一種新型靶向核酸分子的捕獲與富集技術的製作方法

2023-10-07 13:32:49 2

一種新型靶向核酸分子的捕獲與富集技術的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種新型的靶向核酸分子的捕獲與富集技術，靶向核酸分子片段通過與特異的捕獲探針雜交，而標記有丙烯醯胺基團的探針分子被固定在丙稀醯胺膠中，從而將靶向核酸分子片段捕獲下來。該技術可用於微生物群落功能基因捕獲與高通量測序分析，人類基因組中疾病相關基因的釣取與高通量測序分析，環境病原微生物特徵序列釣取與分析；另外，還可用於多種分子疾病與病原微生物診斷試劑盒的開發。本發明成本較低，並且丙烯醯胺分子膠連效率遠遠高於磁珠與探針之前的連接效率，因此捕獲效率也大大提高。
【專利說明】一種新型靶向核酸分子的捕獲與富集技術
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物【技術領域】，特別是涉及一種核酸分子的捕獲與富集技術。
【背景技術】
[0002]新一代高通量測序儀的出現大大降低了核酸測序成本，採用高通量測序儀，短短幾年內測序了大量的核酸序列，多種生物的全基因組被測序，很多個人基因組也得到測序。人類全基因組測序是高通量測序儀重要的應用。但是，多數研究與診斷目標只需要測序大量樣本中的某一特定片段。例如，對於人類基因組來說，外顯子是蛋白質編碼區域，而外顯子只佔全基因組的大約1%。大部分情況下，特別是對於疾病相關外顯子突變的篩選，只測外顯子區域就足夠了。另外，越來越多的研究發現，微生物群落的宏基因組功能基因的分析與多種人類重大疾病、環境汙染、大氣溫室效應等密切相關，而宏基因組是一個非常龐大的數據，人類腸道微生物群落宏基因組是人類基因組的100倍，不同人、同一個人不同的生理時期都具有不同的微生物群落組成，但在這些龐大的微生物群落中，起到關鍵作用的往往只有部分功能基因，對於一個微生物群落，只需要對少量的功能基因進行測序就可以達到分析的目的。
[0003]大量分子進行靶向平行分析，需要發展核酸捕獲技術，目前已有報導和市場化捕獲產品主要有兩種，第一種是基於高通量雜交分析晶片的捕獲與富集。這種方法首先是成本較高。高通量雜交晶片本身是一個非常昂貴的技術，某些晶片雜交分析成本高於目前的高通量測序分析成本，如果以這種昂貴的晶片進行富集與捕獲目標分子，然後再進行測序分析，成本較高；採用高通量晶片進行捕獲與富集目標分子的第二個弊端是捕獲效率較低，晶片與捕獲片段雜交的方式是固相雜交，固相分子雜交的雜交效率較低。目前市場上第二種捕獲方法是基於液相分子雜交與磁珠分尚方法，該方法首先進行一步液相雜交，然後將探針上標記的一個基團與磁珠 上的一個特異基團共價連接，將捕獲分子與磁珠連接在一起，磁珠通過磁場的作用，將捕獲片段與非特異片段分離出來。該方法與第一種方法相比，捕獲效率與成本都得以降低。但是，由於該方法需要一步共價連接，連接效率直接影響著捕獲與富集產率，另外，由於探針標記價格較高，所以捕獲成本仍然較高。

【發明內容】

[0004]針對上述現有技術中存在的問題，本發明提供了一種新型靶向核酸分子的捕獲與富集技術。
[0005]本發明採用的一個技術方案是:
提供一種新型靶向核酸分子的捕獲與富集技術，包括以下操作步驟:
1)將待捕獲核酸分子片段化，切膠回收200bp-500bp的核酸分子片段，連接通用接頭，形成靶向核酸分子片段；
2)將步驟I)的靶向核酸分子片段與捕獲探針及雜交液混合，完成雜交反應，所述捕獲探針修飾有丙烯醯胺化學基團；3)向步驟2)形成的混合溶液中加入丙烯醯胺貯存液、過硫酸銨和TEMED，形成丙烯醯胺溶液，並將所述丙烯醯胺溶液置於丙烯醯胺膠成型裝置的一端，待完全凝固後形成丙烯醯胺膠，並在所述丙烯醯胺膠成型裝置的兩端充入導電膠體；
4)將經步驟3)之後的丙烯醯胺膠置於電泳槽的TBE電泳液中，電泳去除其中的非特異片段；
5)將經步驟4)反應之後的丙烯醯胺膠置於變性電泳溶液中，變性電泳將靶向核酸分子片段與捕獲探針分離，並且所述靶向核酸分子片段隨電流集聚在一段導電膠體中；
6)收集步驟5)中導電膠體中的靶向核酸分子片段，進行高通量測序分析。
[0006]在本發明一個較佳實施例中，所述待捕獲核酸分子是單雙鏈線形或單雙鏈環形的DNA 或 RNA。
[0007]在本發明一個較佳實施例中，所述捕獲探針是單鏈DNA、RNA、PNA或LNA。
[0008]在本發明一個較佳實施例中,所述捕獲探針5』端、3』端或任意鹼基上修飾任意個數的丙烯醯胺化學基團。
[0009]在本發明一個較佳實施例中，步驟3)中所述丙烯醯胺貯存液中丙烯醯胺與N, N ;-亞甲雙丙烯醯胺的質量比為19:1或29:1。
[0010]在本發明一個較佳實施例中，所述丙烯醯胺膠成型裝置為非導電材料製成，包括塑料軟管、玻璃溝槽或玻璃管。
[0011]在本發明一個較佳實施例中，所述丙烯醯胺溶液質量體積比濃度為2%_6%。
`[0012]在本發明一個較佳實施例中，所述丙烯醯胺膠成型裝置的兩端充置的導電膠體為任意導電的、對核酸分子有過濾或吸附作用的材料。
[0013]在本發明一個較佳實施例中，所述導電膠體為瓊脂糖膠。
[0014]在本發明一個較佳實施例中，步驟5)中的所述變性電泳溶液為鹼性溶液，包括NaOH溶液、KOH溶液或Ca (OH) 2溶液。
[0015]本發明的有益效果是:
(I)本發明一種新型靶向核酸分子的捕獲與富集技術，採用大量捕獲探針與靶向核酸分子片段結合，並將捕獲探針固定在丙烯醯胺膠上，通過跑膠去除其中的非特異片段，靶向核酸分子片段又可以通過變性電泳方法將其收集起來，使得靶向核酸分子片段得以富集，然後進入下一步的測序分析。微生物群落宏基因組龐大，本發明針可對感興趣的基因或片段進行富集，並進一步的分析。
[0016](2)本發明一種新型靶向核酸分子的捕獲與富集技術，採用的雜交體系為溶液內雜交，然後將雜交分子固定，以提高捕獲探針與靶向核酸分子片段的雜交效率。以往的研究報導，核酸分子捕獲多採用固液相分子雜交技術，也就是將探針分子固定在固相載體上，然後將被捕獲分子與探針雜交，被雜交捕獲的分子留下來進一步檢驗分析，沒有被雜交上去的分子被衝洗去除。相對於固液相分子雜交技術，液相分子雜交大大提高了分子之間的碰撞機會，提高分子之間的雜交效率，進一步提高了核酸分子的檢測靈敏度，也提高了病原微生物的檢測靈敏度。
[0017](3)本發明一種新型靶向核酸分子的捕獲與富集技術，採用丙烯醯胺膠固定捕獲探針與祀向核酸分子片段的雜交體，膠體對核酸分子的固定量較大，因此捕獲效率聞。膠體內的探針固定量可達8μΜ，我們多用的PCR弓丨物濃度為0.4 μΜ，膠體有這麼高的固定容量，多數探針及雜交體都被固定下來，因此具有較高的固定效率。目前，唯一採用溶液雜交的捕獲技術，是採用磁珠固定探針與雜交體。磁珠連接親合素，探針上連接生物素，這種親和素與生物素的連接效率雖高，但磁珠上的親合素(固相載體)與探針上的生物素(液相)之間的連接效率最高也只有30%的效率，多數雜交體無法因為連接不到磁珠上，而無法捕獲下來。
[0018](4)本發明一種新型靶向核酸分子的捕獲與富集技術，可採用原位固相單分子擴增的方法來擴大待檢測核酸分子的拷貝數，以提高了核酸分子捕獲量。當宏基因組中靶向核酸分子片段較少時，本發明可以採用原位擴增的方法增加目標片段數量。核酸分子擴增效率與被擴增分子與引物分子之間的碰撞機會呈正相關，理論上，PCR擴增反應可以將溶液中的單個分子擴增出來，但實際實驗操作過程中發現，PCR檢測的靈敏度是大於10000個分子。本發明在進行單分子擴增之前，首先通過電泳或沉澱等技術將非目標片段去除，剩餘的片段只有引物和目標分子，這樣大大增加了目標分子與引物之前的碰撞機會，也大大提高了目標分子的擴增效率。
[0019](5)本發明一種新型靶向核酸分子的捕獲與富集技術，採用原位固相單分子擴增方法增加目標核酸分子捕獲量，減少了核酸分子擴增的偏性，更宜於高通量測序定量分析目標片段的含量。常規的通用引物PCR擴增，由於模板分子序列及高級結構的不同，如GC含量低的片斷較容易被擴增，因此在大量片斷擴增過程中，最終的反應液中小片斷和GC含量低的片斷較多，而大片斷與GC含量高的片斷較少。擴增效率高的核酸模板分子會越來越多，而擴增效率低人模板分子增長速度會越來越小，最終採用基因晶片雜交技術檢測時，低擴增效率的分子幾乎檢測不到。本發明採用原位單分子擴增，在某一個擴增區域內，只有一個模板分子，這個模板在擴增過程中不受其他模板分子的影響，因此，每個模板分子的擴增效率差別較小，在採用核酸分子晶片雜交檢測時，能夠真實的反應原液中核酸分子模板數量，也就是微生物數量。
[0020](6)本發明一種新型靶向核酸分子的捕獲與富集技術，採用通用引物擴增，以提高擴增效率。多數報導採用多重PCR或多次PCR的方法來檢測多種微生物，多重PCR技術擴增的偏性較大，有些分子 較容易擴增，而有些分子基本擴增不出來；即使這樣，同時能擴增出來的核酸模板分子的數量也非常有限。多次PCR方法較為煩瑣，因此限制了核酸分子檢測的種類。本發明採用通用引物擴增，也就是將待擴增模板分子兩端接上接頭，不同模板分子具有相同的接頭，然後以接頭序列作為引物序列進行PCR擴增，這樣就提高了各種模板分子的擴增效率。
[0021](7)本發明一種新型靶向核酸分子的捕獲與富集技術中靶向核酸分子片段富集成本相對較低。本發明採用丙烯醯胺膠聚合的方法將探針固定在丙烯醯胺膠內，探針修飾一個丙烯醯胺分子，相比較其他固定方法及探針的修飾基團，成本相對便宜。不需要昂貴的抗體或者其他蛋白物質，使用的探針可一次合成，多次使用。加上本發明固定效率較高，相比較其他核酸分子的富集方法，成本較低。
[0022](8)本發明一種新型祀向核酸分子的捕獲與富集技術，大大降低樣本分析成本。多數宏基因組樣本基因組信息寵大，而我們感興趣的目標片段往往只佔宏基因組的很少比例(小於萬分之一)，多數信息對於我們分析宏基因組與疾病或其他性狀意議較小。然而目前的測序成本仍然較高，採用本發明可以將目標片段捕獲出來進行測序分析，大大降低分析成本。由於宏基因組信息量大，目標片段含量相對較小，所以對於捕獲技術要求較高。本發明基於膠固定技術固定效率高等特點，實現了宏基因組目標片段的捕獲與富集。本發明不僅降低了 DNA的測序成本，同時還降低了樣本的人工分析費用。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0023]圖1是本發明的工作原理圖；
其中a:打碎成200-500bp的非靶向核酸分子片段； b:打碎成200-500bp的靶向核酸分子片段； c:連接有接頭的非祀向核酸分子片段； d:連接有接頭的靶向核酸分子片段； e =Linker-PCR擴增後的PCR產物； f:標記有化學基團的探針； g:探針和靶向核酸分子片段的雜交體；
h:固定連接有探針和靶向核酸分子片段雜交體以及非靶向核酸分子片段的膠體；1:去除了非靶向核酸分子片段之後的固定連接有探針和靶向核酸分子片段雜交體的膠體；
j:核酸分子序列分析儀。
【具體實施方式】
[0024]下面結合附圖對本發明的較佳實施例進行詳細闡述，以使本發明的優點和特徵能更易於被本領域技術人員理解，從而對本發明的保護範圍做出更為清楚明確的界定。
[0025]參閱圖1，其中步驟I為靶向核酸分子片段和非靶向核酸分子片段連接通用接頭，步驟2為Linker-PCR，步驟`3為探針與靶向核酸分子片段在雜交液中雜交，步驟4為通過探針上的化學基團將靶向核酸分子片段與探針的雜交體連接固定在固相膠體中，步驟5為採用電泳等技術將非靶向核酸分子片段去除，步驟6為捕獲靶向核酸分子片段並進入下一步的高通量測序分析。
[0026]實施例1採用聚丙烯醯胺膠捕獲技術與高通量測序儀靶向分析腸道微生物宏基因組中多種功能基因分布:
(I)探針的設計與製備
腸道微生物功能基因DNA序列片段選擇:採用Mega或Clustal W等軟體，進行生物信息學比較，完成2萬個功能基因核酸序列的選擇。
[0027]探針的設計:採用primerf.0等軟體，針對微生物特異片段設計探針。
[0028]探針的合成與標記:探針採用DNA合成儀進行合成，所有探針合成後，進行5』端標
記一個丙烯醯胺基團。
[0029](2)腸道微生物群落宏基因組提取、基因組片段化及兩邊接上接頭
腸道微生物群落宏基因組DNA提取:採集200mg新鮮大便，PBS懸浮大便中的腸道微生物，然後離心收集微生物，進一步採用溶菌酶等試劑提取微生物群落中的宏基因組DNA。
[0030]基因組DNA的超聲波處理:選取功率適當的超聲波儀，將基因組DNA隨機打斷成200bp-500bp大小的基因片段。
[0031]基因組DNA片段兩端與通用連接子連接(處理方法同專利申請號CN200610098379.X):將超聲波獲取的隨機片斷純化處理，去除一些小的和破碎的片斷，然後分別採用T4多聚核苷酸激酶、T4 DNA聚合酶、Klenow大片段DNA聚合酶I以及Taq聚合酶處理，使隨機片段產生一個TA粘性末端，然後與一個通用連接子(Iinkerl:5』 -GTCGGAGGCCAAGGCGGCCGT 3』 linker2:5』 -CGCCTTGGCCTCCGACT-3』)連接，使基因組片斷兩端連接上兩個通用連接子。連接產物經QIAquick純化試劑盒(QIAGEN)純化後待用。
[0032](3 ) Linker-PCR 擴增
為了儘量避免易擴增片段被大量擴增，PCR的循環數為20-26個。反應體系為100 μ 1，其中含有IX反應緩衝液，2.5 mM的Mg2+，0.4 μ M的與連接子互補的引物，4U的Taq DNA聚合酶，5% 的 DMSO 及 200 μΜ 的 dNTP。在 Gene Amp 2400 PCR System 上進行如下 PCR 擴增:95 °C預變性4分鐘，然後95 °C變性I分鐘，70 V復性2分30秒，72 °C延伸30秒，最後，72°C再延伸10分鐘。PCR產物純化後備用。
[0033](4)兩端連接有接頭的基因組與探針雜交並固定於聚丙烯醯胺凝膠
將製備的帶有通用引物的PCR產物與雜交液(Telechem)按3:1混合，95°C變性5分鐘，然後快速冷卻到室溫。把雜交溶液與丙烯醯胺溶液混合，其中，丙烯醯胺單體(29:1，w/w丙烯醯胺:雙丙烯醯胺)終濃度為2% (w/v)，過硫酸銨(APS)為1% (w/v)，TEMED(N, N, N' ,N' -tetramethy I ethylene diamine)為 0.5%。將上述混合液灌注於透明塑料軟管(直徑約為長為15cm -20cm) 一端,等膠體凝固後,將的另一端灌註上2%的瓊脂糖溶液，丙烯醯胺膠與瓊脂糖膠之間不能有氣泡。
[0034](5)電泳去除非特異片段，變性電泳收集目標片段
去除非特異片段:將裝有凝膠的塑料軟管置平板電泳槽中，軟管的兩端插在兩極凹槽的電泳液(IXTBE)中，電流 只從軟管中的凝膠通過。電流為100 mA電泳時間10分鐘。
[0035]目標片段收集:將電泳槽兩端凹槽中的電泳液更換為0.1M NaOH溶液，將去除了非特異片段的塑料軟管置於兩邊NaOH溶液中，進行電泳，電流為100 mA,電泳10分鐘。根據DNA指示劑，切下目標片段瓊脂糖膠，提取目標片段，凍存備用。
[0036](6 )通用弓丨物PCR擴增
反應體系為50 μ 1，其中含有IX反應緩衝液，2.5 mM的Mg2+，0.4 μ M的與連接子互補的引物，2U 的 Taq DNA 聚合酶，5% 的 DMSO 及 200 μΜ 的 dNTP。在 Gene Amp 2400 PCRSystem上進行如下PCR擴增:95°C預變性4分鐘，然後95°C變性I分鐘，70°C復性2分30秒，72 °C延伸30秒，最後，72 °C再延伸10分鐘，PCR循環數為35，PCR產物純化後備用。
[0037](7)高通量測序儀測序分析目標片段
將上述目標片段分別進行高通量測序儀測序分析，並進行生物信息學分析。
[0038]實施例2採用聚丙烯醯胺凝膠捕獲與高通量測序儀進行人類基因組中癌症相關基因外顯子突變的靶向分析:
(I)探針的設計與製備
癌症相關基因外顯子核酸序列選擇:採用Mega或Clustal W等軟體，進行生物信息學比較，完成1000個功能基因核酸序列的選擇。
[0039]探針的設計:採用primerf.0等軟體，針對微生物特異片段設計探針。
[0040]探針的合成與標記:探針採用DNA合成儀進行合成，所有探針合成後，進行5』端標
記一個丙烯醯胺基團。[0041](2)腸道微生物群落宏基因組提取、基因組片段化及兩邊接上接頭
人類基因組DNA提取:採集2ml靜脈血，採用紅細胞裂解和蛋白酶K消化，酚-氯仿方法抽提人類基因組DNA。
[0042]基因組DNA的超聲波處理:選取功率適當的超聲波儀，將基因組DNA隨機打斷成200bp-500bp大小的基因片段。
[0043]基因組DNA片段兩端與通用連接子連接(處理方法同專利申請號CN200610098379.X):將超聲波獲取的隨機片斷純化處理，去除一些小的和破碎的片斷，然後分別採用T4多聚核苷酸激酶、T4 DNA聚合酶、Klenow大片段DNA聚合酶I以及Taq聚合酶處理，使隨機片段產生一個TA粘性末端，然後與一個通用連接子(Iinkerl: 5』 -GTCGGAGGCCAAGGCGGCCGT 3』 linker2: 5』-CGCCTTGGCCTCCGACT-3』)連接，使基因組片斷兩端連接上兩個通用的連接子。連接產物經QIAquick純化試劑盒(QIAGEN)純化後待用。
[0044](3) Linker-PCR 擴增
為了儘量避免易擴增片段被大量擴增，PCR的循環數為20-26個。反應體系為100 μ 1，其中含有IX反應緩衝液，2.5 mM的Mg2+，0.4 μ M的與連接子互補的引物，4U的Taq DNA聚合酶，5% 的 DMSO 及 200 μΜ 的 dNTP。在 Gene Amp 2400 PCR System 上進行如下 PCR 擴增:95 °C預變性4分鐘，然後95 °C變性I分鐘，70 V復性2分30秒，72 °C延伸30秒，最後，72°C再延伸10分鐘。PCR產物純化後備用。
[0045](4)兩端連接有接頭的基因組與探針雜交並固定於聚丙烯醯胺膠
將製備的帶有通用引物的PCR產物與雜交液(Telechem)按3:1混合，95°C變性5分鐘，然後快速冷卻到室溫。把雜交溶液與丙烯醯胺溶液混合，其中，丙烯醯胺單體(19:1，w/w丙烯醯胺:雙丙烯醯胺)終濃度為6% (w/v)，過硫酸銨(APS)為1% (w/v) , TEMED(N, N, N' ,N' -tetramethy I ethylene diamine)為 0.5%。將上述混合液灌注於透明塑料軟管(直徑約為長為15cm -20cm) 一端,等膠體凝固後,將的另一端灌註上2%的瓊脂糖溶液，丙烯醯胺膠與瓊脂糖膠之間不能有氣泡。
[0046](5)電泳去除非特異片段，變性電泳收集目標片段
去除非特異片段:將裝有凝膠的塑料軟管置平板電泳槽中，軟管的兩端插在兩極凹槽的電泳液(IXTBE)中，電流只從軟管中的凝膠通過。電流為100 mA電泳時間10分鐘。
[0047]目標片段收集:將電泳槽兩端凹槽中的電泳液更換為0.1M NaOH溶液，將去除了非特異片段的塑料軟管置於兩邊NaOH溶液中，進行電泳，電流為100 mA,電泳10分鐘。根據DNA指示劑，切下目標片段瓊脂糖膠，提取目標片段，凍存備用。
[0048](6 )通用弓丨物PCR擴增
反應體系為50 μ 1，其中含有IX反應緩衝液，2.5 mM的Mg2+，0.4 μ M的與連接子互補的引物，2U 的 Taq DNA 聚合酶，5% 的 DMSO 及 200 μΜ 的 dNTP。在 Gene Amp 2400 PCRSystem上進行如下PCR擴增:95°C預變性4分鐘，然後95°C變性I分鐘，70°C復性2分30秒，72°C延伸30秒，最後，72°C再延伸10分鐘。PCR循環數為35。PCR產物純化後備用。
[0049](7)高通量測序儀測序分析目標片段
將上述目標片段分別進行高通量測序儀測序分析，並進行生物信息學分析。
[0050]實施例3採用聚丙烯醯 胺凝膠捕獲與高通量測序儀靶向進行食品中微量病原微生物種類分析:(I)探針的設計與製備
菌種特異DNA序列片段選擇:採用Mega或Clustal W等軟體，進行生物信息學比較，完成100種以上食品病原微生物特異基因的選擇。
[0051]探針的設計:採用primer5.0等軟體,針對微生物特異片段設計探針。
[0052]探針的合成與標記:探針採用DNA合成儀進行合成，同時在5』端標記一個丙烯醯
胺基團。
[0053](2)病原微生物基因組提取、基因組片段化及兩邊接上接頭
病原微生物基因組DNA提取:採集冷卻肉及經屠宰加工後的鴨肉系列產品，用無菌棉拭子進行六面50cm2取樣，然後將棉拭子上的微生物用PBS衝洗下來，HOOOrpm離心10分鐘，分離微生物。採用試劑盒或本研究室優化後的微生物DNA抽提方法，進行微生物全基因組DNA抽提。
[0054]基因組DNA的超聲波處理:選取功率適當的超聲波儀，將基因組DNA隨機打斷成200bp-500bp大小的基因片段。
[0055]基因組DNA片段兩端與通用連接子連接(處理方法同專利申請號CN200610098379.X):將超聲波獲取的隨機片斷純化處理，去除一些小的和破碎的片斷，然後分別採用T4多聚核苷酸激酶、T4 DNA聚合酶、Klenow大片段DNA聚合酶I以及Taq聚合酶處理，使隨機片段產生一個TA粘性末端，然後與一個通用連接子(Iinkerl: 5』 -GTCGGAGGCCAAGGCGGCCGT 3』 linker2: 5』-CGCCTTGGCCTCCGACT-3』)連接，使基因組片斷兩端連接上兩個通用的連接子。連接產物經QIAquick純化試劑盒(QIAGEN)純化後待用。
`[0056](3 )通用弓丨物PCR擴增
為了儘量避免易擴增片段被大量擴增，PCR的循環數為20-26個。反應體系為100 μ 1，其中含有IX反應緩衝液，2.5 mM的Mg2+，0.4 μ M的與連接子互補的引物，4U的Taq DNA聚合酶，5% 的 DMSO 及 200 μΜ 的 dNTP。在 Gene Amp 2400 PCR System 上進行如下 PCR 擴增:95 °C預變性4分鐘，然後95 °C變性I分鐘，70 V復性2分30秒，72 °C延伸30秒，最後，72°C再延伸10分鐘。PCR產物純化後備用。
[0057](4)兩端連接有接頭的基因組與探針雜交並固定於聚丙烯醯胺凝膠
將製備的帶有通用引物的PCR產物與雜交液(Telechem)按3:1混合，95°C變性5分鐘，然後快速冷卻到室溫。把雜交溶液與丙烯醯胺溶液混合，其中，丙烯醯胺單體(29:1，w/w丙烯醯胺:雙丙烯醯胺)終濃度為2% (w/v)，過硫酸銨(APS))為1% (w/v) , TEMED(N, N, N' ,N' -tetramethy I ethylene diamine)為 0.5%。將上述混合液灌注於透明塑料軟管(直徑約為長為15cm -20cm) 一端,等膠體凝固後,將的另一端灌註上2%的瓊脂糖溶液，丙烯醯胺膠與瓊脂糖膠之間不能有氣泡。
[0058](5)電泳去除非特異片段，變性電泳收集目標片段
去除非特異片段:將裝有凝膠的塑料軟管置平板電泳槽中，軟管的兩端插在兩極凹槽的電泳液(IXTBE)中，電流只從軟管中的凝膠通過。電流為100 mA電泳時間10分鐘。
[0059]目標片段收集:將電泳槽兩端凹槽中的電泳液更換為0.1M NaOH溶液，將去除了非特異片段的塑料軟管置於兩邊NaOH溶液中，進行電泳，電流為100 mA,電泳10分鐘。根據DNA指示劑，切下目標片段瓊脂糖凝膠，提取目標片段，凍存備用。
[0060](6 )通用弓丨物PCR擴增反應體系為50 μ 1，其中含有IX反應緩衝液，2.5 mM的Mg2+，0.4 μ M的與連接子互補的引物(其中一條引物5』端修飾一個螢光分子)，2U的Taq DNA聚合酶，5%的DMSO及200μΜ的dNTP。在Gene Amp 2400 PCR System上進行如下PCR擴增:95°C預變性4分鐘，然後95 °C變性I分鐘，70 V復性2分30秒，72 °C延伸30秒，最後，72 °C再延伸10分鐘。PCR循環數為35。PCR產物純化後備用。
[0061](7)基因晶片法進行病原微生物鑑定
基因晶片的製備:①探針製備:針對待檢測分析基因，設計基因晶片探針，探針的5』端修飾一個氨基化學基團。②醛基玻片製備:選擇大小合適的低螢光背景的全反射玻片，衝洗表面。將衝洗過的玻片置於盛有去離子水的燒杯，超聲清洗1-2小時。將超聲洗滌後的玻片放置在含有10% NaOH溶液的封閉的容器中浸泡30分鐘。最後用去離子蒸餾水再次徹底清洗、烘乾備用；洗漆乾淨的載玻片置於含有10% Alfa AesarC3-methacryloxypropyltrimethoxysilane)的丙酮溶液中浸泡I小時，用丙酮和去離子蒸懼水徹底清洗各兩次，氮氣吹乾，烘乾備用。③探針固定於醛基玻片:將氨基修飾的探針點樣於玻片，然後進行氨基醛基的縮合反應，共價鍵將探針連接在玻片上。
[0062]基因晶片法進行病原微生物鑑定:將上述PCR產物與晶片雜交反應，雜交後的玻片進行掃描儀掃描檢測螢光信號，分析病原微生物種類。
[0063]以上所述僅為本發明的實施例，並非因此限制本發明的專利範圍，凡是利用本發明說明書及附圖內容所作的等效結構或等效流程變換，或直接或間接運用在其他相關的【技術領域】，均同理包括在本發`明的專利保護範圍內。
【權利要求】
1.一種新型靶向核酸分子的捕獲與富集技術，其特徵在於，包括以下操作步驟: 1)將待捕獲核酸分子片段化，切膠回收200bp-500bp的核酸分子片段，連接通用接頭，形成靶向核酸分子片段； 2)將步驟I)的靶向核酸分子片段與捕獲探針及雜交液混合，完成雜交反應，所述捕獲探針修飾有丙烯醯胺化學基團； 3)向步驟2)形成的混合溶液中加入丙烯醯胺貯存液、過硫酸銨和TEMED，形成丙烯醯胺溶液，並將所述丙烯醯胺溶液置於丙烯醯胺膠成型裝置的一端，待完全凝固後形成丙烯醯胺膠，並在所述丙烯醯胺膠成型裝置的兩端充入導電膠體； 4)將經步驟3)之後的丙烯醯胺膠置於電泳槽的TBE電泳液中，電泳去除其中的非特異片段； 5)將經步驟4)反應之後的丙烯醯胺膠置於變性電泳溶液中，變性電泳將靶向核酸分子片段與捕獲探針分離，並且所述靶向核酸分子片段隨電流集聚在一段導電膠體中； 6)收集步驟5)中導電膠體中的靶向核酸分子片段，進行高通量測序分析。
2.根據權利要求1所述的新型靶向核酸分子的捕獲與富集技術，其特徵在於，所述待捕獲核酸分子是單雙鏈線形或單雙鏈環形的DNA或RNA。
3.根據權利要求1所述的新型靶向核酸分子的捕獲與富集技術，其特徵在於，所述捕獲探針是單鏈DNA、RNA、PNA或LNA。
4.根據權利要求1或3所述的新 型靶向核酸分子的捕獲與富集技術，其特徵在於，所述捕獲探針5』端、3』端或任意鹼基上修飾任意個數的丙烯醯胺化學基團。
5.根據權利要求1所述的新型靶向核酸分子的捕獲與富集技術，其特徵在於，步驟3)中所述丙烯醯胺貯存液中丙烯醯胺與N，N '-亞甲雙丙烯醯胺的質量比為19:1或29:1。
6.根據權利要求1所述的新型靶向核酸分子的捕獲與富集技術，其特徵在於，所述丙烯醯胺膠成型裝置為非導電材料製成，包括塑料軟管、玻璃溝槽或玻璃管。
7.根據權利要求1所述的新型靶向核酸分子的捕獲與富集技術，其特徵在於，所述丙烯醯胺溶液質量體積比濃度為2%-6%。
8.根據權利要求1所述的新型靶向核酸分子的捕獲與富集技術，其特徵在於，所述丙烯醯胺膠成型裝置的兩端充置的導電膠體為任意導電的、對核酸分子有過濾或吸附作用的材料。
9.根據權利要求8所述的新型靶向核酸分子的捕獲與富集技術，其特徵在於，所述導電膠體為瓊脂糖膠。
10.根據權利要求1所述的新型靶向核酸分子的捕獲與富集技術，其特徵在於，步驟5)中的所述變性電泳溶液為鹼性溶液，包括NaOH溶液、KOH溶液或Ca (OH) 2溶液。
【文檔編號】C12Q1/68GK103602658SQ201310480567
【公開日】2014年2月26日 申請日期:2013年10月15日 優先權日:2013年10月15日
【發明者】周東蕊, 張紅琳, 章愛娣, 肖鵬峰, 白志茂, 陸祖宏 申請人:東南大學