一種尼泊司他汀生產工藝的製作方法
2023-10-07 14:39:44
專利名稱：一種尼泊司他汀生產工藝的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種尼泊司他汀生產エ藝。
背景技術：
尼泊司他汀，英文名稱Lipstatin，白色油狀物，是ー種用於生產新型減肥藥奧利司他的醫藥中間體。奧利司他是由發酵物尼泊司他汀經ー步加氫還原製得。奧利司他目前是全球唯一的減肥類藥品，是長效和強效的特異性胃腸道脂肪酶抑制劑，它通過與胃和小腸腔內胃脂肪酶和胰脂肪酶的活性絲氨酸部位形成共價鍵使酶失活而發揮治療作用，失活的酶不能將食物中的脂肪，主要是甘油三酯水解為可吸收的游離脂肪酸和單醯基甘油。未消化的甘油三酯不能被身體吸收，從而減少熱量攝入，控制體重。毒三素鏈黴菌，拉丁學名Streptomycestoxytricini,為鏈黴菌科、鏈黴菌屬，孢子絲長，頂端2-3圈緊密大螺旋形。孢子橢圓形至柱形，表面光滑。抑制金黃色葡萄球菌、 枯草桿菌、大腸桿菌、白色假絲酵母、顆粒青黴。現有技術中，發酵生產尼泊司他汀的エ藝存在的生產成本高、發酵效價低的缺點。
發明內容
本發明的目的是克服現有技術的缺陷，提供一種生產成本低、發酵效價高的尼泊司他汀生產エ藝。為解決上述問題，本發明所採用的技術方案是一種尼泊司他汀生產エ藝，其特徵在於包括如下流程A、用發酵液培養基和去離子水配製發酵液所述發酵液培養基採用以下原料製成甘油、黃豆粉、卵磷脂、葵花油、硫酸鎂和碳酸鈣；配製成的發酵液中，上述各原料的百分比含量分別為甘油1% -4.5%、黃豆粉2% -6.5%、卵磷脂1.5% -4%、葵花油5% -12%、硫酸鎂O. 01% -O. 15%、碳酸鈣O. 05% -O. 4% ；B、發酵BI、在發酵液中接種毒三素鏈黴菌菌種，菌種的接種量為發酵液的2% -10%，菌種的細菌濃度為15% -25% ；B2、菌種發酵過程中，發酵液的溫度控制在26°C _29°C，發酵時間為6_8天；B3、菌種發酵過程中，採用酸鹼自動平衡來調節發酵液的pH值，使pH值維持在6. 8 7. 8之間；B4、菌種發酵過程中，通過通氣量和攪拌速度自動調節發酵液的溶氧水平，使溶氧水平維持在35%以上，所述攪拌速度為60-160rpm ；C、發酵產物純化，包括如下步驟Cl、發酵結束後，酸化處理髮酵液，使發酵液的pH值調節為1-6，並採用噴霧乾燥的方法獲得幹菌絲體；
C2、將幹菌絲體加入1-14倍體積的丙酮溶液中，浸泡4 12小時，半框過濾除去菌絲，收集濾液；C3、在濾液補加純水，製得丙酮濃度為35% 55%的丙酮稀釋液；C4、向丙酮稀釋液中加入正庚烷，並進行萃取，萃取後收集正庚烷相；C5、對正庚烷相進行減壓濃縮，至無餾分析出，製得正庚烷濃縮液；C6、向正庚烷濃縮液中加入こ腈，冷卻後，分層除油；C7、收集こ腈相，並對其減壓濃縮，至無餾分析出，製得こ腈濃縮液；CS、用己烷稀釋こ腈濃縮液，然後，上矽膠柱進行吸附； C9、吸附完畢後，用己烷洗脫，收集洗脫液；C10、對洗脫液進行減壓濃縮，至無餾分析出；Cl I、二次結晶，收集晶體，減壓濃縮，製得高純度尼泊司他汀。進一步地說所述尼泊司他汀發酵液培養基中還包含有適量的微量元素。所述B3步驟中，採用氫氧化鈉和鹽酸對發酵液的pH值進行自動平衡調節。所述Cl步驟中，採用25% -45%的硫酸對發酵液進行酸處理。所述發酵產物純化流程中所使用的正庚烷、己烷、丙酮、こ腈均為エ業級，含量均大於95%。所述C8步驟中，所述矽膠柱採用的矽膠為80-120目。與現有技術相比，本發明以黃豆粉、葵花油、甘油等作為發酵培養基的主要氮源和碳源，並通過調控發酵エ藝及培養基組份，採用毒三素鏈黴菌經過發酵、純化、精製而獲得高純度尼泊司他汀，使尼泊司他汀的生產成本大大降低，發酵效價提高，解決了現有技術中存在的生產成本高、發酵效價低的缺點。下面結合說明書附圖
和具體實施方式
對本發明做進ー步的描述。說明書附I是本發明的實施例I所述生產エ藝的產物尼泊司他汀含量HPLC圖；圖2是本發明的實施例2所述生產エ藝的產物尼泊司他汀含量HPLC圖；圖3是本發明的實施例3所述生產エ藝的產物尼泊司他汀含量HPLC圖。
具體實施例方式以20L發酵罐為例，對本發明所述的尼泊司他汀生產エ藝作進ー步描述。實施例I :一種尼泊司他汀生產エ藝，包括如下流程A、把發酵液培養基和去離子水投入20L發酵罐配製20L發酵液所述發酵液培養基採用以下原料製成甘油、黃豆粉、卵磷脂、葵花油、硫酸鎂、碳酸鈣和微量元素；配製成的發酵液中，上述各原料的百分比含量分別為甘油1%、黃豆粉2%、卵磷脂I. 5%、葵花油5%、硫酸鎂O. 01%、碳酸I丐O. 05%,微量元素適量,餘量為去離子水。B、發酵BI、對配製好發酵液進行滅菌，然後在發酵液中接種毒三素鏈黴菌菌種，菌種的接種量為發酵液的5%，菌種的細菌濃度為15% ；
B2、菌種發酵過程中，發酵液的溫度控制在27°C ±1°C，發酵時間為8天；B3、菌種發酵過程中，採用氫氧化鈉和鹽酸自動平衡來調節發酵液的pH值，使pH值維持在7. O之間；B4、菌種發酵過程中，通過通氣量和攪拌速度自動調節發酵液的溶氧水平，使溶氧水平維持在50%，所述攪拌速度為90rpm ；C、發酵產物純化，包括如下步驟Cl、發酵結束後，用25% -45%的硫酸酸化處理髮酵液，使發酵液的pH值調節為4，並採用噴霧乾燥的方法獲得幹菌絲體；C2、將幹菌絲體加入8倍體積的丙酮溶液中，浸泡10小時，半框過濾除去菌絲，收 集濾液；C3、在濾液補加純水，製得丙酮濃度為35%的丙酮稀釋液；C4、向丙酮稀釋液中加入正庚烷，並進行萃取，萃取後收集正庚烷相；C5、對正庚烷相進行減壓濃縮，至無餾分析出，製得正庚烷濃縮液；C6、向正庚烷濃縮液中加入こ腈，冷卻後，分層除油；C7、收集こ腈相，並對其減壓濃縮，至無餾分析出，製得こ腈濃縮液；CS、用己烷稀釋こ腈濃縮液，然後，上矽膠柱進行吸附；C9、吸附完畢後，用己烷洗脫，收集洗脫液；C10、對洗脫液進行減壓濃縮，至無餾分析出；C11、二次結晶，收集晶體，減壓濃縮，製得高純度尼泊司他汀，菌體得率為300克(菌體溼重)/升(發酵液)，尼泊司他汀效價為IlSOOmg/升，純度為96.4%，如圖I所示。實施例2 一種尼泊司他汀生產エ藝，包括如下流程A、把發酵液培養基和去離子水投入20L發酵罐配製20L發酵液所述發酵液培養基採用以下原料製成甘油、黃豆粉、卵磷脂、葵花油、硫酸鎂、碳酸鈣和微量元素；配製成的發酵液中，上述各原料的百分比含量分別為甘油3%、黃豆粉4. 5%、卵磷脂3%、葵花油8%、硫酸鎂O. 05%、碳酸I丐O. 2%,微量元素適量,餘量為去離子水。B、發酵BI、對配製好發酵液進行滅菌，然後在發酵液中接種毒三素鏈黴菌菌種，菌種的接種量為發酵液的8%，菌種的細菌濃度為20% ；B2、菌種發酵過程中，發酵液的溫度控制在27°C ±1°C，發酵時間為7天；B3、菌種發酵過程中，採用氫氧化鈉和鹽酸自動平衡來調節發酵液的pH值，使pH值維持在7. O之間；B4、菌種發酵過程中，通過通氣量和攪拌速度自動調節發酵液的溶氧水平，使溶氧水平維持在45%，所述攪拌速度為IOOrpm ；C、發酵產物純化，包括如下步驟Cl、發酵結束後，用25% -45%的硫酸酸化處理髮酵液，使發酵液的pH值調節為4，並採用噴霧乾燥的方法獲得幹菌絲體；C2、將幹菌絲體加入10倍體積的丙酮溶液中，浸泡8小時，半框過濾除去菌絲，收集濾液；C3、在濾液補加純水，製得丙酮濃度為45%的丙酮稀釋液；C4、向丙酮稀釋液中加入正庚烷，並進行萃取，萃取後收集正庚烷相；C5、對正庚烷相進行減壓濃縮，至無餾分析出，製得正庚烷濃縮液；C6、向正庚烷濃縮液中加入こ腈，冷卻後，分層除油；C7、收集こ腈相，並對其減壓濃縮，至無餾分析出，製得こ腈濃縮液；CS、用己烷稀釋こ腈濃縮液，然後，上矽膠柱進行吸附；C9、吸附完畢後，用己烷洗脫，收集洗脫液；
C10、對洗脫液進行減壓濃縮，至無餾分析出；C11、二次結晶，收集晶體，減壓濃縮，製得高純度尼泊司他汀，菌體得率為320克(菌體溼重)/升(發酵液)，尼泊司他汀效價為12400mg/升，純度為97. 7%，如圖2所示。實施例3:一種尼泊司他汀生產エ藝，包括如下流程A、把發酵液培養基和去離子水投入20L發酵罐配製20L發酵液所述發酵液培養基採用以下原料製成甘油、黃豆粉、卵磷脂、葵花油、硫酸鎂、碳酸鈣和微量元素；配製成的發酵液中，上述各原料的百分比含量分別為甘油4. 5%、黃豆粉6. 5%、卵磷脂4%、葵花油12%、硫酸鎂O. 15%、碳酸I丐O. 4%,微量元素適量,餘量為去離子水。B、發酵BI、對配製好發酵液進行滅菌，然後在發酵液中接種毒三素鏈黴菌菌種，菌種的接種量為發酵液的10%，菌種的細菌濃度為20% B2、菌種發酵過程中，發酵液的溫度控制在27°C ±1°C，發酵時間為8天B3、菌種發酵過程中，採用氫氧化鈉和鹽酸自動平衡來調節發酵液的pH值，使pH值維持在7. O之間；B4、菌種發酵過程中，通過通氣量和攪拌速度自動調節發酵液的溶氧水平，使溶氧水平維持在50%，所述攪拌速度為120rpm ；C、發酵產物純化，包括如下步驟 Cl、發酵結束後，用25% -45%的硫酸酸化處理髮酵液，使發酵液的pH值調節為I，並採用噴霧乾燥的方法獲得幹菌絲體；C2、將幹菌絲體加入14倍體積的丙酮溶液中，浸泡12小時，半框過濾除去菌絲，收集濾液；C3、在濾液補加純水，製得丙酮濃度為55%的丙酮稀釋液；C4、向丙酮稀釋液中加入正庚烷，並進行萃取，萃取後收集正庚烷相；C5、對正庚烷相進行減壓濃縮，至無餾分析出，製得正庚烷濃縮液；C6、向正庚烷濃縮液中加入こ腈，冷卻後，分層除油；C7、收集こ腈相，並對其減壓濃縮，至無餾分析出，製得こ腈濃縮液；CS、用己烷稀釋こ腈濃縮液，然後，上矽膠柱進行吸附；C9、吸附完畢後，用己烷洗脫，收集洗脫液；C10、對洗脫液進行減壓濃縮，至無餾分析出；
C11、二次結晶，收集晶體，減壓濃縮，製得高純度尼泊司他汀，菌體得率為350克(菌體溼重)/升(發酵液)，尼泊司他汀效價為14300mg/升，純度為98. 2%，如圖3所示。本發明所述發酵液培養基的篩選，是在首先了解單個因素對毒三素鏈黴菌生長及尼泊司他汀表達的影響後，再通過正交實驗綜合考慮各因素之間的交互作用，經統計學分析後確定發酵配方，同時進行發酵エ藝檢驗和優選，從而選定發酵エ藝，通過一系列純化工藝檢驗與優化，從而確定了最終的純化工藝。綜上所述，本發明具有如下特點I、菌體得率高，可達到250 350克(菌體溼重)/升(發酵液)；2、尼泊司他汀表達量高(包括相對含量和絕對含量)，其表達量可達到8000mg/升到 14000mg/ 升；3、發酵時間短，一般6天即可達到最大發酵產量的90% ； 4、發酵成本低，比當前成本低15% ；5、分離エ藝精密，獲得產物純度高，獲得的尼泊司他汀含量可以達到98%。
權利要求
1.一種尼泊司他汀生產工藝，其特徵在於包括如下流程 (A)用發酵液培養基和去離子水配製發酵液 所述發酵液培養基採用以下原料製成甘油、黃豆粉、卵磷脂、葵花油、硫酸鎂和碳酸鈣；配製成的發酵液中，上述各原料的百分比含量分別為甘油1% _4.5%、黃豆粉2% -6.5%、卵磷脂1.5% _4%、葵花油5% -12%、硫酸鎂O. 01% -O. 15%、碳酸鈣O.05% -O. 4% ； (B)發酵 (BI)在發酵液中接種毒三素鏈黴菌菌種,菌種的接種量為發酵液的2% -10%，菌種的細菌濃度為15% -25% ； (B2)菌種發酵過程中，發酵液的溫度控制在26°C _29°C，發酵時間為6_8天； (B3)菌種發酵過程中，採用酸鹼自動平衡來調節發酵液的pH值，使pH值維持在6. 8 ·7.8之間； (B4)菌種發酵過程中，通過通氣量和攪拌速度自動調節發酵液的溶氧水平，使溶氧水平維持在35%以上，所述攪拌速度為60-160rpm ； (C)發酵產物純化，包括如下步驟 (Cl)發酵結束後，酸化處理髮酵液，使發酵液的pH值調節為1-6，並採用噴霧乾燥的方法獲得幹菌絲體； (C2)將幹菌絲體加入1-14倍體積的丙酮溶液中，浸泡4 12小時，半框過濾除去菌絲，收集濾液； (C3)在濾液補加純水，製得丙酮濃度為35% 55%的丙酮稀釋液； (C4)向丙酮稀釋液中加入正庚烷，並進行萃取，萃取後收集正庚烷相； (C5)對正庚烷相進行減壓濃縮，至無餾分析出，製得正庚烷濃縮液； (C6)向正庚烷濃縮液中加入乙腈，冷卻後，分層除油； (C7)收集乙腈相，並對其減壓濃縮，至無餾分析出，製得乙腈濃縮液； (CS)用己烷稀釋乙腈濃縮液，然後，上矽膠柱進行吸附； (C9)吸附完畢後，用己烷洗脫，收集洗脫液； (ClO)對洗脫液進行減壓濃縮，至無餾分析出； (Cll) 二次結晶，收集晶體，減壓濃縮，製得高純度尼泊司他汀。
2.根據權利要求I所述的尼泊司他汀生產工藝，其特徵在於所述尼泊司他汀發酵液培養基中還包含有適量的微量元素。
3.根據權利要求I所述的尼泊司他汀生產工藝，其特徵在於所述(B3)步驟中，採用氫氧化鈉和鹽酸對發酵液的PH值進行自動平衡調節。
4.根據權利要求I所述的尼泊司他汀生產工藝，其特徵在於所述(Cl)步驟中，採用25 % -45 %的硫酸對發酵液進行酸處理。
5.根據權利要求I所述的尼泊司他汀生產工藝，其特徵在於所述發酵產物純化流程中所使用的正庚烷、己烷、丙酮、乙腈均為工業級，含量均大於95 %。
6.根據權利要求I所述的尼泊司他汀生產工藝，其特徵在於所述(CS)步驟中，所述矽膠柱採用的矽膠為80-120目。
全文摘要
本發明公開了一種尼泊司他汀生產工藝，包括如下流程A、用發酵液培養基和去離子水配製發酵液；B、發酵；C、發酵產物純化；所述發酵液培養基採用以下原料製成甘油、黃豆粉、卵磷脂、葵花油、硫酸鎂和碳酸鈣；配製成的發酵液中，上述各原料的百分比含量分別為甘油1％-4.5％、黃豆粉2％-6.5％、卵磷脂1.5％-4％、葵花油5％-12％、硫酸鎂0.01％-0.15％、碳酸鈣0.05％-0.4％。本發明以黃豆粉、葵花油、甘油等作為發酵培養基的主要氮源和碳源，並通過調控發酵工藝及培養基組份，採用毒三素鏈黴菌經過發酵、純化、精製而獲得高純度尼泊司他汀，使尼泊司他汀的生產成本大大降低，發酵效價提高，解決了現有技術中存在的生產成本高、發酵效價低的缺點。
文檔編號C12P17/02GK102827892SQ20121034771
公開日2012年12月19日 申請日期2012年9月5日 優先權日2012年9月5日
發明者李海霞, 朱善超 申請人:李海霞