同步檢測向日葵黑莖病菌和向日葵莖潰瘍病菌的三重pcr引物及其擴增方法和用途的製作方法

2024-03-30 15:57:05 1

專利名稱：同步檢測向日葵黑莖病菌和向日葵莖潰瘍病菌的三重pcr引物及其擴增方法和用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及PCR技術檢測寄生於向日葵中向日葵黑莖病菌(Leptosphaerialindguistii)和向日葵莖潰瘍病菌(Diaporthe helianthi)的三重PCR引物及其擴增方法和用途，屬於菊科向日葵中向日葵黑莖病菌和向日葵莖潰瘍病菌檢測領域。
背景技術：
向日葵(Helianthus annuus)屬一年生草本植物,是我國五大油料作物之一，向日葵種植簡單、抗旱抗逆性強，依據其用途，分油用型、食用型和中間型3個類型。向日葵適應性強，對栽培環境條件要求不高，較之玉米、大豆更能適應惡劣氣候。向日葵是近年來世界上發展很快的一種新興油料作物，由於其含油率高達5 0%以上，品質好等優點成為食品加工、化工、燃料工業、飼料加工業和醫藥等原料，其市場前景無限廣闊(曹孟梁.國內向日葵 發展概況及經濟價值.山西農業，2008, (16) : 19-20)。目前向日葵的平均產量僅1828kg/hm2，種子含油量僅25% 32%，，均遠低於現有栽培品種的生物學潛能，這主要是由於病害所致(冉俊祥.向日葵病害種類分布和防治.國外農學一向日葵，1991，(4) : 17)。近年來我國不斷從國外進口向日葵種子，僅2010年就達3082. 46噸，其中90%以上來自阿根廷、法國、美國等向日葵黑莖病、莖潰瘍疫區。2005年 2007年在新疆伊犁河谷發現並鑑定向日葵黑莖病為一種蔓延迅速、危害嚴重的向日葵病害(陳衛民等.國內新病害一向日葵莖點黴黑莖病在新疆伊犁河谷的發生初報.雲南農業大學報，2008，23(5) :610-612)。2010年，天津口岸在來自阿根廷、法國的向日葵種子中，檢出檢疫性有害生物向日葵黑莖病菌Leptosphaerialindguistii (Luo JF et al.,Detection and identification of Phoma macdonaldii in sunflower seeds importedfrom Argentina. AustralasianPlant Pathology, 2011, 40 (5) : 504-509),這是國內首次自進境向日葵種子中截獲向日葵黑莖病菌，由於其對向日葵的嚴重危害，質檢總局發布警示通報，與農業部於2010年聯合發布公告將其列入進境植物檢疫性有害生物名錄，並指定天津局制定行業標準。向日葵黑莖病菌(L. lindguistii)和向日葵莖潰瘍病菌(D. Helianthi)是向日葵上寄生的兩種重要檢疫性真菌病害。L. lindguistii無性態為莖點黴屬Phoma，D. helianthi為擬莖點黴屬PhomopsiS。1987年Aerette和Gulga首次報導了該病的發生，以及病原菌的分離、鑑定與回接等，向日葵黑莖病發病初期在向日葵葉柄基部出現黑色斑點，並迅速沿莖杆擴展至整個植株，導致小、空、癟的向日葵籽產生，使種子產量和油產量嚴重降低，早期發病植株枯死，發病較晚者則矮化瘦弱，倒伏，重病田發率100%，死亡率達51%以上。1980年首次在南斯拉夫發現和鑑定的向日葵莖潰瘍病菌(Muntanola-CvetkovicMet al. , On the identity of the causative agentof a serious Phomopsis Diaporthedisease in sunflower plants. NovaHedwigia, 1981，34:417-435),隨後在法國和美國也發現此病害，主要侵染植株的葉部、莖部、頭狀花序，葉片病斑棕色或黑色，可致莖杆萎蔫、乾枯變黑，葵盤發育不良，不能形成成熟的種子或致乾枯敗育。1984年法國出現此病害後，損失達田間向日葵作物總量的40%左右。隨著經濟全球化進程的加快和我國對外開放的深入發展，農產品進出口數量日益增大，檢疫有害生物傳入我國風險也逐年增加(商鴻生等，向日葵的檢疫性有害生物.植物檢疫，2001，15(3) : 152-154)。向日葵作為一種重要的油料作物和食用產品，可傳帶多種有害生物，近年來，我國從國外引進大量向日葵種子，有害生物傳入我國的風險很大，對我國的向日葵種植業極為不利。常規生物學檢測方法是種子帶菌檢測(陳衛民等，向日葵黑莖病種子帶菌檢測初步研究.《中國植物病理學會2008年學術年會論文集》，2008)，經過分離培養可通過肉眼直觀菌落、分生孢子器、分生孢子等形狀顏色來鑑定真菌病害。由於從不同地理位置感染病原菌的植株及不同時間分離得到的L. lindguistii和D. helianthi,難免在L，lindguistii和D. helianthi菌落形態上存在交叉重疊且有時需延長菌株培養時間達20天左右才能誘激產生分生孢子器，此種情況下不僅耗時費力，且很難根據菌落形態準確、快速、有效地鑑定出兩種病原菌，從而造成檢疫人員的漏檢和誤檢，且不能滿足口岸「快驗快放」的要求，從而錯過病害最佳防治時期，導致病害在田間肆虐發展。2010 年，天津出入境檢驗檢疫局動植食中心在來自阿根廷向日葵種子首次截獲檢疫有害真菌L. lindguistii ;2011年,又在法國進境向日葵種子中截獲L. lindguistii。因此,加強對口岸進境向日葵攜帶有害生物快速、準確的檢測顯得極為重要，對保護和促進我國向日葵產業健康發展具有十分重要的現實意義。

發明內容
本發明所要解決的技術問題是設計同步檢測向日葵上向日葵黑莖病菌和向日葵莖潰瘍病菌的三重PCR引物，包括向日葵黑莖病菌的特異引物和向日葵莖潰瘍病菌特異引物，與文獻提供的通用引物對ITS1/ITS4，建立同步檢測向日葵上向日葵黑莖病菌和向日葵莖潰瘍病菌的二重PCR引物及其擴增方法和用途。為了解決上述技術問題，本發明採用的技術方案是一種同步檢測向日葵黑莖病菌和向日葵莖潰瘍病菌的三重PCR引物，實現兩種檢疫性真菌病害同步分子檢測的特異引物，序列如下向日葵黑莖病菌的特異引物LLF TAG CAT TGT TAG CCG AGGLLR CAG CCA GTC TTC TAG CTT GG向日葵莖潰瘍病菌的特異引物DHF CGA GAA ATC GTC CGT GATDHR ATA CGG TCG GAC AGA CCA所述LLF/LLR擴增片段為255bp，DHF/DHR擴增片段為394bp，特異引物用於向日葵黑莖病菌和向日葵莖潰瘍病菌的菌絲基因組DNA特異三重PCR擴增。還包括檢測向日葵黑莖病菌和向日葵莖潰瘍病菌的通用引物，序列如下ITSl TCC GTA GGT GAA CCT GCG GITS4 TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC所述引物用於向日葵黑莖病菌和向日葵莖潰瘍病菌菌絲基因組DNA擴增，擴增片段為560bp — 600bp，作為提取和擴增過程的質量監測。一種同步檢測向日葵黑莖病菌和向日葵莖潰瘍病菌的三重PCR引物的擴增方法，包括下述的擴增體系和擴增程序(I)擴增體系建立20μ L的擴增體系，包括IOXBuffer 2. O μ L，其中含終濃度為I. 5mmol/L 的 MgCl2 ;2. 5mmol/L dNTPs 為 2· O μ L ;0· 4 μ L Taq DNA 聚合酶，濃度 5U/μ L ;濃度為20 μ mol/L 的引物 ITS1/ITS4、LLF/LLR 和 DHF/DHR 依次為 I. O μ L/l. O μ L、0. 8 μ L/0. 8 μ L、0.6 μ L/0. 6 μ L ；DNA模板I. 5 μ L ;餘量為雙蒸水；(2)反應程序設立反應程序94°C預變性4min ;94°C變性30s，56°C復性20s，72°C延伸30s，40個循環；72°C延伸7min。上述同步檢測向日葵黑莖病菌和向日葵莖潰瘍病菌的三重PCR引物在檢測向日 葵黑莖病菌和向日葵莖潰瘍病菌方面的應用。本發明的有益效果是建立了方法簡便、重現性好的L. lindguistii和D. heIianth的三重PCR三重PCR引物，能將L. Iindguistii和D. heIianth區別開來。採用弓丨物監測實驗過程，避免假陰性。實現了在同一 PCR管中3組引物同步檢測L. lindguistii和
D.helianthi,該三重PCR檢測體系的建立簡化和方便了對L. lindguistii和D. helianthi的檢測，節約了試劑和時間，檢測快速、可靠，可有效在口岸檢測中推廣應用。



圖I是本發明菌絲基因組DNA三重PCR擴增。
具體實施例方式本發明的同步檢測檢疫性真菌病害向日葵黑莖病菌(L. Lindguistii)和莖潰瘍病菌(D. Helianthi)的三重 PCR 引物，實現同時檢測 L. lindguistii 和 D. Helianthi。( I)設計向日葵黑莖病菌和向日葵莖潰瘍病菌各自的特異引物，序列如下向日葵黑莖病菌的特異引物LLF TAG CAT TGT TAG CCG AGGLLR CAG CCA GTC TTC TAG CTT GG向日葵莖潰瘍病菌的特異引物DHF CGA GAA ATC GTC CGT GATDHR ATA CGG TCG GAC AGA CCALLF/LLR擴增片段為255bp，DHF/DHR擴增片段為394bp，這兩套特異引物用於向日葵黑莖病菌和向日葵莖潰瘍病菌的菌絲基因組DNA特異三重PCR擴增。(2)文獻報導的向日葵黑莖病菌和向日葵莖潰瘍病菌的通用引物，序列如下ITSl TCC GTA GGT GAA CCT GCG GITS4 TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC上述引物用於向日葵黑莖病菌和向日葵莖潰瘍病菌菌絲基因組DNA擴增，擴增片段為560bp — 600bp，作為提取和擴增過程的質量監測。本發明建立檢測向日葵黑莖病菌和向日葵莖潰瘍病菌的三重PCR引物及其擴增方法，包括擴增體系的建立及反應程序的設立。(I)擴增體系經過體系優化，建立20yL的擴增體系，包括IOXBuffer 2.0yL (其中含終濃度為 I. 5mmol/L 的 MgCl2) ；2. 5mmol/L dNTPs 為 2· O μ L ;0· 4 μ L TaqDNA 聚合酶(5U/μ L);濃度為 20 μ mol/L 的引物 ITS1/ITS4、LLF/LLR 和 DHF/DHR 依次為 I. O μ L/l. O μ L、0· 8 μ L/0. 8 μ L、0. 6 μ L/0. 6 μ L ；DNA 模板 I. 5 μ L (約為 40ng)，加雙蒸水至 20 μ L。(2)反應程序經過優化，設立反應程序94°C預變性4min ;94°C變性30s，56°C復性20s，72°C延伸30s, 40個循環；72°C延伸7min。本發明設計合成了 2套引物,包括自行設計的引物L. lindguistii和D. helianth的特異引物LLF/LLR和DHF/DHR。文獻報導的引物ITS1/ITS4對所有實驗材料菌絲DNA進行質量監測，避免檢測過程中的假陰性，3套引物對L. I indguisti i和D. Helianth進行三重PCR擴增。
所述同步檢測向日葵黑莖病菌和向日葵莖潰瘍病菌的三重PCR引物在檢測向日葵黑莖病菌和向日葵莖潰瘍病菌方面的應用。本發明建立了快速簡便、特異性強、靈敏度高、準確可靠的L. lindguistii和
D.Helianthi三重PCR分子檢測方法，能將L. lindguistii和D. Helianthi區別開來。該方法的建立為兩種檢疫性真菌病害的同步分子檢測提供了特異可行的方法，節約了試劑和時間，檢測快速、可靠，整個過程在一個工作日內完成，可有效在口岸檢測中推廣應用。下面結合附圖與具體實施方式
對本發明作進一步詳細說明實施例I :實驗材料菌絲的培養本實驗供試菌株包括L. lindguistii和D. helianth同屬菌株、莖點黴屬phoma和擬莖點黴屬phomopsis近似種及其他從向日葵上分離得到的真菌病害共計15個菌株(見表I)。實驗涉及的材料包括6株ATCC菌株購買於美國菌種保藏中心，wto2、4771_2為天津出入境檢驗檢疫局動植物與食品檢測中心從進境阿根廷、法國向日葵種子中截獲，L2-1、3-21、13-l、mx-l、T-l、a9、alO供試菌株為天津出入境檢驗檢疫局動植物與食品檢測中心從植株上分離培養獲得，供試材料的相關信息見表I。表I供試材料
權利要求
1.一種同步檢測向日葵黑莖病菌和向日葵莖潰瘍病菌的三重PCR引物，其特徵在於，實現兩種檢疫性真菌病害同步分子檢測的特異引物，序列如下 向日葵黑莖病菌的特異引物LLF TAG CAT TGT TAG CCG AGGLLRCAG CCA GTC TTC TAG CTT GG 向日葵莖潰瘍病菌的特異引物DHF CGA GAA ATC GTC CGT GATDHR ATA CGG TCG GAC AGA CCA 所述LLF/LLR擴增片段為255bp，DHF/DHR擴增片段為394bp，特異引物用於向日葵黑莖病菌和向日葵莖潰瘍病菌的菌絲基因組DNA特異三重PCR擴增。
2.根據權利要求I所述的同步檢測向日葵黑莖病菌和向日葵莖潰瘍病菌的三重PCR弓丨物，其特徵在於，還包括檢測向日葵黑莖病菌和向日葵莖潰瘍病菌的通用引物，序列如下ITSl TCC GTA GGT GAA CCT GCG GITS4 TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC 所述引物用於向日葵黑莖病菌和向日葵莖潰瘍病菌菌絲基因組DNA擴增，擴增片段為560— 600bp，作為提取和擴增過程的質量監測。
3.—種權利要求I所述的同步檢測向日葵黑莖病菌和向日葵莖潰瘍病菌的三重PCR引物的擴增方法，其特徵在於，包括下述的擴增體系和擴增程序 (1)擴增體系 建立20 μ L的擴增體系，包括IOXBuffer 2. O μ L，其中含終濃度為I. 5mmol/L的 MgCl2 ；2. 5mmol/L dNTPs 為 2. O μ L ;0· 4 μ L Taq DNA 聚合酶，濃度 5U/ μ L ;濃度為20 μ mol/L 的引物 ITS1/ITS4、LLF/LLR 和 DHF/DHR 依次為 I. 0 μ L/l. O μ L、0. 8 μ L/0. 8 μ L、O. 6 μ L/0. 6 μ L ；DNA模板I. 5 μ L ;餘量為雙蒸水； (2)反應程序 設立反應程序94°C預變性4min ;94°C變性30s，56°C復性20s，72°C延伸30s，40個循環；72°C延伸 7min。
4.如權利要求I所述同步檢測向日葵黑莖病菌和向日葵莖潰瘍病菌的三重PCR引物在檢測向日葵黑莖病菌和向日葵莖潰瘍病菌方面的應用。
全文摘要
本發明公開了一種同步檢測向日葵黑莖病菌和向日葵莖潰瘍病菌的三重PCR引物及其擴增方法和用途，涉及3套引物，即Leptosphaeria lindguistii和Diaporthe helianth通用引物，L.lindguistii特異引物和D.helianth特異引物。通用引物擴增序列作為所有菌株菌絲基因組DNA提取模板的質量監控，L.lindguistii特異引物和D.helianth特異引物針對L.lindguistii和D.helianthi兩個基因位點同時進行PCR擴增。L.lindguistii和D.helianth通用引物及各自特異引物可用於兩種菌的菌絲基因組DNA三重特異PCR擴增。
文檔編號C12Q1/68GK102943118SQ20121052394
公開日2013年2月27日 申請日期2012年12月6日 優先權日2012年12月6日
發明者廖芳, 郭京澤, 劉鵬, 羅加鳳, 李關榮, 黃國明 申請人:天津出入境檢驗檢疫局動植物與食品檢測中心