1233-1242和US 5250421中描述的被轉化成共表達因子VDI和馮維勒布蘭特因子的10A1C6 CHO細胞系的亞克隆而在生物反應器中建立。通過採用不包含動物來源產物的標準培養基、 並且在微孔板中進行亞克隆而獲得特定的亞克隆。標準培養基是
DMEM/Ham' s F12 50/5011.76g/kg其中加入下述成分L-穀氨醯胺0.6g/kg乙醇胺1.53mg/kgSynperonic F680. 25g/kgNaHCO32g/kg大豆腖4g/kgCuSO4. 5H2017. 02mg/kg基本的DMEM/Ham' s F12 50/50培養基含有足以使完全培養基包含4. 3ppb Cu2+ 的 1. 3mg/kg Cu2+。ADAMTS-13 牛產使用磷酸鈣共沉澱法轉染CHO DUKX-Bll細胞，導入ADAMTS-13基因。細胞在 新黴素選擇條件下培養，並且在氨甲蝶呤和G418處理後進行選擇。在進行無血清適應 (serum-free adaptation)後，細胞被亞克隆，並且挑選亞克隆640-2作為生產克隆。標準培養基是以在US 2007/0212770中公開的培養基(Grillberger等；巴克斯特 國際公司、巴克斯特保健股份有限公司)為基礎的無血清的、無胰島素的、並且無寡肽的培 養基。弗林蛋白酶牛產使用磷酸鈣共沉澱法轉染CHO DUKX-Bll細胞，導入弗林蛋白酶基因。使用不含次 黃嘌呤、胸腺嘧啶脫氧核苷和甘氨酸的DHFR培養基選擇細胞。通過在含有IOOnM氨甲蝶呤 的培養基中進行亞克隆和選擇來鑑定生產用克隆488-3，接著進行無血清適應(serum-free adaptation)。標準培養基是以在US 2007/0212770中公開的培養基(Grillberger等；巴克斯特 國際公司、巴克斯特保健股份有限公司)為基礎的無血清的、無胰島素的、並且無寡肽的培養基。FVII 生產用雙順反子載體轉染CHO DUKX-Bll細胞以便允許共表達FVII和VKORC(維生 素K環氧化物還原酶複合體)。基因表達被CMV啟動子驅動，並且內部核糖體進入位點 (internal ribosomal entry site，IRES)被定位於 FVII 基因和 VKORC 基因之間。使用磷 酸鈣沉澱法轉染細胞。選擇培養基含有200 μ g/mL潮黴素B。細胞在無血清條件下被亞克 隆，並且挑選高表達亞克隆1E9作為生產克隆。因為在連續培養條件下就生長而言具有有 利的特性、生產率和穩定性，所以選擇1E9。在恆化器模式中評估穩定性兩個月的期限。標準培養基是基於在US 6，936，441 (巴克斯特公司)中公開的培養基，並且尤其 含有2. 5g/L大豆蛋白腖和5mg/L胰島素(Nucellin ,禮萊公司；或Novolin ,Nov0 Nordisk 公司)。用於FVIII生產的標準方法5L連續培養培養基在CO2培養箱(5-15% CO2)中在37°C下預適應數小時。為了建立培養物， 解凍至少一個ImL小瓶(IO7個CHO細胞/mL)，並且細胞在含有60mL預適應的培養基的Roux燒瓶(200mL)中稀釋，並且在CO2培養箱中在37°C下培養。在約3天後，將60mL培養物加 至含140mL新鮮培養基的1號轉瓶(1.8L)中。轉瓶被用15% CO2鼓泡，並且在37°C下轉動 培養。在兩天後，細胞被分離出1/3，並且在含新鮮培養基(200mL培養基+IOOmL培養物= 300mL每轉瓶)的2個轉瓶中培養。在兩天或進一步三天後，細胞再次分離出1/3，並且在 含如上所述新鮮培養基的總共6個轉瓶中培養。一旦達到要求的大約IxlO6個細胞/mL細 胞密度，就將ISOOmL接種物接種於已經按如上所述預適應的3. 2L培養基中，並且在5L生 物反應器中培養。在標準條件下，5L生物反應器在pH 7.2、細胞密度1.虹106個細胞/!111和 溫度37°C下操作。在標準條件下，培養物用氣泡大小為ΙΟμπι的O2 &0.25VVH (每體積培 養物每小時的O2體積)的速率鼓泡。在40L牛物反應器中津立接種物基本上按如上所述進行5L連續培養，得到了接種物存儲液。然而，存儲液大約是 5L，並且由18個而不是6個轉瓶得到。清潔BR-40生物反應器，並且在操作前滅菌，並且在 接種以前將大約8L的培養基轉接至BR-40生物反應器中。將大約5L的接種物存儲液從存 儲罐經由輸送管路轉移至生物反應器中，達到培養物的總體積為大約13L。一旦細胞密度達 到彡9xl05個細胞/ml，就將培養物用培養基稀釋(1 3)。在1至3或更多天後，細胞濃 度再次達到彡9xl05個細胞/ml，並且進行接種物向320L生物反應器的轉移。在320L牛物反應器中擴充清潔BR-320生物反應器，並且在操作前滅菌，並且在接種以前將大約80L的培養 基轉接至BR-320生物反應器中。將大約40L的接種物從BR-40生物反應器經由輸送管路 轉移至BR-320生物反應器，達到大約為120L的初始培養體積。一旦細胞密度達到彡9xl05 個細胞/ml，就將培養物用培養基稀釋(1 3)。在3至6天(總時間)後，細胞濃度再次 達到彡9xl05個細胞/ml，並且進行接種物向2500L生物反應器的轉移。2500L生物反應器W.AL將大約320L的接種物從BR-320生物反應器經由已經含有大約630L培養基的 輸送管路轉移至BRl生物反應器，達到大約為950L的初始培養體積。一旦細胞密度達到 彡9xl05個細胞/ml，就將培養物用培養基稀釋(1 3)至大約2500L的終體積。在4至7 天(總時間)後，細胞濃度再次達到彡9xl05個細胞/mL，並且將大約1150L的接種物從BRl 生物反應器轉移至含有大約1350L培養基的BR2生物反應器。在轉移後，將大約1150L的 培養基加至生物反應器BRl中，達到大約2500L的最終培養物體積。恆化器一旦在每個生物反應器中的細胞濃度達到彡1. 2xl06個細胞/mL，就啟動「恆化器」 培養模式。將每天大約1250L的培養基以連續方式加入每個生物反應器中。在每個2500L 生物反應器中的細胞濃度是在9xl05-1.6xl06個細胞/mL之間。大約1250L/天/生物反應 器的多次收穫物被存放在2-8°C下的無菌袋中。培養以恆化器模式保持約50-57天。在標 準條件下，將PH設定為7. 2，溫度設定為37°C，並且用氣泡大小10 μ m的O2以0. 02VVH(每 體積培養物每小時的O2體積)速率對培養物鼓泡。類似的培養方法也被應用於表達ADAMTS-13、弗林蛋白酶或FVII的CHO細胞的培養。
實施例2 各種參數改變對FVIII生產率的影響在各種培養條件下確定實施例1中描述的表達FVIII和vWF的CHO細胞克隆的 FVIII生產率。在單獨的實驗中，在5L規模的連續培養中改變pH、細胞密度和溫度。在每個情形 中，對照試驗採用PH 7. 1、1.4χ106個細胞/mL的細胞密度和37°C。當細胞密度上升時，FVIII的體積生產率(IU每升每天)、對於細胞密度1. 2xl06個 細胞/ml的數值，有如下所述的提高 因此，能夠通過提高細胞密度而實現生產率的顯著提高。該結果未曾被預測到，因 為提高細胞密度可能會降低單位細胞的生產率。另外，在特定的細胞密度下，發現生產率的 提高是大於細胞密度的提高，這更是令人驚奇。通過改變鼓泡參數，pH被增加到7. 2。在對照容器中，在pH 7. 1處，用氣泡大小 10 μ m的O2以0. 25VVH(每體積培養物每小時的O2體積)的速率對培養物鼓泡。在試驗容 器中，在7. 2處，用氣泡大小10 μ m的空氣以1. 25VVH(每體積培養物每小時的空氣體積) 的速率對培養物鼓泡。通過pH從7. 1提高到7. 2，生產率能夠提高約16%。通過溫度從37°C降至36°C，生產率提高約22%。實施例3 細胞密度和銅濃度對FVIII生產率的影響在各種培養條件下確定實施例1中描述的表達FVIII和vWF的CHO細胞克隆的 FVIII生產率。對照培養在pH 7. l、37°C、4ppb Cu2+和1. 4xl06個細胞/mL的細胞密度下操作。對比培養在pH 7. 2和36°C下操作。在一個培養中，細胞密度增加到1.6xl06個細 胞/mL，並且在另一個培養中，其被增加到2. OxlO6個細胞/ml。在第三個培養中，細胞密度是2. OxlO6個細胞/ml，並且銅濃度從4ppb提高到6ppb。結果通過降低溫度、提高pH、並增加提高細胞密度至1.6xl06個細胞/ml (提高 14%),FVIII生產率提高了 41-50%。進一步將細胞密度增加到2. OxlO6個細胞/ml (43%), 生產率(與對照培養相比)增長了 39-77%。當在2. OxlO6個細胞/ml培養物中的銅增加 到6ppb時，生產率(與對照培養相比)提高了 48-98%。因此，通過略微地提高pH、略微地降低溫度、增加細胞密度僅43%並且增大銅濃 度50%，就能夠使FVIII生產率幾乎加倍。實施例4 細胞密度和銅濃度對vWF生產率的影響重複實施例3，不同的是測量vWF的體積生產率。在1. 6xl06個細胞/ml和4ppb 銅(36°C、pH 7.2)下，生產率是對照物的124%。在2. OxlO6個細胞/ml和6ppb銅下，生產 率是182%。因此，通過進行看起來較小的工藝參數改變，能夠再次實現生產率的明顯提高。實施例5 細胞密度、pH和dC02的影響在各種培養條件下確定實施例1中描述的表達FVIII和vWF的CHO細胞克隆的 FVIII生產率。在該實驗中，細胞密度從1.41x10s個細胞/ml提高至2. 03xl06個細胞/ml、pH從 7. 1提高至7. 2，而dC02濃度從減少9. 5%到6. 2%。FVIII的體積生產率(IU每升每天)提高了 98%，並且FVIII的比生產率(IU每 百萬細胞每天)提高了 36%。實施例6 :pH和溫度對弗林蛋白酶生產的影響表達弗林蛋白酶的CHO細胞在2. 5L生物反應器中被以恆化器模式培養。對於單 個的培養物，細胞密度保持平均1.52xl06和1.78xl06個細胞/ml，培養5天。在所有的實 驗中溶解氧被控制在20%空氣飽和度的設定值下。通過用CO2覆蓋生物反應器的液面上空 間，溶解CO2濃度被保持在5 % -6 %之間。利用「實驗設計方法」，將不同溫度與不同的pH值進行組合，以確定得到最大體積 生產率的弗林蛋白酶的條件。根據「Doehlert矩陣」，將5個溫度與3個pH值相組合，得到 7個如下所述溫度和pH的組合 36.5°C和pH 7. 20的組合被選為中點，將其應用於兩批發酵(上述表中的4和5)。通過表面響應方法(ResponseSurface Methodology，RSM)、使用「Minitab」軟體， 用統計學分析了包括體積生產率和比生產率、以及生長速率的數據。溫度，但不是pH，會明顯地影響生長速率，生長速率最大值出現在36. 5°C。通過溫 度從37°C降低到35. 1°C，體積生產率能夠被提高大約2. 7倍。對於比生產率，可看到類似 的趨勢。這是個令人驚奇的結果，因為人們或許一致認為最大體積生產率將會被觀察發生 在其生長速率是最大的溫度處。PH對於比生產率和體積生產率的影響在7. 20+/-0. 1的研 究範圍內是較小的。在7. 15+/-0.05(或者在7. 10和7.20之間)的較低pH範圍內觀察到 略微較高的生產率，因此PH 7. 15被選為用於弗林蛋白酶生產的設定值。實施例7 :dC02對弗林蛋白酶生產的影響在2. 5L生物反應器中以恆化器模式平行地進行兩個發酵操作，一個操作具有大 約7. 5%的CO2濃度，而另一個具有大約12%的CO2濃度。通過改變在液面上空間流動中的 CO2組分而調節CO2濃度。在37°C、pH 7. 15和20% p02下進行發酵。在12天的高CO2培 養中，細胞計數是大約1. 07xl06個細胞/ml，並且在低CO2培養中為1. 49xl06個細胞/ml。CO2濃度從12%降低到7. 5%具有體積生產率提高大約2. 78倍、和比生產率提高 2倍的影響。在低CO2培養中的細胞生長速率也是更高。實施例8 :pH和溫度對FVII生產的影響將表達FVII的CHO細胞在2. 5L生物反應器中以恆化器模式培養，其中對於單個 的培養，細胞密度被保持在約2. 5xl06個細胞/ml的平均值(在2xl06和3xl06個細胞/ml 之間)，培養4周。在所有的實驗中溶解氧被控制在20%空氣飽和度的設定值下。通過用 CO2覆蓋生物反應器的液面上空間，溶解CO2濃度被保持在4% -7%之間。利用「實驗設計方法」，將不同溫度與不同的pH值進行組合，以確定得到最大體積 生產率的FVII的條件。根據「Doehlert矩陣」，將3個溫度與3個pH值相組合，得到5個 如下所述溫度和PH的組合 平均最大體積動力生產率是在36. 5°C和pH設定值7. 20處取得的。存在有正相互 作用的參數，使得兩個參數優化的結果大於分別地優化每個參數的組合效應。實施例9 :dC02對FVII生產的影響在小規模連續培養中測試4個不同CO2濃度(5. 0,6. 3,7. 6和8. 9% )對FVII生
產率的影響。培養細胞直至第8天恆化器，然後轉移入2. 5L Rushton生物反應器，並且在連續 條件下於PH 7. 20和36. 5°C下培養幾乎4周。由於在第一周期間需要平衡至不同的CO2濃 度，所以分析僅最後3周的數據。通過離線測量法和添加CO2入生物反應器的液面上空間 來控制CO2水平。記錄的細胞密度從CO2水平為8. 9%時的2. 36xl06個細胞/ml變化為在CO2水平 為5.0%時的2.87xl06個細胞/ml。相同範圍內的生長速率是0. 42CT1和0. 49CT1。在低CO2 水平處提高的比生長速率與提高的比生產率有相互關係。CO2對生長速率和比生產率的物 質影響導致對體積生產率的根本影響。CO2濃度從8. 9%降低到5%使比生長速率提高了 17%，比生產率提高了 10%，並 且體積動力學生產率提高了 35%。實施例10 溫度和pH對ADAMTS-13生產的影響在1.5L生物反應器中以恆化培養方式培養表達重組體ADAMTS-13的轉染的CHO 細胞。在第一個實驗中，將pH和溫度設定為在36°C至38°C和pH 7. 10至7. 30範圍內的 不同設定值。通過ELISA分析了來自穩定狀態的樣本的細胞計數和ADAMTS-13表達，並且測 量了來自恆化培養的稀釋率，從而計算出生長速率和體積ADAMTS-13表達。一旦發現最適 條件是在設計空間的外側範圍處，就將第二實驗設置為從35°C至37°C溫度範圍和pH 7. 05 至7. 15，並且分析了來自穩定狀態的數據。細胞密度範圍為1.17-1. 71xl06個細胞/ml。通 過用CO2覆蓋液面上空間來控制CO2,達到溶解CO2濃度為4-6%。使用統計軟體Minitab，歸一化並且分析兩次實驗的數據。通過使用用於pH和溫度的二次方程式模型，發現在pH 7. 13和36. 0°C處比生長速 率具有其最優值。溫度對生長速率的影響是很弱的。在pH 7. 15和36. 0°C處發現體積生產率具有最佳值。儘管溫度對生長速率的影響 很小，但溫度對體積生產率有相對較強的影響。假定恆溫37°C，pH從7. 10提高至7. 15的影響會使體積生產率增加10%。假定 恆定pH 7. 10，溫度從37°C降低至36°C的影響會使體積生產率增加14%。改變條件從pH 7. 10和溫度37°C至pH 7. 15和溫度36°C的總體影響是使體積生產率增加24%。引用的所有參考文獻的內容在此以參考方式被包括在本文中。
權利要求
一種在細胞培養上清液中培養分泌異源蛋白質的哺乳動物細胞的方法，其中，所述細胞培養上清液被保持在設定為X±0.9℃的溫度，其中X為35.1至36.5的值，附帶條件是所述溫度被設定為低於37℃。
2.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述溫度被設定為36士0.9°C。
3.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述溫度被設定為36士0.5°C。
4.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述溫度被設定為36士0.2°C。
5.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述溫度被設定為36°C。
6.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述溫度被設定為35.1 士0. 9°C。
7.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述溫度被設定為35.1 士0. 5°C。
8.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述溫度被設定為35.1 士0. 2°C。
9.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述溫度被設定為35.1°C。
10.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述溫度被設定為36.5士0. 9°C。
11.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述溫度被設定為36.5士0. 5°C。
12.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述溫度被設定為36.5士0. 2°C。
13.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述溫度被設定為36.5°C。
14.一種在細胞培養上清液中培養分泌異源蛋白質的哺乳動物細胞的方法，其中，所述 細胞培養上清液被保持在設定為X士0. 05的pH，其中X為7. 15至7. 20的值，附帶條件是所 述PH被設定為大於7. 10。
15.如權利要求14所述的方法，其特徵在於，所述pH被設定為7'.20 + 0.05。
16.如權利要求14所述的方法，其特徵在於，所述pH被設定為7'.20 + 0.03。
17.如權利要求14所述的方法，其特徵在於，所述pH被設定為7'.20 + 0.01。
18.如權利要求14所述的方法，其特徵在於，所述pH被設定為720。
19.如權利要求14所述的方法，其特徵在於，所述pH被設定為715 士 0.05。
20.如權利要求14所述的方法，其特徵在於，所述pH被設定為715 士 0.03。
21.如權利要求14所述的方法，其特徵在於，所述pH被設定為715 士 0.01。
22.如權利要求14所述的方法，其特徵在於，所述pH被設定為7'.15。
23.—種在細胞培養上清液中培養分泌異源蛋白質的哺乳動物細胞的方法，其中，所述 細胞培養上清液的溶解CO2濃度為1至10%。
24.如權利要求23所述的方法，其特徵在於，所述CO2濃度是4.0至9. 0 %。
25.如權利要求23所述的方法，其特徵在於，所述CO2濃度是5.5至8. 5 %。
26.如權利要求23所述的方法，其特徵在於，所述細胞培養上清液被保持在設定為 X士0. 9°C的溫度，其中X為35. 1至36. 5的值，附帶條件是所述溫度被設定為低於37°C。
27.如權利要求26所述的方法，其特徵在於，所述溫度被設定為36士0.9°C。
28.如權利要求26所述的方法，其特徵在於，所述溫度被設定為35.1 士0.9°C。
29.如權利要求26所述的方法，其特徵在於，所述溫度被設定為36.5士0. 9°C。
30.如權利要求1、23或26所述的方法，其特徵在於，所述細胞培養上清液被保持在設 定為X士0. 5的pH，其中X為7. 15至7. 20的值，附帶條件是所述pH被設定為大於7. 10。
31.如前述權利要求中任何一項所述的方法，其特徵在於，所述細胞培養上清液用碳酸 氫鹽緩衝。
32.如前述權利要求中任何一項所述的方法，其特徵在於，所述上清液用空氣鼓泡。
33.如前述權利要求中任何一項所述的方法，其特徵在於，細胞密度是1.OxlO6至 5. OxlO6 個細胞/ml。
34.如權利要求33所述的方法，其特徵在於，所述細胞密度是1.OxlO6至3. 5xl06個細 胞/ml。
35.如權利要求34所述的方法，其特徵在於，所述細胞密度是1.4xl06至2. SxlO6個細 胞/ml。
36.如權利要求35所述的方法，其特徵在於，所述細胞密度是1.6xl06至2. 6xl06個細 胞/ml。
37.如權利要求36所述的方法，其特徵在於，所述細胞密度是1.SxlO6至2. 4xl06個細 胞/ml。
38.如前述權利要求中任何一項所述的方法，其特徵在於，所述異源蛋白質是血液蛋白質。
39.如權利要求2、15或23中任一項所述的方法，其特徵在於，所述血液蛋白質是因子VIL
40.如權利要求39所述的方法，其特徵在於，所述因子VDI被與馮威勒布蘭特因子共表達。
41.如前述權利要求中任何一項所述的方法，其特徵在於，所述細胞培養上清液中的 Cu2+濃度至少是5ppb。
42.如權利要求41所述的方法，其特徵在於，所述Cu2+濃度至少是7、10、15或25ppb。
43.如權利要求2、19或23中任一項所述的方法，其特徵在於，所述血液蛋白質是 ADAMTS-I3。
44.如權利要求6、19或23中任一項所述的方法，其特徵在於，所述血液蛋白質是弗林蛋白酶。
45.如權利要求10、15或23中任一項所述的方法，其特徵在於，所述血液蛋白質是因子ΥΠ。
46.如前述權利要求中任何一項所述的方法，其特徵在於，所述哺乳動物細胞是齧齒動 物細胞，比如CHO細胞或BHK細胞。
47.如前述權利要求中任何一項所述的方法，其特徵在於，所述培養是分批培養。
48.如權利要求1至45中任一項所述的方法，其特徵在於，所述培養是補料分批培養。
49.如權利要求1至45中任一項所述的方法，其特徵在於，所述培養是連續培養，特別 是重複的分批培養、恆化器培養或恆濁器培養。
50.一種在包含細胞培養上清液的容器中培養分泌因子VDI的哺乳動物細胞的方法，其 中，所述細胞培養上清液中的細胞密度通過在線傳感器測量，新鮮培養基進入容器的流入 量被自動地控制，以便保持細胞密度在期望的範圍內。
51.如權利要求50所述的方法，其特徵在於，所述細胞密度至少是1.2χ106個細胞/ml。
全文摘要
在35.1-36.5℃和/或pH 7.15-7.20和/或10％以下的溶解CO2濃度下，培養分泌異源蛋白質的哺乳動物細胞比如CHO或者BHK細胞。優選異源蛋白質是因子Ⅷ、ADAMTS-13、弗林蛋白酶或因子Ⅶ。
文檔編號C12P21/00GK101910408SQ200880123254
公開日2010年12月8日 申請日期2008年12月22日 優先權日2007年12月27日
發明者伊夫-奧利維耶·斯託弗, 安德烈·喬萬尼奧裡, 維吉妮·夏洛特, 薇洛妮克·杜克洛, 西維亞·羅伊 申請人:巴克斯特國際公司;巴克斯特保健股份有限公司