不含異源成分的gM－陰性EHV突變體的製作方法

2023-10-07 22:56:34

專利名稱：不含異源成分的gM－陰性EHV突變體的製作方法
技術領域：
本發明涉及動物健康領域，特別是涉及編碼gM蛋白的基因缺失且不含異源成分(heterologous element)的馬皰疹病毒(Equine Herpes Viruse)(EHV)。本發明進一步涉及包含所說病毒的藥用組合物及其應用，以及預防和治療EHV感染的方法。本發明也涉及包含EHV-1和EHV-4病毒的藥用組合物，其中編碼gM蛋白的基因缺失，並且不含有異源成分。
背景技術：
馬皰疹病毒1(EHV-1)，作為α皰疹病毒亞科(Alphaherpesvirinae)的成員，是馬中病毒引起流產的主要原因，它也可引起呼吸和神經系統疾病。馬皰疹病毒4(EHV-4)也可引起呼吸系統疾病，流產，或神經系統疾病。已經鑑定出了兩種類(EHV-1菌株Ab4p；EHV-4菌株NS80567)的DNA全序列(Telford，E.A.R.et al.，1992；Telford，E.A.R.et al.，1998)。然而，只鑑定出了少數與EHV毒力和免疫原特性相關的基因和基因產品。
皰疹病毒的糖蛋白，在病毒感染初期階段，病毒粒子的細胞釋放階段，以及病毒粒子通過與相鄰細胞融合而進行細胞至細胞的直接擴散階段，都扮演了至關重要的作用。迄今為止，已經鑑定出了11種1型單純皰疹病毒(HSV-1)編碼的糖蛋白，它們命名為gB，gC，gD，gE，gG，gH，g1，gJ，gK，gL和gM。缺失了gC，gE，gG，g1，gJ，和gM的HSV-1突變體是活的，顯示這些基因在培養細胞中對病毒複製是可有可無的。HSV-1和馬皰疹病毒1的核苷酸序列比較顯示，所有的已知HSV-1糖蛋白在EHV-1中都是保守的。按照當前的命名法，這些糖蛋白被以它們的HSV-1同源類似物的名字命名。已知EHV-1的gC，gE和g1不是在細胞培養物中生長所必需的，而gB和gD則是病毒在培養細胞中生長所必需的。其它EHV-1糖蛋白對在培養細胞中病毒複製所起的作用是未知的(Flowers，C.C.et al.，1992)。轉錄和蛋白分析顯示，糖蛋白gB，gC，gD，gG，gH和gK可在EHV-1感染的細胞中表達。糖蛋白gM(由基因UL10表達[Baines，J.D.et al.，1991；Baines，J.D.et al.，1993])是唯一報導的非必要糖蛋白，其在所有的皰疹病毒亞家族中是保守的，並且對於人、小鼠巨細胞病毒，以及γ皰疹病毒亞科成員EHV-2，松鼠猴皰疹病毒(herpesvirus saimiri)，以及EB病毒(Epstein-Barr)有記載。與許多皰疹病毒糖蛋白類似，HSV-1 gM在病毒粒子和感染細胞的膜上出現。只缺失gM的HSV-1突變體在細胞培養系統中的生長滴度，與野生型病毒相比，大約減少了10倍，而且在小鼠模型中顯示出了減少的毒力(Baines，J.D.et al.，1991；MacLean，C.A.et al.，1993)。EHV-1 gM同源類似物(gp21/22a；本文中稱為EHV-1 gM)第一次是被Allen和Yeargan(Allen，G.P.et al，1987)所記載，認為其是病毒包膜的主要成分。進一步的研究顯示，基因52是與HSV-1 UL10同源的基因，編碼450個胺基酸的EHV-1 gM多肽(Pilling，A.et al.，1994；Telford，E.A.R.et al.，1992)。EHV-1 gM是一個多聚體疏水蛋白，包含有8個預測的跨膜區，據報導在感染細胞和純化病毒粒子中出現，是Mr為45,000的蛋白(Pilling，A.et al.，1994；Telford，E.A.R.et al.，1992)。
為了控制EHV-1的病毒感染，可以採取兩種不同的方法。第一種，開發修飾的活疫苗(MLVs)，包括廣泛在歐洲和美國中使用的RacH株(Mayr，A.etal.，1968；Hubert，P.H.et al.，1996)。第二種，滅活疫苗，以及基於重組表達的病毒糖蛋白亞單位疫苗，如糖蛋白(g)B，C，D，和H，它們可對接下來在模型鼠中EHV-1的感染接種產生部分的保護作用。包含所說糖蛋白的亞單位疫苗，如gB，gC，gD，和gH，只有很弱的抗重複感染的保護作用(Awan et al.，1990，Osterrieder et al.，1995，Tewari et al.，1994，Stokes et al，1996)。
本發明要解決的技術問題是，提供一種比現有技術疫苗能更好抗EHV感染的改良疫苗。


圖1不含外源序列的gM缺失EHV-1 RacH病毒(HΔgM-w)的構建此圖顯示了病毒的基因圖，和用於構建HΔgM-w的質粒。通過插入大腸桿菌lacZ(HΔgM-lacZ)表達框或綠色螢光蛋白(GFP)表達框(HΔgM-GFP)，首先構建「第一代」HΔgM病毒。圖A顯示了EHV-1 RacH株的BamH1圖譜，包含gM-ORF的BamHI-HindIII片段在圖B中被放大了，顯示出了該區域的基因組結構。gM缺失病毒-HΔgM-GFP，攜帶有取代了EHV-1 gM基因主要部分的GFP表達框。圖C記載了在Southern印跡中使用的GFP特異性探針。質粒pBH3.1攜帶有EHV-1 BamHI-HindIII目標片段，它用於構建質粒pXuBaxA。HΔgM-GFP的DNA與質粒pXuBaxA共轉染，得到HΔgM-w(圖D)。
限制性位點BamH1-B，Hind111-H，Sph1-S，Hinc11-Hc，Apa1-A，Pst1-P圖2不含外源序列gM缺失的EHV-1病毒(HΔgM-w)的Southern印跡將RacH毒株，HΔgM-GFP，以及HΔgM-w的DNA用BamH1，HindIII，或Pst1裂解，然後用GFP-特異性探針(GFP)或pBH3.1的EHV-1BamHI-HindIII片段進行分析(pBH3.1)。使用CSPD藉助化學發光檢測DNA雜交體。分子量標記蛋白的分子量大小(Biolabs)在左側空白處以kbp大小給出。在箭頭所指處，特異性雜交體幾乎是不可見的。
圖3不含外源序列的gM缺失的EHV-4病毒的構建(E4ΔgM-w)本圖中，描述了EHV-4 NS80567株的BamH1圖譜。在放大圖中，BamH1-e片段包括gM和鄰近的ORFs(A)。圖B描述了質粒構建體和引物位點。質粒pgM4GFP+用於構建E4ΔgM-GFP，即GFP是陽性且gM是陰性的EHV-4(B，C)。將E4ΔgM-GFP與包含3.109bp大小EHV-4序列、包含gM-ORF的質粒pgM4R(B)進行DNA重組，可獲得E4RgM，即gM修復的(gM-repaired)EHV-4(A)。或者將E4ΔgM-GFP與質粒pgM4w(B)進行DNA重組，可獲得E4ΔgM-w，即GFP和gM都是陰性的EHV-4(D)。
限制性位點BamH1-B，Pst1-P，EcoRI-E，Sa11-Sa，Mlu1-M，Asn1-As，EcoRV-EV圖4不含外源序列的gM缺失的EHV-4病毒的Southern印跡(E4ΔgM-w)如圖所示，將EHV-4，E4RgM，E4ΔgM-w和E4ΔgM-GFP的DNA用Pst1，EcoRV或HindIII裂解，獲得的DNA片段印跡至尼龍膜上。將平行膜與GFP特異性序列雜交，或者將平行膜與稱為gM3.1的探針雜交，gM3.1探針包含來自質粒pgM4R(圖3)的EHV-4特異性序列。使用CSPD通過化學發光檢測DNA雜交體。分子量標記蛋白的分子量大小(Biolabs)以kbp給出。
圖5gM缺失的EHV-4病毒，即E4ΔgM-w的生長特性。
細胞用列在圖框中的MOI為2的不同病毒感染。病毒生長動力學以病毒滴定相對於圖中所示的時間點給出，所述滴定以感染的細胞上清液中的病毒濃度確定(細胞外活性)，或者以感染細胞內的病毒濃度確定(細胞內活性)。圖中顯示的是兩次試驗的平均值，標準誤差用誤差線(error bar)表示。
圖6E4ΔgM-w的空斑大小
Vero或Vero-gM細胞在6孔板上分別用50PFU的EHV-4，E4RgM，E4ΔgM-GFP或E4ΔgM-w感染。確定了150個不同空斑的最大直徑，其空斑大小的平均值以相對於野生型空斑大小的百分數給出，野生型的空斑大小設置為100％。標準誤差用誤差線表示(A)。空斑在平板接種(p.i.)第4天用間接免疫螢光技術(抗-gD Mab 20C4，11000)進行染色，用Axioscope(x100，Zeiss，Germany)進行分析。圖片進行掃描和數據處理(B)。
圖7EHV-4病毒侵入Vero細胞EHV-4，E4RgM，E4ΔgM-w和E4ΔgM-GFP在非補足Vero細胞(noncomplementing Vero cell)(A)或補足Vero-gM細胞(Complementing Vero-gMcell)(B)的情況下，可穿入Vero細胞。在給定的時間點，穿入效率是以檸檬酸鹽處理後相對於空白處理所存在的空斑數量的百分數來確定的。圖中給出了兩個次試驗的平均值。以誤差線表示標準誤差。
圖8EHV-4基因組內的PCR引物序列和擴增位點表示限制性酶識別位點的序列以粗體顯示，列出了其相應的限制性酶。將PCR產物插入至給定的載體，可獲得表中所示的質粒pCgM4，pgM4R，pgM4Del1或pgM4Del2。片段在EHV-4基因組中的位置，是相對於Telford等(1998)所確定的序列給出的。
圖9馬血清的Western印跡分析將表達EHV-1 gM的ccgM細胞系和Rk13細胞裂解，在56℃加熱2min(1，2)，或者在95℃加熱5min(3)(gM是高度疏水的，已知會沸騰凝集以致其不能再進入分離膠)。同樣的印跡與各種馬血清(1∶3000)或抗gM的兔血清溫育。箭頭指沸騰或未沸騰樣品中的gM特異性反應。給出了血清的中和試驗滴定(NT)，血清是來自病毒學診斷單位。
圖10(A)用抗EHV-1 gM的多克隆抗體，對EHV-1 gM和EHV-4 gM進行比較。將細胞用圖中顯示的病毒感染(MOI為0.5-1)，在平板接種(p.i.)的既定時刻製備細胞裂解物。將EHV-1或EHV-4病毒粒子通過多次的葡萄糖密度梯度(sucrose cussion)(30％)離心純化，再重懸於PBS溶液中。將樣品與含有5％2-巰基乙醇的緩衝液混合，接著加熱至99℃5min，或者將其放置在4℃。蛋白用SDS-10％PAGE分離，印跡至硝基纖維素濾膜上。使用抗兔免疫球蛋白G(IgG)過氧化物酶偶聯物(Sigma)顯示抗體的結合，接著用ECLTM檢測(Pharmacia-Amersham)。
(B)從感染了EHV-4，E4ΔgM-w，E4ΔgM-GFP，或E4RgM的Edmin337細胞中純化病毒粒子，將病毒粒子進行如圖A所示的Western印跡分析。接著，用抗EHV-1 gB的單克隆抗體3F6或抗EHV-1 gM的多克隆抗體，對病毒粒子的gB反應性與gM反應性進行比較。

發明內容
在說明書中使用的術語定義在描述本發明的具體內容之前，必須注意到，如果上下文中沒有明確地相反指示，在本文及其附屬的權利要求中使用的單數形式″a″，″an″，″the″，都包括複數內容。例如，「EHV病毒」是指包括多種這樣的EHV病毒，即也包括像EHV1，4以及其它種類的所有亞種(subspecies)；「細胞」是指一種或多種細胞及本領域技術人員已知的各種等同物，依此類推。如果沒有相反的解釋，本文中使用的所有科技術語，都與本發明所屬領域普通技術人員通常理解的意思相同。雖然與本文中描述的材料和方法相似或等同的任何材料和方法，都能用在本發明的實施例或試驗中，但是，本文中描述了優選的方法，設備，及材料。在與本發明相關的各種出版物中，已經報導了各種細胞系，載體，及方法。為了使所述細胞系，載體，及方法能充分地記載和公開，本文中提到的所有公開出版物，都將併入本文作為參考。此不應解釋為承認，由於在前發明，本發明沒有權利提前上述公開。
本文中使用的術語「EHV」是指，所有的馬皰疹病毒，例如α皰疹病毒亞科家族中的EHV-1種，EHV-4種。術語EH-病毒，EH病毒，EHV病毒，EHV-病毒，以及EHV都是指馬皰疹病毒。
毒力本文中使用的「毒力(virulence)」是指，EH-病毒能在靶宿主中繁殖(如馬)，可有效引起以呼吸道症狀、流產、或神經紊亂為特徵的亞臨床或臨床疾病的能力。有關毒性EHV的例子是，可引起嚴重臨床症狀的野生型病毒。有關毒力因子的例子是，血紅細胞裂解素(可裂解血紅細胞)，粘附素(病原體通過粘附素能粘附至宿主細胞，然後開始繁殖入侵)。更具體地，本文中的「毒力」是指gM基因產物-病毒包膜的主要成分，它能使病毒穿入至宿主細胞，並且可介導病毒在細胞至細胞間的傳播。
減毒本文中使用的「減毒的EH-病毒」是指，不引起EHV相關亞臨床或臨床疾病但有感染性的EHV。特別地，根據本發明，這樣的減毒EH病毒是可複製但不能表達gM的EHV。
根據本發明，EH-病毒的「功能變異體」是指，有與本發明EHV基本相似生物活性(功能或結構)的EHV病毒。術語「功能變異體」也包括，「片段」、「功能變異體」、「基於核酸密碼子簡併的變異體」、或「化學衍生物」。這樣的「功能變異體」例如，可以進行一個或數個核酸的取代，缺失或插入。所說的取代，缺失或插入，可以佔整個序列的10％。所說的功能變異體至少部分保持了其生物活性，如與感染性的克隆或疫苗株有相同的功能，或者甚至表現出了提高的生物活性。
「基於遺傳密碼子簡併的變異體」是指，由於某個胺基酸可以由多個不同的核酸三聯密碼子編碼而導致遺傳密碼改性的變異體。所說的變異體至少部分保留了其生物活性，或者甚至表現出了提高的生物活性。
「融合分子」是可與，例如報告分子如輻射標記分子，化學分子如螢光標記分子，或本領域已知的其它任何分子，融合的本發明中的DNA分子或感染性的EHV病毒。
在本文中，本發明的「化學衍生物」是指，化學修飾或含有添加化學部分的本發明中的DNA分子或感染性的EHV克隆，其中添加的化學部分正常情況下不是該分子的一部分。這樣的修飾或添加部分可提高分子的溶解性，吸收性，生物半衰期等等。
如果兩個分子有大體上相似的核酸序列或生物活性，那麼這兩個分子是「基本相同的」。因此，如果兩個分子有相似的活性，那麼它們被認為是本文所定義的變異體，即使它們的核酸序列不相同；有相似核苷酸序列的兩個分子也認為是本發明所定義的變異體，即使它們的生物活性不同。
本文中使用的術語「疫苗」是指，包含至少一種免疫活性成分和可以添加但不是必需添加的一種或多種可添加成分的藥用組合物。免疫活性成分可導致動物的免疫應答，而可添加成分則可增強所述活性成分的免疫活性。疫苗可以進一步包括藥用組合物中通常使用的成分。疫苗的免疫活性成分可以包括，以原始形式存在的完全病毒粒子，或稱為修飾活疫苗(MLV)中的減毒粒子，或稱為滅活疫苗(KV)通過適當方法將其滅活的滅活粒子。另一形式中，疫苗免疫活性成分可以包括，所述生物體的合適成分(亞單位疫苗)。其中，這些成分，可以通過破壞整個病毒粒子或含有上述粒子的生長培養基，以及進行可產生目的結構的可選擇的後續純化步驟而獲得；也可以通過，藉助基於例如細菌，昆蟲，哺乳動物，或其它種類的合適系統、包括合適操作的化學合成，加上可選擇的後續分離和純化步驟而獲得；還可以通過使用合適的藥用組合物(多核苷酸疫苗)，藉助遺傳物質的直接整合，將上述合成過程導入至需要疫苗的動物。疫苗可以包括，一種或同時含有多於一種的上述成分。
本文中理解的術語「疫苗」，可以是包括抗原物質的獸用疫苗，給藥該疫苗可產生針對EHV所引發疾病的特異性主動免疫應答。本發明的EHV疫苗可賦予主動免疫，它可以通過母體針對疫苗所包含的免疫原的抗體被動轉移至後代，有時也可針對與抗原相關的生物體。
增強免疫應答的其它成分通常是指，佐劑如氫氧化鋁，礦物質，或其它油脂類；輔助分子如但不限於幹擾素，白介素，或生長因子，其中輔助分子可被加入至疫苗，或通過上述添加成分分別誘導後由機體產生。
「疫苗組合物或藥用組合物」，基本由一種或多種成分構成。其中，所述成分能改變所給藥的生物體或存在於生物體的有機體的生理功能，如免疫功能。術語「疫苗組合物或藥用組合物」，包括但不限於抗生素，抗寄生物藥劑，以及通常用於達到某種其它目標的組分，例如但不限於，可加工特性(processing trait)，無菌性(sterility)，穩定性，經由腸道或胃腸道途徑，如口腔，鼻內，靜脈內，肌肉內，皮下，皮膚內，或其它合適途徑給藥的可行性，給藥後的耐受性，以及緩釋特性。
發明的公開通過說明書和以權利要求表示技術方案的公開，可以解決上述的技術問題。
本發明克服了本領域的難點和偏見，即不能產生不含外源序列的馬皰疹病毒。通過使用本發明的方法，可以產生用於疫苗的高質量EH病毒。蛋白gM的中間編碼序列被去除，殘留gM的羧基末端序列而不是氨基末端序列在一個不同的可讀框中。由於編碼必需蛋白UL9類似物的相鄰基因(基因53)，其方向和其與編碼蛋白gM的基因位置重疊，所以這就要求編碼gM基因的一小部分核酸序列必須保留，以允許基因53表達，從而保留了病毒的生存能力。因此，本發明相關EHV的特徵在於，編碼蛋白gM的基因被去除了，而編碼UL9類似物的基因表達(基因53)不受影響。術語「不受影響」不涉及UL9的某些數量或質量特性，而只是簡單地意味著基因表達不受影響，只要所述蛋白可由病毒表達並且能基本足量表達可使病毒生存。
本申請的發明人克服了現有技術中的主要難點，滿足了本領域長期以來對包含重組馬皰疹病毒4疫苗的迫切需求。本發明的EHV-1，EHV-4病毒可以用於有益目的，如用作疫苗。
因此，在第一個重要的具體實施方案中，本發明涉及一種馬皰疹病毒(EHV)，其中編碼蛋白gM的基因，及蛋白gM本身是缺失的，並且其不含異源成分。「不含異源成分」是指，外源序列，即非EHV序列，如編碼lacZ或GFP的可讀框，不出現在本發明所述病毒的編碼序列中(稱為「純克隆(white clone)」)。因此，本發明的EHV完全由EHV序列編碼。本發明的EHV不含細菌成分或編碼所述細菌成分的核酸。進一步說，去除了幾乎整個gM蛋白編碼序列，以及其編碼的所述gM蛋白。因此，優選地，本發明所述EHV其特徵在於，蛋白gM由於編碼蛋白gM的基因去除而是缺失的。然而，如上所述，「編碼蛋白gM基因是缺失的」也需要少量gM序列保留，以使至少重疊的基因53序列仍然存在。其它的gM序列可以被去除(參見下文)。這可以通過分子生物技術全部完成(參見下文)，以產生重組EHV。
標記分子lacZ可用於成功去除EHV-1或4的gM基因，但是不會導致本發明病毒的成功產生(參見實施例1，2)。發明人由此發明了一種獲得所述病毒的創造性方法。通過插入含有GFP標記分子的可讀框，使gM基因去除，由此構建了EH病毒。令人驚奇是，本方法很容易區分原始輸入的病毒(inputvirus)(綠色螢光空斑)和新重組的病毒(非螢光空斑)。
優選地，EHV可以通過以下步驟獲得a)分離野生型EHV；b)任選與側翼序列，構建編碼EHV gM基因的質粒；c)產生表達gM或部分gM的補足細胞系(complementing cell line)；d)將EHV核酸與編碼gM的質粒共轉染至步驟b)的補足細胞系，其中質粒中gM基因被GFP編碼框插入而斷開，由此，獲得了攜帶GFP編碼框插入至其gM編碼序列的EH病毒；e)去除GFP編碼框；f)篩選GFP編碼框被成功去除的EHV克隆。
″lacZ″為編碼β半乳糖苷酶的基因，這是本領域技術人員已知的。本發明中，「GFP」是指由生物發光水母產生的綠色螢光蛋白(GFP)(Chalfie et al.，1994)。
「補足細胞系」是指將通常不在細胞系基因組中存在的基因導入其中，並且該基因能在其中組成性表達的細胞系。有用的細胞系包括但不限於，兔腎細胞系Rk13，細胞系cc(Seyboldt et al.，2000)，或Vero細胞系(ATCC編號#CRL-1586)，如克隆1008，其也在實施例1和2中公開了，以及本領域技術人員已知的任何其它細胞系。通常，補足細胞系被選擇做為用於表達外源蛋白的細胞克隆。本發明的細胞系可表達病毒的缺失基因，能彌補病毒缺陷，使基因缺失的病毒能夠生長。
限制性酶，DNA分子連接，PCR，轉染等等，其標準的生物學使用方法，是本領域技術人員已知的(可參見例如Sambrook et al.(1989).MolecularCloningA Laboratory Manual，2nd ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York.)。
優選地，本發明EHV的特徵在於，其是EHV-1。更優選地，本發明EHV-1的特徵在於，缺失了gM可讀框1332個bp中的850-1100個bp。更優選地，本發明EHV-4的特徵在於，缺失了gM可讀框中的900-1000個bp。同樣更優選地，本發明EHV-1的特徵在於，缺失了gM可讀框中的960-970個bp(960，961，962，963，964，965，966，967，968，969或970個bp)。最優選地，本發明EHV-1的特徵在於，缺失了gM可讀框中的962個bp。
更優選地，本發明EHV-1的特徵在於，除了編碼gM的C末端部分的編碼序列150-200個鹼基對(bp)，以及編碼gM的N末端部分的編碼序列150-250個bp不缺失以外，其它gM編碼序列缺失。在本發明較優選的實施方案中，僅僅只保留編碼gM的C末端部分的序列中93118-93267至93118-93317位的核苷酸和編碼gM的N末端部分的序列中94223-94472至94323-94472位的核苷酸，而其它gM編碼序列缺失。因此，更優選地，本發明EHV-1的特徵在於，缺失93268-93318至94222-94322位的核苷酸(編碼gM核心部分，核苷酸的位置根據Telford，1992計數)。在給定範圍內，可以缺失任意數量的核苷酸。因此，本發明中，缺失可以從不低於第93268位核苷酸的位置開始，而不是必須從93318位核苷酸開始。缺失可以早在94222位終止，但不晚於94322的位置。因此，本發明優選EHV-1的特徵在於，缺失對應於Telford位置(1992)的gM編碼序列中的93268至94322位核苷酸。上述缺失序列的任意組合，也在本發明範圍之內，例如93272至94312，93300至94300，等等。
更優選地，本發明EHV-1的特徵在於，除了編碼gM的C末端部分的編碼序列160-190個鹼基對(bp)，以及編碼gM的N末端部分的編碼序列190-220個bp不缺失以外，其它gM編碼序列缺失。在本發明較優選的實施方案中，僅僅只保留編碼gM的C末端部分的編碼序列中93118-93277至93118-93307位的核苷酸和編碼gM的N末端部分的編碼序列中94253-94472至94283-94472位的核苷酸，而其它gM編碼序列缺失。因此，更優選地，本發明EHV-1的特徵在於，缺失93278-93308至94252-94282位的核苷酸(編碼gM核心部分，根據Telford，1992確定核苷酸序號)。
更優選地，本發明EHV-1的特徵在於，除了編碼gM的C末端部分的編碼序列180-190(180，181，182，183，184，185，186，187，188，189，190)個鹼基對(bp)，以及編碼gM的N末端部分的編碼序列200-210(200，201，202，203，204，205，206，207，208，209，210)個bp不缺失以外，其它gM編碼序列缺失。在本發明較優選的實施方案中，僅僅保留編碼gM的C末端部分編碼序列中93118-93297至93118-93307(93297，93298，93299，93300，93301，93302，93303，93304，93305，93306，93307)位的核苷酸和gM基因N末端部分編碼序列中94263-94472至94273-94472(94263，94264，94265，94266，94267，94268，94269，94270，94271，94272，94273)位的核苷酸，而其它gM編碼序列缺失。因此，更優選地，本發明EHV-1的特徵在於，缺失94298-94308至94262-94272位的核苷酸(編碼gM核心部分，序列順序號來自Telford，1992)。也就是說，在本發明中可以缺失上述核苷酸序列內部的任意核苷酸，例如核苷酸94299-94263，94299-94264，94300-94272，或它們的任意組合。
更優選地，本發明EHV-1的特徵在於，除了編碼gM的C末端部分的編碼序列184個鹼基對(bp)，以及編碼gM的N末端部分的編碼序列209個bp不缺失以外，其它gM編碼序列缺失。在本發明較優選的實施方案中，僅僅只保留編碼gM的C末端部分編碼序列中93118-93301位的核苷酸和gM基因N末端部分編碼序列中94264-94472位的核苷酸，而其它gM編碼序列缺失。因此，更優選地，本發明EHV-1的特徵在於，缺失94263至93302位的核苷酸(編碼gM核心部分，序列順序號來自Telford，1992)。在本發明最優選的實施方案中，缺失962個核苷酸的gM編碼序列。非限制性的實施例1就是一個例子。
更優選地，EHV-1的特徵在於，gM缺失且不含異源成分，同時它是基於選自AB69(ATCC VR2581)，EHV-1 Ts-突變株ECACC V99061001，EHV-1的KyA，KyD，Ab1，Ab4，RacH，RacL11或RacM的重組變體，不存在如GFP或1acZ等異源成分。更優選地，本發明EHV-1的特徵在於，它gM缺失且不含如GFP或1acZ的異源成分，並且它是基於EHV-1的RacH的重組變異體。最優選地，本發明EHV-1的特徵在於，它gM缺失且不含如GFP或lacZ的異源成分，並且它是實施例1中所公開的基於RacH的重組變異體分離株HΔgM-w。所述的本發明EHV-1 HΔgM-w，根據布達佩斯條約，作為專利保藏，保藏在應用微生物與研究中心(CAMR)和歐洲細胞培養物保藏中心(ECACC)，索爾茲伯裡，威爾特郡，SP4 OJG，UK。保藏日是2002年10月16日，初步確定名稱為H-delta-gM-w，國際保藏單位ECACC/CAMR給出的保藏號為02101663。具有所述被保藏的EHV-1的全部鑑定特性的EHV-1，也是優選的。
所有前述的EHV-1，比含有異源成分的病毒，如含有GFP的病毒，都有優越性。本發明所述的EHV-1，與那些仍包含異源成分的病毒相比，有更優越的細胞外感染性。這在圖5中可以得到例證(如4-12小時之間)。
在本發明作出之前，本領域的技術人員都沒有製備出可用作疫苗的重組EHV-4病毒。EHV-1與EHV-4是同系物(homologous)，並且有一定程度的交叉反應性。然而，本領域技術人員長期需要減毒的EHV-4病毒，因為EHV-1不能提供足夠的抗EHV-4感染的保護。因此，優選地，本發明EHV的特徵在於，它是EHV-4。更優選地，本發明EHV-4的特徵在於，缺失gM可讀框1332個bp中的900-1150個bp。更優選地，本發明EHV-4的特徵在於，缺失gM可讀框的1000-1150個bp。也是更優選地，本發明EHV-1的特徵在於，缺失gM可讀框的1110-1115個bp(1110，1111，1112，1113，1114，1115)。最優選地，本發明EHV-1的特徵在於，缺失gM可讀框的1110個bp。
更優選地，本發明EHV-4的特徵在於，除了編碼gM的C末端部分的編碼序列0-50個鹼基對(bp)，以及編碼gM的N末端部分的編碼序列150-250個bp不缺失以外，其它gM編碼序列缺失。在本發明較優選的實施方案中，僅僅只保留編碼gM的C末端部分編碼序列中92681-92680至92681-92730位的核苷酸和gM基因N末端部分編碼序列中93766-94033至93866-94033位的核苷酸，而其它gM編碼序列缺失。因此，更優選地，本發明EHV-4的特徵在於，缺失92681-92731至93765-93865位的核苷酸(編碼gM核心部分，核苷酸序號來自Telford，1998)。在給定範圍內，可以缺失任意數量的核苷酸。因此，本發明中，缺失可以從不低於92681位置的核苷酸處開始，而不是必須從92731位開始。缺失可以早在93765位終止，但不能晚於93865位。因此，本發明優選EHV-4的特徵在於，缺失對應於Telford序號(1998)的gM編碼序列中的92681至93865位的核苷酸。上述缺失序列的任意組合，都在本發明範圍之內，例如92672至93801，92700至93800，等等。
更優選地，本發明EHV-4的特徵在於，除了編碼gM的C末端部分的編碼序列10-40個鹼基對(bp)，以及編碼gM的N末端部分的編碼序列190-220個bp不缺失以外，其它gM編碼序列缺失。在本發明較優選的實施方案中，僅僅只保留編碼gM的C末端部分編碼序列中92681-92690至92681-92720位的核苷酸和gM基因N末端部分編碼序列中93806-94033至93836-94033位的核苷酸，而其它gM編碼序列缺失。因此，更優選地，本發明EHV-4的特徵在於，缺失92691-92721至93805-93835位的核苷酸(編碼gM核心部分，序列順序號來自Telford，1998)。
更優選地，本發明EHV-4的特徵在於，除了編碼gM的C末端部分的編碼序列30-40(30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40)個鹼基對(bp)，以及編碼gM的N末端部分的編碼序列200-210(200，201，202，203，204，205，206，207，208，209，210)個bp不缺失以外，其它gM編碼序列缺失。在本發明較優選的實施方案中，僅僅只保留編碼gM的C末端部分編碼序列中92681-92710至92681-92720(92710，92711，92712，92713，92714，92715，92716，92717，92718，92719，92720)位的核苷酸和gM基因N末端部分編碼序列中93816-94033至93826-94033(93824，93825，93826，93827，93828，93829，93830，93831，93832，93833，93834)位的核苷酸，而其它gM編碼序列缺失。因此，更優選地，本發明EHV-4的特徵在於，缺失92711-92721至93823-93833位的核苷酸(編碼gM核心部分，序列順序號來自Telford，1998)。也就是說，在本發明中可以缺失在上述核苷酸序列內部的任意核苷酸，如核苷酸94299-94257，94299-94256或94300-94257，或它們的任意組合。
更優選地，本發明EHV-4的特徵在於，除了編碼gM的C末端部分的編碼序列34個bp，以及編碼gM的N末端部分的編碼序列209個bp不缺失以外，其它gM編碼序列缺失。在本發明較優選的實施方案中，僅僅只保留編碼gM的C末端部分編碼序列中92681-92714位的核苷酸和gM基因N末端部分編碼序列中93825-94033位的核苷酸，而其它gM編碼序列缺失。因此，更優選地，本發明EHV-4的特徵在於，缺失92715至93824位的核苷酸(編碼gM核心部分，序列順序號來自Telford，1998)。在本發明最優選的實施方案中，缺失1110個核苷酸的gM編碼序列。非限制性的實施例2就是一個例子。
也是更優選地，本發明EHV-4的特徵在於，它gM缺失且不含如GFP或lacZ的異源成分，並且它是基於EHV-4的MSV Lot 071398株的重組變異體。最優選地，本發明EHV-4的特徵在於，它gM缺失且不含如GFP或lacZ的異源成分，並且它是基於MSV Lot 071398株，以及實施例2中公開的E4ΔgM-4分離株。所述的本發明EHV-1 HΔgM-w，根據布達佩斯條約用作專利用途的保藏，保藏在應用微生物與研究中心(CAMR)和歐洲細胞培養物保藏中心(ECACC)，索爾茲伯裡，威爾特郡，SP4 OJG，UK。保藏日是2003年01月14日，初步確定名稱為EHV-4，國際保藏單位ECACC/CAMR給出的保藏號為03011401。具有所述被保藏的EHV-4的全部鑑定特性的EHV-4，也是優選的。
所有前述的EHV-4，比現有技術中的其它已知病毒有更加優越的特性，因為現有技術中沒有獲得重組EHV-4。而且，本發明所述EHV-4，與那些仍包含異源成分如GFP的病毒相比，有更優越的細胞外感染性。這在圖10中可以得到例證(例如在24小時的時候)。
本發明的另一重要方面是，如上所述編碼EHV的核酸。本領域技術人員通過本領域已知的標準分子生物學方法，可以容易地確定相應序列。
本領域特別存在的難點是，如何獲得本發明的EHV。本申請發明人通過將分子標記基因(lacZ)導入至gM基因，而構建了gM陰性EHV病毒。在試圖缺失gM可讀框時，在通過lacZ插入產生的EHV-1和EHV-4突變體中，所有表現型為lacZ陰性的克隆，事實上其中仍含有lacZ表達框。本申請發明人由此研究出了一種獲得所述病毒的創造性方法。構建了這樣一種EH病毒，通過插入包含GFP分子標記的表達框，將病毒中的gM基因去除。驚奇地是，使用此方法可以區分原始輸入病毒(綠色螢光空斑)和新重組病毒(非螢光空斑)。也就是說，本申請發明人克服了本領域的技術難題，製備了可組成性表達EHV4-gM的Vero細胞系(基於Vero細胞克隆1008)。所述細胞系，通過將合適gM基因的轉染，以及接著對表達gM的Vero細胞進行篩選，而得到。只有所述細胞才能使本發明人重複獲得EHV4 gM陰性的病毒。
本發明所述gM補足Vero細胞系，根據布達佩斯條約用作專利用途的保藏，保藏在應用微生物與研究中心(CAMR)和歐洲細胞培養物保藏中心(ECACC)，索爾茲伯裡，威爾特郡SP4 OJG，大不列顛聯合王國(UK)。保藏日期是2003年01月28日，確定的初步名稱為VERO GM，國際保藏單位ECACC/CAMR給出的保藏號為03012801。具有所述被保藏的VERO GM細胞系所有鑑定特性的細胞系，也是優選的。
優選地，獲得重組EHV的方法，可以包括以下步驟a)分離野生型EHV；b)任選與兩側序列，構建編碼EHV gM基因質粒；c)產生表達gM或部分gM的補足細胞系；d)將EHV核酸與編碼gM的質粒共轉染至步驟b)的補足細胞系，其中該質粒中gM基因被GFP編碼框插入而斷開。由此，獲得了攜帶GFP編碼框插入至其gM編碼序列的EH病毒；e)去除GFP編碼框；f)篩選GFP編碼框被成功去除的EHV克隆。
所述上述細胞，是本發明一個重要的實施方案。因此，本發明涉及用於本發明方法中的細胞系，其特徵在於，編碼蛋白gM基因被轉染至所述細胞系，且所述細胞系表達gM。優選地，本發明涉及本發明細胞系的特徵在於，它是選自Vero細胞(Vero-gM細胞)，RK-13，以及cc(cc-gM)組成的組。
如上述對EHV-1的公開，EHV-4中也使用分子標記lacZ代替GFP，沒有成功產生本發明的病毒(參見非限制性的實施例2)。總的來說，Vero細胞與Rk13細胞相比，其「LacZ陽性」細胞，染色強度較低，因此更難鑑定。而且，EHV-4與EHV-1相比，其系統複製較慢，因此在空斑的鑑定與活病毒子代的分離之間，留下了較少時間。因此，使用GFP是獲得所述EHV-4病毒的唯一方法。用上述EHV-1中描述的方法進行操作，驚奇地是，通過確定螢光空斑，也成功鑑定出了EHV-4 gM缺失病毒。
通過收集懷疑感染EHV疾病動物的屍體肺組織，分離組織細胞中的EHV，可以完成野生型EHV的分離，這是本領域技術人員已知的。EHV-1完全基因組序列，已經由Telford等(1992)出版了。同樣地，EHV-4完全基因組序列，也由Telford等(1998)出版了。通過使用可結合靶DNA互補鏈的特異性引物，對DNA序列進行PCR擴增，是分子生物學的標準方法，其中該靶DNA位於目標DNA延伸段(DNA strech of inferest)的兩側。將目標DNA序列與適合用作構建體的質粒進行連接的方法，將DNA轉染至真核細胞的方法，Southern雜交分析與Western雜交分析的方法，通過限制性酶定點切除DNA片段的方法，以及選擇表達目標異源基因，含有目標基因質粒，或某些基因缺失病毒的細胞系的方法，都是本領域的公知常識。如上所述技術的標準分子生物學方法，是本領域技術人員已知的，本領域技術人員也可以在，如Sambrook etal.(1989)Molecular Cloning一書中找到(A LaboratoryManual，2nd ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NewYork andBertram，S.and Gassen，H.G.Gentechnische Methoden，G.FischerVerlag，Stuttgart，New York，1991)。
「缺失」是指，去除一個或幾個核苷酸或胺基酸。
本發明另一個重要的具體實施方案是，包含本發明EHV的藥用組合物或疫苗，該藥用組合物或疫苗可任選與藥學上可接受的載體或賦形劑組合。
本發明又一個重要部分是，包含如上所述本發明核酸的藥用組合物。
優選地，本發明疫苗是指上述定義的疫苗。術語「活疫苗」是指，包含能複製的顆粒的疫苗，特別是指可複製的活病毒成分。
優選地，本發明疫苗包含，如上所述本發明gM缺失的EHV-1，如上所述本發明gM缺失的EHV-4，或任選的其它抗原性成分(antigenetic group)，以及任選藥學上可接受的載體或賦形劑。所述疫苗，可以在同一個時間點以組合疫苗形式給予。最優選地，本發明所述減毒EHV-1可以首先給予，在3-4周後，接著給予本發明減毒的EHV-4。也是最優選地，本發明所述減毒EHV-1，可以在包含2-3次基本免疫接種的典型免疫方案中，與本發明減毒EHV-4組合給予。這樣的疫苗典型免疫方案是，間隔4周進行兩次免疫(基本免疫)，接著每6個月進行定期的加強免疫。然後，如上所述的本發明任何疫苗，也可以以不同時間間隔給予，例如每三個月。
技術人員可以在兩次或多次施用中，選擇分開給藥。施用可以間隔比較短的時間，或者以某個其他預先確定的間隔周期進行。優選地，這樣的間隔可以是，一次免疫，二次免疫是在此之後間隔大約4周，和可任選三次免疫，在此之後5-6月。疫苗可給予一次，或幾次，還可以間斷給予，這取決於所想要的免疫持續時間和處理效果。本發明疫苗可以在母馬配種(breeding)之前給予一次，在懷孕期間再給予一次，以預防與EHV相關的流產。也可免疫其他母馬，如每年一次。馬駒可以在出生之後立即免疫。
本發明疫苗可以通過不同給藥途徑給予，特別是通過靜脈注射或靶組織直接注射給予，這是本領域專業人士公知的。系統給藥優選，靜脈內，血管內，肌肉內，動脈內，腹膜內，口腔，或黏膜(如鼻腔或呼吸道噴射或注射)途徑給藥。更多的局部施用也是有效的，如皮下，皮內，肺內，或者欲處理組織的內部或附近(關節，骨，肌肉，神經，上皮組織)。本發明疫苗組合物，也可以通過植入或口服給予。最優選地，可以通過肌肉內給藥。
本領域專業人士可以使用已知可注射的、生理上可接受的無菌溶液，製備如上所述應用的合適疫苗製備物。可以容易獲得等滲水溶液，如鹽溶液，或相應的血漿蛋白溶液，用於製備可立即使用的溶液，用於胃腸道注射或注輸。疫苗製劑，也可以是冷凍乾燥製劑或幹的製備物，它可以在使用之前在無菌條件下，用已知注射溶液直接重構，例如，將其作為試劑盒的一部分。本發明疫苗製劑的最終製劑，通過將本發明純化疫苗，與無菌的生理上可接受的溶液混合，可以用於注射，注輸，或灌注，其中該無菌生理上可接受的溶液，可以用已知載體物質或/和賦形劑進行補充。在疫苗製劑中，本發明每種EH病毒的使用劑量，優選是104-108TCID50/每個動物，105-107TCID50/每個動物，最優選是106TCID50/每個動物。
本發明進一步涉及本發明EHV在用於預防和/或治療EHV相關疾病的藥物製備中的應用。
本發明進一步涉及預防和/或治療動物的方法，其特徵在於，將本發明藥用組合物應用至所述動物，然後監測治療效果。
優選地，本發明涉及用如上所述本發明gM缺失EHV，治療EHV感染馬科動物的方法，其中，將如上所述的該減毒EHV或疫苗組合物，以本領域技術人員已知的合適劑量，給予需要的馬科動物，然後監測EHV症狀，如病毒血症，和白細胞減少症，和/或咳嗽，和/或發熱，和/或流鼻涕，和/或腹瀉，和/或抑鬱，和/或流產，是否減輕。所述治療優選可以被重複。因此，本發明涉及預防和/或治療動物的方法，其特徵在於，將本發明藥用組合物應用於所述動物，然後檢測治療效果。治療可以以可用於疫苗組合物的如上所公開的方法進行。
優選地，本發明涉及針對感染性EHV-1，EHV-4特異性結構的抗體的檢測方法，以及涉及通過免疫方法，區分野生型感染與如上所述gM缺失EHV-1或EHV-4存在的方法。免疫方法是本領域專業人士已知的，包括但不限於，ELISAs(酶聯免疫分析)或Sandwich-ELISAs，原位印記，免疫印記，放射免疫分析(放射免疫分析RIA)，基於擴散的Ouchterlony試驗，快速免疫螢光分析，或Western雜交。免疫方法的實例，例如在下列文獻中有記載AnIntroduction toRadioimmunoassay and Related Techniques，Elsevier SciencePublishers，Amsterdam.The Netherlands(1986)；Bullock etal.，Techniques inImmunocytochemistry，Academic Press，Orlando，FL Vol.1(1982)，Vol.2(1983)，Vol.3(1985)；Tijssen，Practice and Theory of Enzyme ImmunoassaysLaboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology，Elsevier SciencePublishers，Amsterdam，The Netherlands(1985)。在適合ELISA分析的塑料表面上，所述ELISA可以使用但不限於，固定化的gM基因產物，gM基因產物的一部分，或者1型或4型EH病毒的其他任何基因產物。
本發明ELISA，包括但不限於如下步驟a)將gM基因產物或gM基因產物片段固定在塑料支持物上；b)用合適的洗滌緩衝液(如PBS-Tween)洗滌支持物表面；c)將樣品加入至選定孔中，用標準方法溫育ELISA板；d)洗滌ELISA板孔，然後加入與酶，如HRP(辣根過氧化物酶)偶聯的合適抗體通過加入合適的底物，接著對單孔光密度進行光度計讀數，來對結合型抗體/HRP的偶聯物進行檢測。合適的抗體，如兔抗馬免疫球蛋白，是本領域公知的。
下列實施例用於進一步解釋本發明，但是與此同時，它不應解釋為是對本發明範圍的限制。
實施例實施例1gM缺失的EHV-1分離株通過插入大腸桿菌lacZ表達框(HΔgM-lacZ)或者綠色螢光蛋白(GFP)表達框(HΔgM-GFP)，取代74.5％gM基因序列，可以構建gM陰性的EHV-1。表達標記蛋白，有利於鑑定和後續純化重組蛋白。為了避免疫苗病毒中出現任何「非EHV-1」序列，我們決定去除標記基因序列，構建另一gM陰性的EHV-1，即第二代gM陰性的EHV-1，「純」(」white」)HΔgM(HΔgM-w)。
為此，構建了質粒pXuBaxA(圖1)。首先，我們希望將pXuBaxA序列與lacZ標記病毒HΔgM-lacZ重組。第一步，優化磷酸鈣法介導的DNA轉染，以使在鋪滿100-1000 PFU轉染上清液之後，可以得到多個白斑。接著，選擇幾個白斑，用於對子代病毒進行純化，對單斑進行4-5輪分離。
多個獨立分離的lacZ表型陰性病毒群，用Southern雜交進行基因型分析，結果顯示，其仍然攜帶有lacZ表達框序列。分離真正lacZ陰性病毒群的困難存在，致使大量lacZ表型陰性病毒群純化分析後，基因型都不是lacZ陰性，這是因為「lacZ-表達沉默」。因此，純化得到的許多lacZ表型陰性的病毒群，分析後其基因型並不是陰性。因此，構建「純」gM陰性RacH病毒的策略，需要通過改變共轉染中的gM陰性EHV-1，即使用插入GFP表達框構建的gM陰性EHV-1。使用GFP表達病毒，有助於區分原始輸入病毒(綠色螢光蛋白斑)和新重組病毒(非螢光斑)，由此提高了分離表型GFP陰性斑的效率。對「原始」gM陰性RacH的這一改變，認為不會影響預期重組病毒的基因型，因為(i)第一代HΔgM病毒，除了標記不同以外，它們的基因型在遺傳上是相同的，(ii)重組目標區的最終基因型，是由重組質粒pXuBaxA決定的。
為了構建質粒pXuBaxA(獲得「純」gM陰性EHV-1必需的構建體)，將質粒pBH3.1在EHV-1 gM 1352bp可讀框內的962bp Apa1-Hinc11片段切除(圖1D)。質粒pBH3.1攜帶有EHV-1的、圍繞gM基因的BamHI-Hind111片段(Seyboldt等，2000)。為了防止任何截短gM產物表達，選擇Apa1和Hinc11限制性內切酶，以使對平頭末端進行修復連接之後，剩餘的gM序列C末端(183bp)與剩餘的N末端序列(208bp)不在閱讀框內。
將EHV-1 gM表達細胞系ccgM(Seyboldt等，2000；從Dr.N.Osterrieder處獲得)維持在補加了5-10％胎牛血清的極限培養基中(Biochrom，經γ射線輻射過的)。將5-10μg pXuBaxA質粒(圖1D)，分別與HΔgM-lacZ或HΔgM-GFP2μg DNA，通過磷酸鈣介導，共轉染至ccgM細胞，獲得同源重組的EHV-1。
用質粒pBH3.1 BamHI-HindIII片段特異性的毛地黃毒苷標記探針，對HΔgM-GFP DNA進行後續分析(圖2)，顯示，(i)用BamHI消化，得到2.757bp和9.043bp的片段；(ii)用Hind111消化，得到10.006bp和825bp的片段；(iii)用Pst1消化，得到5.415bp和4.474bp的片段；使用的限制性酶(BamH1，Hind111，Pst1)，確實切在GFP標記表達框序列內部，與各自不含GFP標記表達框的DNA相比，片段的限制性酶切圖譜改變了。
GFP探針可結合i-iii中各自的第一片段，在RacH或HΔgM-w DNA中沒有檢測到GFP特異性序列。
在RacH DNA中，可以檢測到預期的BamHI片段(11.166bp)，Hind111片段(10.199bp)，和Pst1(9.257bp)片段，它們在去除掉962bp gM序列之後，其大小相應地減少了(分別減少至10.204bp，9.237bp和8.279bp；圖3B)。
對gM陰性病毒(HΔgM-w或HΔgM-GFP)和RacH病毒，進行一步法生長動力學檢測，該gM陰性病毒如圖1圖解所述構建。在24孔板中將Rk13細胞用感染複數(MOI)為2的上述各種病毒感染。將上清液和感染細胞，分別在各個感染時間點(0，4，8，12，16，20，24hp.i.)收穫。低速離心去除上清液中的細胞破碎物，在細胞相關感染性(cell-associated infectivity)分析之前冷凍-解凍細胞。所有病毒滴定濃度，分別用Rk13或ccgM細胞在24孔板中確定。結果(數據未顯示)概括如下與RacH感染細胞的滴定相比，兩種HΔgM病毒的細胞相關感染性都有所降低，在Rk13細胞中降低1.6(4hp.i.)至45(20hp.i.)倍(細胞內感染)。與RacH滴定相比，兩種HΔgM病毒細胞外病毒滴定，都大大降低了186倍(HΔgM-w)或650倍(HΔgM-GFP)(12hp.i.時測定)(細胞外感染)。這也證實了gM在RacH病毒外釋(virus egress)中起到作用。
實施例2gM缺失的EHV-4分離株與構建gM陰性EHV-1相類似，選擇lacZ選擇性標記篩選EHV-4。要分離gM陰性EHV-4，必需構建組成性表達EHV-4 gM的Vero細胞系。將Vero細胞克隆C1008(ATCC保藏號CRL-1586)維持在極限培養基中，該培養基補加了5-10％胎牛血清(Biochrom，進行了γ射線輻射處理)。將1μgpCgM4質粒(圖3B)與0.1μgpSV2neo質粒(賦予對G418的抗性；Neubauer等，1997)，通過EffecteneTM(Qiagen)介導，轉染至Vero細胞，可以得到Vero-gM重組細胞系。細胞克隆首先進行G418抗性篩選(Calbiochem)，然後再進行gM陰性EHV-4互補試驗(trans-complementation)篩選。重組細胞系每隔五次傳代後，在其培養基中加入G418(500μg/ml)。所有細胞周期性地，通過PCR分析支原體，通過FACS法分析牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)抗原。篩選得到的細胞克隆命名為Vero-gM，這將在下文試驗中使用。
將EHV-4 DNA與pgM4β+質粒(圖3B)共轉染至Vero-gM細胞。重組獲得了多個「lacZ陽性」斑，將其分離重培養。但是缺失突變EHV-4的後續純化，與EHV-1相比，其結果是更加困難而且更慢，因為(i)Vero細胞「lacZ-陽性」斑比Rk13細胞，在染色強度上一般較弱，因此更難鑑定，(ii)EHV-4系統複製比EHV-1慢，因此留下了更少的時間用於陽性斑鑑定和分離子代活病毒。
所有分離的lacZ陽性斑，在第一輪純化之後標記會消失，這就迫使我們尋找其他解決辦法。因此，我們也決定用GFP-標記分子對EHV-4進行標記。第一步，構建pgM4GFP+質粒(圖3B)，用於與EHV-4 DNA重組。通過在Vero-gM細胞系上進行三輪分離單個斑，純化所獲GFP-陽性斑。選擇均一GFP-陽性的病毒群，將病毒DNA進行Southern雜交分析(圖4)。將所獲的病毒DNA，E4ΔgM-GFP(圖3C)，與質粒pgM4R或pgM4w(圖3B)進行共轉染。質粒pgM4R用於構建gM-修復型(gM-repaired)EHV-4，即E4RgM(圖3A)。質粒pgM4w是產生gM和標記基因雙陰性EHV-4，即E4ΔgM-w的基礎(圖3D)。E4RgM和E4ΔgM-w病毒群，可以通過對GFP陰性表型病毒進行分離得到，之後在Vero或Vero-gM細胞上進行純化，最後進行Southern雜交分析(圖4)。為了在真核細胞中表達EHV-4 gM，構建了質粒pCgM4(圖3B)。用圖8所示引物和Taq聚合酶(MBI-Fermentas)，使用PCR對EHV-4 gM的全長ORF進行擴增。將所獲的PCR產物，插入至pcDNA/Amp(invitrogene)載體。
對EHV-4的91.699-94.808的核苷酸片段(Telford等，1998)進行PCR擴增，將擴增產物插入至pGEM3Zf+(Promega)，這樣就得到了質粒pgM4R(圖3B；圖8)。該質粒用於構建gM-修復型EHV-4，即E4RgM(圖3A)。
要構建質粒pgM4β+(圖3B)，需要選擇多步策略，該質粒初始設計刪除1352bp EHV-4 gM中的1110bp。第一步，用PFU聚合酶(Stratagene)使用PCR，對DNA重組所必需的兩側翼序列，分別進行擴增。通過引物序列，引入其他克隆步驟必需的限制性位點(圖8)。將PCR產物插入至pTZ18R(Pharmacia)載體，得到質粒pgM4Del1和pgM4Del2(圖8)。第二步，用Sal1和BamH1消化，將3.9kbp大腸桿菌lacZ表達框從質粒ptt264A+中釋放(Osterrieder等，1996)，再將其插入至質粒pgM4Del1，得到質粒pgM4Del1β+。然後，用PstI和SalI限制性酶，將來自pgM4Del2的EHV-4特異性序列導入至pgM4 Del1β+，以使所獲質粒pgM4β+中標記基因表達框在側翼被EHV-4特異性序列包圍(圖3B)。
之後，將質粒pgM4β+用SalI和BamHI消化，再一次釋放lacZ表達框，將所得的5』-末端用Klenow聚合酶補平，再對其進行重新連接，由此得到一構建體。將該構建體命名為pgM4w(圖3B)。再考慮gM序列N末端208nt和殘留C末端33nt之間的移碼突變。
要產生質粒pgM4GFP+(圖3B)，需要用Sal1和BamH1限制性酶切位點，將lacZ表達框從pgM4β+中去除(圖3B)，替換上GFP表達框(包含CMV啟動子和SV40-polyA)，該GFP表達框是通過Asn1和Mlu1消化，從載體pEGFP-C1中(Clontech)移出的。限制性酶產生的末端，用Klenow聚合酶補齊為平頭末端。
所有正確擴增的PCR產物，都用循環測序法(MWG Biotech)，將測序結果與EHV-4株NS80567(Telford等，1998)的公開序列進行比較，而得到確認。
在Vero-gM細胞繫上，對EHV-4進行重組。將質粒pgM4β+或pgM4GFP+(圖3B)與EHV-4 DNA共轉染，就產生了第一代的gM-陰性EHV-4(圖3C)。將質粒pgM4w(圖3B)與gM陰性EHV-4 DNA進行組合，就得到了E4ΔgM-w(圖3D)。最後，將質粒pgM4R(圖3B)與E4ΔgM-GFP DNA共轉染至Vero細胞，就分離得到了gM修復EHV-4，即E4RgM(圖3A)。
將EHV-4，E4RgM，E4ΔgM-w，和E4ΔgM-GFP的DNA，用PstI，EcoRV，或HindIII酶切，再將所得DNA片段印記在尼龍薄膜上。將平行膜上的DNA片段用GFP特異性序列(與圖2中所用序列相同)或gM3.1探針進行雜交，該gM3.1探針包含來自質粒pgM4R(圖3B)中的EHV-4特異性序列。
所獲消化結果如下(圖4)(i)對E4ΔgM-GFP DNA來說，當用PstI酶切時，GFP探針檢測到了5.531bp大小的片段；當用EcoRV酶切時，則檢測到了8.383bp大小的片段；當用HindIII酶切時，檢測到了4.528bp大小的片段。當與gM3.1探針反應時，除檢測到與上述相同的片段以外，還檢測到了1.792bp大小片段(PstI)和1.801bp大小片段(EcoRV)；而使用HindIII酶切時，則還檢測到了826bp和5.487bp大小的片段。
(ii)無論是親本EHV-4，還是修復病毒E4RgM，或者是E4ΔgM-w，它們都不攜帶任何的GFP特異性序列。
(iii)EHV-4和E4RgM中檢測到的gM3.1反應性DNA片段分別是6.806bp(Pst1)，7.874bp+1.801bp(EcoRV)，4.837bp+5.487bp(HindIII)。
(iv)gM和GFP雙陰性病毒E4ΔgM-w，它不與GFP序列雜交，但是卻與相應的EHV-4特異性序列(gM3.1)雜交。後一探針檢測到的片段，與野生型病毒相比，缺乏1110bp大小的gM序列，即分別是5.696bp(Pst1)，6.764bp+1.801bp(EcoRV)，3.727bp+5.487bp(HindIII)。所有這些病毒DNA在用HindIII裂解時，還存在另一個126bp大小gM3.1探針的特異性片段(圖2C)，但是這片段太小而沒有在Southern雜交中顯示。
E4ΔgM-GFP和E4ΔgM-w病毒都失去了表達gM的能力，另外，E4ΔgM-w還失去了標記基因序列。
a)在培養細胞上進行病毒培養將如上詳述各種突變病毒的生長特性在Vero和Vero-gM細胞上進行比較。將細胞接種在24孔板中，以1-2的MOI感染，在不同p.i.時間點確定細胞外(細胞外感染)和細胞內(細胞內感染)的病毒滴定(圖5)。修復E4RgM病毒的生長特性，與EHV-4相同，都很好，而E4ΔgM-w和E4ΔgM-GFP細胞外病毒滴度在非補足細胞系中令人驚奇地受到抑制。在多次試驗中(兩個獨立試驗的平均值)，細胞外感染性在24hp.i.之前根本沒有檢測到。即使在p.i.30小時，也僅僅在細胞外只觀察到非常低的滴定(最低稀釋10-1時最大值為1.5個空斑/ml)，儘管細胞顯示出嚴重的細胞病變效應。然而，細胞內感染方面的差距沒有達到100倍，而且在p.i.24小時達到頂峰(EHV-4與E4ΔgM-w相差84倍)。檢測到的細胞內感染只在一個時間點有延遲(p.i.12h相對於15h)。將上述結果一起考慮，可以驚奇地顯示，EHV-4缺失gM序列，將大大影響病毒在體外的複製，但是gM表達不是複製所必需的。特別是gM缺失後，細胞外感染性病毒的數量減少了，直接感染鄰近細胞的能力減弱了，這一點可以從噬菌斑大小反應出來。
b)噬菌斑大小測量了EHV-4，E4RgM，E4ΔgM-w，E4ΔgM-GFP感染Vero或Vero-gM細胞150個噬菌斑的直徑，計算出噬菌斑的平均直徑，以相對於野生型噬菌斑直徑大小的相對百分數表示，野生型噬菌斑設為100％。結果清楚顯示，gM陰性病毒在Vero細胞中能夠感染和複製，但是其噬菌斑的最大直徑大大減小，不足野生型斑直徑的20％(圖6)。親本或修復病毒感染，則有與野生型病毒感染類似的斑大小，這表明觀察到的表型確實是由gM缺失引起的。這一點也可以通過下述事實得到進一步確證，E4ΔgM-w和E4ΔgM-GFP形成噬菌斑的能力，可以完全在Vero-gM細胞系上重建(數據未顯示)。
c)病毒侵入試驗本試驗中，將評估EHV-4 gM對EHV-4細胞侵入動力學的影響。在允許病毒4℃吸附細胞的條件下，將100PFU的各種病毒，親本EHV-4，gM修復病毒E4RgM，gM缺失突變病毒，和E4ΔgM-GFP病毒(見圖3)，加入至6孔板中的Vero細胞。90min後，相應地接種培養基用新鮮培養基取代，通過改變培養溫度至37℃開始病毒侵入試驗。在溫度改變後的各種不同時間點(開始時刻＝0min)，用檸檬酸鹽緩衝液(pH3.0)處理細胞使細胞外感染性通過pH條件失活。用PBS代替檸檬酸鹽緩衝液，相應地洗滌平行試驗樣品，以使在每個時間點將「吸附感染性(adsorbed infectivity)」與「侵入感染性(penetrated infectivity)」進行比較。在甲基纖維素覆蓋下溫育細胞4天後，計算噬菌斑數量。
d)幾組試驗的數據結果圖7A表示在非補足Vero細胞中繁殖的基因型和表型都是gM陰性的病毒，而圖7B表示表型上得到彌補的E4ΔgM-w和E4ΔgM-GFP的動力學，因為病毒生長在表達gM的Vero-gM細胞上。
在侵入試驗開始40min後，感染性的親本EHV-4(E4RgM)平均有52.8％(56.7％)受到細胞保護而未受到細胞外酸處理失活(圖7A，空心圈)，然而gM陰性病毒只有33.7％(E4ΔgM-w-實心方塊)和38.5％(E4ΔgM-GFP-實心三角)受到保護。在入侵動力學曲線晚期，不同曲線開始相互交叉，最大入侵率在入侵時間150min到達，在61.7％-78.9％之間。這表明，分析條件有某些變化導致了觀察結果的輕微差異(圖7A)。
當gM陰性病毒在補足性Vero-gM細胞上生長時，則沒有觀察到入侵效率差異(7B)。gM陰性EHV-1入侵動力學曲線，在Vero細胞上延遲了大約20％(RacL11株；Osterrieder等，1996)-40％(KyA株；Seyboldt等，2000)，與之相反，它在Vero-gM補足細胞上的入侵率則得到了保留。由此可以得到以下結論(i)gM陰性病毒在表型補足細胞和非補足細胞上的動力學曲線存在差異(圖7A-B)，(ii)但是gM缺失對EHV-4入侵能力的影響實際上可以忽略。
實施例3用gM特異性血清試驗對馬血清中的抗gM抗體進行分析要確定gM是否能用作區分野生型病毒感染和gM缺失疫苗接種的血清學標誌，需要對幾個設想進行驗證。首先，必須驗證野生病毒感染的馬血清中是否含有gM特異性抗體。對這個初步驗證，可以選擇Western雜交試驗，因為該系統可以鑑定特異性反應，該特異性反應是相對於背景反應來說的。當使用高度中和血清反應時(EHV-1和/或EHV-4中和滴定濃度在1∶128-1∶256之間)，得到了如下結果(數據未顯示)EHV-1 gM表達細胞系ccgM裂解物在馬血清中檢測到了特異性信號，以及將血清稀釋至1∶3000其效果似乎更好。
然後，對所有12匹參與EHV-1 gM疫苗試驗的馬駒血清(6匹免疫，6匹對照)進行Western雜交gM反應性分析。在每匹馬中取三種不同的血清進行試驗進行免疫試驗前取血清(Pre)，二次免疫後4周取血清(V2)，抗感染試驗後2周取血清(C)。
Western雜交分析(圖9)結果總結如下(i)馬血清都顯示出對EHV-1的中和活性，所有檢測都是gM陽性，(ii)在已知未接觸EHV-1或用gM缺失EHV-1免疫的任一分析樣品中，沒有檢測到gM反應性，(iii)用gM陽性攻擊病毒感染進行了免疫試驗的馬匹之後，gM可以在12匹馬中的10匹清楚地檢測到，(iv)抗EHV-1抗體的滴定濃度，似乎不與gM反應強度直接相關。
由於馬血清有很高的背景反應，所以進行血清學試驗非常困難。基於獲自馬血清的間接免疫螢光(IIF)數據證實，要麼建立一個間接的或可阻斷背景反應的試驗系統，要麼提供高純度的gM多肽用於ELISA試驗中。為此，建立如下的ELISA法。將純化的gM多肽或完全gM多肽固定至96孔板固相支持物上，把孔板包被，以確保俘獲蛋白的良好附著。為了有利於試驗分析，將非特異性結合位點用乾燥的牛奶(dry milk)或與其類似的物質封閉，以阻止非特異性的結合。接著，用合適的洗滌緩衝液(如PBS-Tween)洗滌塑料表面，以除去過多阻斷劑。之後，將測試樣品加入至選定板孔中，ELISA板在37℃用標準方法溫育，以使測試樣品中抗體結合至固定的俘獲蛋白上。再後，將ELISA板孔用洗滌緩衝液徹底清洗幾次，之後，再加入合適的酶偶聯的抗馬抗體，如HRP(辣根過氧化物酶)偶聯的抗體。最後，加入合適底物，對結合抗體/HRP偶聯物進行檢測，之後用光學計對每個孔的光密度進行讀數。將所得數據結果與相同分析試驗中使用的陽性、陰性對照進行比較。
實施例4EHV-4 gM的鑑定儘管EHV-4 gM的預測胺基酸序列與EHV-1 gM有86.7％的一致性(Telford等，1998)，但是特別地，抗EHV-1 gM的抗體Mab 13B2(Allen和Yeargan，1987)在Western雜交中只與型特異性蛋白(type-specific protein)反應(Crabb等，1991)。然而，為了鑑定本研究中EHV-4的同源物是否可與EHV-1抗體反應，使用其他抗EHV-1 gM抗體Seyboldt等，2000；Day，1999)對純化的EHV-4病毒粒子，EHV-4感染的細胞裂解物，Vero-gM細胞裂解物，進行了檢測。Vero-gM細胞是重組的細胞系，可以在IE-HCMV啟動子調控下合成EHV-4 gM。所有抗EHV-1 gM單克隆抗體與EHV-4 gM的反應性，都在Western雜交檢測限度以下，而平行EHV-1樣品則總可以迅速反應(數據未顯示)。只有在兔中產生的抗His-標記EHV-1 gM衍生多肽(胺基酸376-450；Seyboldt等，2000)的多克隆抗血清與異源gM有足夠強的反應，使其可用於鑑定EHV-4 gM(圖10A)。使用該抗體，在純化的EHV-4病毒粒子中觀察到大約50,000-55,000分子量處有特異性反應。根據預測的gM蛋白具有疏水性，所以檢測到的gM蛋白在煮沸後將會凝集。與上述特異性反應相反的是，重組Vero-gM細胞中表達的gM形式，其分子量主要在大約46,000-48,000之間，這些結果表明，EHV-4的gM蛋白的加工與EHV-1所顯示的有某些相似性，這一點已經在上文中作出了說明(Osterrieder等，1997；Rudolph和Osterrieder，2002)。
做了幾個試驗用於分析gM缺失EHV-4表型。為了比較其他糖蛋白的表達情況，將Vero細胞用EHV-4，E4RgM，E4ΔgM-w，或E4ΔgM-GFP感染，其裂解物進行Western雜交分析。結果顯示，缺失gM並不影響晚期蛋白gB或gD的產生，這表明病毒複製的早期步驟基本上不受缺失的影響。
在另一試驗中，對野生型，修復型，gM缺失型EHV-4病毒粒子製備物進行分析顯示，在gM陰性病毒中根本檢測不到gM反應性，而在對照病毒粒子中則蛋白可容易地進行反應。用對照的抗gB雜交探針顯示，各種製備物中病毒粒子確實存在(圖10B)。
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應用微生物與研究中心和歐洲細胞培養物保藏中心該文件證明H-Δ-gM-w，保藏號為02101663，根據1977年的布達佩斯條約，作為專利保藏，已保藏在應用微生物與研究中心(CAMR)和歐洲細胞培養物保藏中心(ECACC)，保藏日是2002年10月16日。
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附錄3第24頁布達佩斯條約關於用於專利程序的國際認可的微生物保藏國際局表格收件人BOEHRINGERINGELHEIM VETMEDICA GmbH存活證明CONTACT DR AXEL LISCHEWSKIBUILDING 4576-02-02 由下一頁所指明的國際保藏BINGER STRASSE 173單位根據細則10.2出具INGELHEIMD-55216GERMANY 1指的是初始保藏日，或者，當進行了新的保藏或保藏的轉換時，指的是最相關的日期(新保藏的日期或是轉保藏的日期)。
2對於那些法規10.2(a)(ii)和(iii)所代表的情況，指的是最近的存活性檢驗。
3用打叉表示選定。
附錄3第25頁

4如果要求該信息並且如果檢驗結果為陰性，則填寫此項。
應用微生物與研究中心和歐洲細胞培養物保藏中心該文件證明病毒EHV-4，保藏號為03011401，根據1977年的布達佩斯條約，作為專利保藏，已保藏在應用微生物與研究中心(CAMR)和歐洲細胞培養物保藏中心(ECACC)，保藏日是2003年1月14日。
附錄3第14頁布達佩斯條約關於用於專利程序的國際認可的微生物保藏收件人 國際局表格BOEHRINGERINGELHEIM VETMEDICA GmbHCONTACT DR AXEL LISCHEWSKIBUILDING 4576-02-02BINGER STRASSE 173INGELHEIMD-55216GERMANY 當適用於細則6.4(d)時，所述的日期為國際保藏單位的資格被認定的日期。
附錄3第24頁布達佩斯條約關於用於專利程序的國際認可的微生物保藏國際局表格收件人BOEHRINGERINGELHEIM VETMEDICA GmbH 存活證明CONTACT DR AXEL LISCHEWSKI由下一頁所指明的國際保藏BUILDING 4576-02-02BINGER STRASSE 173單位根據細則10.2出具INGELHEIMD-55216GERMANY 1指的是初始保藏日，或者，當進行了新的保藏或保藏的轉換時，指的是最相關的日期(新保藏的日期或是轉保藏的日期)。
2對於那些法規10.2(a)(ii)和(iii)所代表的情況，指的是最近的存活性檢驗。
3用打叉表示選定。
附錄3第25頁

4如果要求該信息並且如果檢驗結果為陰性，則填寫此項。
應用微生物與研究中心和歐洲細胞培養物保藏中心該文件證明細胞系VERO GM，保藏號為03012801，根據1977年的布達佩斯條約，作為專利保藏，已保藏在應用微生物與研究中心(CAMR)和歐洲細胞培養物保藏中心(ECACC)，保藏日是2003年1月28日。
附錄3第14頁布達佩斯條約關於用於專利程序的國際認可的微生物保藏收件人國際局表格BOEHRINGERINGELHEIM VETMEDICA GmbHCONTACT DR AXEL LISCHEWSKIBUILDING 4576-02-02BINGER STRASSE 173INGELHEIMD-55216GERMANY 當適用於細則6.4(d)時，所述的日期為國際保藏單位的資格被認定的日期。
附錄3第24頁布達佩斯條約關於用於專利程序的國際認可的微生物保藏國際局表格收件人BOEHRINGERINGELHEIM VETMEDICA GmbH存活證明CONTACT DR AXEL LISCHEWSKIBUILDING 4576-02-02 由下一頁所指明的國際保藏BINGER STRASSE 173單位根據細則10.2出具INGELHEIMD-55216GERMANY 1指的是初始保藏日，或者，當進行了新的保藏或保藏的轉換時，指的是最相關的日期(新保藏的日期或是轉保藏的日期)。
2對於那些法規10.2(a)(ii)和(iii)所代表的情況，指的是最近的存活性檢驗。
3用打叉表示選定。
附錄3第25頁

4如果要求該信息並且如果檢驗結果為陰性，則填寫此項。
權利要求
1.一種蛋白gM缺失的馬皰疹病毒(EHV)，其特徵在於所述EHV不含異源成分。
2.權利要求1的EHV，其特徵在於編碼蛋白gM的基因缺失。
3.權利要求1或2的EHV，通過包含下述步驟的方法獲得a)分離野生型EHV；b)任選與側翼序列，構建編碼EHV gM基因的質粒；c)構建表達gM或部分gM的補足細胞系；d)在編碼gM的質粒中插入GFP編碼框，將該編碼gM的質粒與EHV核酸共轉染至步驟b)構建的補足細胞系中，以獲得含有GFP編碼框插入至其gM編碼序列的EH病毒；e)除去GFP編碼框；和f)篩選GFP編碼框被成功去除的EHV克隆。
4.權利要求1-3任意一項的EHV，其特徵在於它是EHV-1。
5.權利要求1-4任意一項的EHV-1，其特徵在於850-1100bp大小的gM可讀框被去除。
6.權利要求1-5任意一項的EHV-1，其特徵在於除了150-200bp大小的C端編碼序列和150-250bp大小的N端編碼序列被保留以外，其餘整個gM編碼序列都被去除。
7.權利要求1-6任意一項的EHV-1，其特徵在於相應於Telford位置(1992)的gM編碼序列93268-93318至94222-94322位的核苷酸被去除。
8.權利要求1-7任意一項的EHV-1，其特徵在於相應於Telford位置(1992)的gM編碼序列93268-94322位的核苷酸被去除。
9.權利要求1-8任意一項的EHV-1，其特徵在於除了184bp大小的C端編碼序列和209bp大小的N端編碼序列被保留以外，其餘整個gM編碼序列都被去除。
10.權利要求1-9任意一項的EHV-1，其特徵在於相應於Telford位置(1992)的gM編碼序列94263-93302位的核苷酸被去除。
11.權利要求1-10任意一項的EHV-1，其特徵在於它是基於EHV-1 RacH株的重組突變體。
12.權利要求1-11任意一項的EHV-1，其特徵在於它是基於RacH的重組突變分離株HΔgM-w，其保藏在ECACC/CAMR，保藏日期是2002年10月16日，保藏號是02101663。
13.權利要求1-3任意一項的EHV，其特徵在於它是EHV-4。
14.權利要求1-3或13任意一項的EHV-4，其特徵在於900-1150bp大小的gM可讀框被去除。
15.權利要求1-3或13-14任意一項的EHV-4，其特徵在於除了0-50bp大小的C端編碼序列和150-250bp大小的N端編碼序列被保留以外，其餘整個gM編碼序列都被去除。
16.權利要求1-3或13-15任意一項的EHV-4，其特徵在於相應於Telford位置(1998)的gM編碼序列92681-92731至93765-93865位的核苷酸被去除。
17.權利要求1-3或13-16任意一項的EHV-4，其特徵在於相應於Telford位置(1998)的gM編碼序列92681-93865位的核苷酸被去除。
18.權利要求1-3或13-17任意一項的EHV-4，其特徵在於除了34bp大小的C端編碼序列和209bp大小的N端編碼序列被保留以外，其餘整個gM編碼序列都被去除。
19.權利要求1-3或13-18任意一項的EHV-4，其特徵在於相應於Telford位置(1998)的gM編碼序列92715-93824位的核苷酸被去除。
20.權利要求1-3或13-19任意一項的EHV-4，其特徵在於它是基於EHV-4 MSV Lot 071398的重組突變體。
21.權利要求1-3或13-20任意一項的EHV-4，其特徵在於它是基於MSVLot 071398株和E4ΔgM-w分離株的，並且它是保藏在ECACC/CAMR，保藏日期為2003年01月14日，保藏號為03011401的EHV-4。
22.編碼權利要求1-21任意一項的EHV的核酸。
23.包含權利要求1-21任意一項的EHV的疫苗製品。
24.包含權利要求22的核酸的疫苗製品。
25.權利要求1-21任意一項的EHV在製備預防和/或治療EHV相關疾病藥物中的應用。
26.權利要求22的核酸在製備預防和/或治療EHV相關疾病藥物中的應用。
27.一種預防和/或治療動物的方法，其特徵在於對所述動物施用權利要求23或24的疫苗製品，且監測其治療效果。
28.包含至少一種權利要求1-12任一項所述的EHV-1和至少一種權利要求1-3或13-21任一項所述的EHV-4的疫苗製品。
29.至少一種權利要求1-12任一項所述的EHV-1和至少一種權利要求1-3或13-21任一項所述的EHV-4在製備治療EHV相關疾病藥物中的應用。
30.一種預防和/或治療動物的方法，其特徵在於對所述動物施用權利要求28的疫苗製品，且監測其治療效果。
31.獲得重組EHV的方法，包括以下步驟a)分離野生型EHV；b)任選與側翼序列，構建編碼EHV gM基因的質粒；c)構建表達gM或部分gM的補足細胞系；d)在編碼gM的質粒中插入GFP編碼框，將該編碼gM的質粒與EHV核酸共轉染至步驟b)構建的補足細胞系中，以獲得含有GFP編碼框插入至其gM編碼序列的EH病毒；e)除去GFP編碼框；和f)篩選GFP編碼框被成功去除的EHV克隆。
32.權利要求31方法中使用的細胞系，其特徵在於所述細胞系中轉入了蛋白gM編碼基因，並且所述細胞系表達蛋白gM。
33.權利要求32的細胞系，其特徵在於細胞系選自Vero細胞，RK-13，以及cc組成的組。
34.權利要求31-33任意一項的細胞系，其特徵在於它是gM補足細胞系VERO GM，其保藏在ECACC/CAMR，保藏日期為2003年01月28日，保藏號是03012801。
全文摘要
本發明涉及動物健康領域，特別是涉及編碼gM蛋白的基因缺失且不含異源成分的馬皰疹病毒(EHV)。本發明進一步涉及包含所說病毒的藥用組合物及其應用，以及預防和治療EHV感染的方法。本發明也涉及包含EHV－1和EHV－4病毒的藥用組合物，其中編碼gM蛋白的基因缺失，並且不含有異源成分。
文檔編號C07K14/03GK1668736SQ03817221
公開日2005年9月14日 申請日期2003年7月16日 優先權日2002年7月19日
發明者安東尼·紐鮑爾, 克裡斯蒂娜·齊格勒 申請人:貝林格爾·英格海姆維特梅迪卡有限公司