紅鯽與黃尾密鯝亞科間遠緣雜交的方法

2023-10-08 04:49:39

專利名稱：紅鯽與黃尾密鯝亞科間遠緣雜交的方法
技術領域：
本發明涉及魚類雜交方法，尤其涉及鯉科魚類中亞科間的遠緣雜交方法。
背景技術：
雜交技術是改良魚類性狀常用的方法，而親緣關係在種間或種間以上的雜交一般稱為遠 緣雜交。通過遠緣雜交後，雜交後代可以整合親本的優良性狀，使其可能在繁殖力、生長速 度、抗病力、體形、肉質等方面表現出雜交品種的優勢，進而使魚類的性狀得到改良。如紅 鯽與湘江野鯉的屬間遠緣雜交形成的雜交後代具有生長速度快、肉質鮮嫩、抗病力強、存活 率高等優點；紅鯽與團頭魴的亞科間遠緣雜交形成的雜交後代除具有鯽鯉雜交魚以上優點外， 體背還明顯增高，外形優美，具有良好的經濟效應。然而，遠緣雜交也存在雜交後代不可存 活或存活率較低等問題。
CN1108469A號中國專利文獻公開了一種以紅鯽魚為父本、以紅鯉等鯉魚為母本的雜交 和馴養方法，CN1135834A號中國專利文獻則公開了一種以紅鯽魚為父本、以錦鯉為母本的 雜交和馴養方法，這兩篇文獻公開的雜交方法中都是用相同亞科(鯉亞科)內的不同品種魚 作為父母本魚，且紅鯽均是作為父本魚進行雜交，雜交方法簡單，後代中性狀改良程度不顯著。
如何在現有的魚品種中挑選更加合適的父、母本親魚進行遠緣雜交，如何改進遠緣雜交 的方法和步驟，以獲得性狀更為優良、品種更加豐富、對遺傳研究和育種更具意義的新型雜 交魚，就成為本領域技術人員長期面臨和需要解決的問題。

發明內容
本發明要解決的技術問題是克服現有技術的不足，提供一種受精率高、孵化率高、操作 方便、能有效改善雜交後代性狀的紅鯽與黃尾密鯝亞科間遠緣雜交的方法，該方法在今後的 生物進化研究和遺傳育種等方面也具有非常重要的意義。
為解決上述技術問題，本發明提出的技術方案包括以下步驟首先選取性腺成熟、體徵 良好的紅鯽、黃尾密鯝分別作為雜交的母本親魚和父本親魚，在繁殖季節對所述的父、母本 親魚進行人工催產，再選擇催產效果良好的父、母本親魚進行人工幹法授精，授精完成後進 行流水自動孵化，待魚苗孵化完成後進行飼養，再對飼養後的魚苗進行檢測、篩分，獲得紅 鯽與黃尾密鯝雜交三倍體魚、紅鯽與黃尾密鯝雜交四倍體魚和天然雌核發育紅鯽。
具體來說，上述方法可按下述操作進行1) 親魚的挑選和培育在繁殖期前2 3個月挑選性成熟特徵明顯、體徵良好的雌性紅鯽 和雄性黃尾密鯝作為遠緣雜交的親魚進行專池培育，促進親魚性腺發育成熟；體徵良好的親 魚一般表現為體型好、體色鮮豔、體質健壯、無病無傷；
2) 人工催產在繁殖季節使水溫穩定在2(TC以上，然後先向母本親魚注射絨毛膜促性 腺激素(HCG)與地歐酮(DOM)的混合催產劑進行催產，所述絨毛膜促性腺激素的用量為 800 I000IU/kg，所述地歐酮的用量為3 6mg/kg;母本親魚注射後4 5h開始向父本親魚注 射所述混合催產劑，父本親魚的注射劑量減半；注射後按l : (1.5 2)的數量比將母、父本 親魚放入同一產卵池中直至其開始順利產卵和產精；注射時優選採用胸鰭基部無鱗處腹腔一 次性注射的方法，以提高親魚(特別是黃尾密鯝)的存活率；
3) 授精孵化挑選產卵量大的母本和產精量大的父本進行人工幹法授精，並將受精卵置 於水溫為22'C 25'C的孵化池中進行流水自動孵化；
4) 飼養魚苗全部孵出後，先於網箱中培育3 4天，待魚苗出現腰點、開始平遊、能夠 主動開口攝食後轉入池塘飼養，魚苗長成後進行檢測、篩分即可得到紅鯽與黃尾密鯝雜交三 倍體魚、紅鯽與黃尾密鯝雜交四倍體魚和天然雌核發育紅鯽。
紅鯽(Carassius auratus red var.)屬於鯉科、鯉亞科中的二倍體魚(2n=100)，黃尾密鯝 (Xenocypris davidi Bleeker)屬於鯉科、鯝亞科中的二倍體魚(2n=48)，黃尾密鯝具有內臟 少、食性雜、生長快、適應性強、易捕撈等特點，其肉質細嫩，味道鮮甜，含肉率高，營養 豐富，深受人們的青睞，但該魚的性情急躁，人工繁殖難度較大。我們通過反覆實驗最終選 擇紅鯽為母本，黃尾密鯝為父本，通過遠緣雜交方法獲得了性狀優良的紅鯽與黃尾密鯝雜交 魚和天然雌核發育紅鯽；相比同類雜交試驗，本發明的受精率和孵化率都得到了顯著提高， 獲得的雜交後代兼有親本的優良特徵，相比於其他種類父母本親魚得到的遠緣雜交後代，優 勢更加明顯。此外，紅鯽與黃尾密鯝雜交魚的父母本隸屬於不同的亞科，在遺傳、分類和體 形等生物學特性方面存在較大的差異，尤其是他們的體細胞染色體數目之間差異很大(紅鯽 的染色體數目為100，而黃尾密鯝的染色體數目為48)，而且不成倍性關係，因此遠緣雜交的 困難程度也比其他種類的雜交更大。在迄今國內外尚未出現紅鯽與黃尾密鯝亞科間遠緣雜交 成功的報導的情況下，本發明利用遠緣雜交和天然雌核發育方法成功獲得了紅鯽與黃尾密鯝 雜交三倍體魚、紅鯽與黃尾密鯝雜交四倍體魚和天然雌核發育紅鯽，這些新型雜交魚品種的 成功培育，在今後的生物進化研究和遺傳育種等方面具有非常重要的意義。


圖1為紅鯽(？) x黃尾密鯝(^)後代中四倍體魚的外形照片；圖2為紅鯽($) x黃尾密鯝(61)後代中四倍體魚的染色體圖(4n=148);
圖3為紅鯽($) x黃尾密鯝(3)後代中三倍體魚的外形照片；
圖4為紅鯽($) x黃尾密鯝(3)後代中三倍體魚的染色體圖(3n=124); 圖5為紅鯽(？) x黃尾密鯝(c )後代中天然雌核發育魚的外形照片； 圖6為紅鯽($) x黃尾密鯝(d)後代中天然雌核發育魚的染色體圖(2n=100)。
具體實施方式
實施例
一種本發明的紅鯽與黃尾密鯝亞科間遠緣雜交的方法，包括以下步驟
1) 親魚的挑選和培育在繁殖期前2 3個月挑選性成熟特徵明顯、體型好、體色鮮豔、 體質健壯、無病無傷的紅鯽和黃尾密鯝個體作為親魚進行專池培育，合理投餵飼料，保持池 水活爽，促進親魚性腺發育成熟；
2) 人工催產在上述親魚的繁殖季節(當年4月下旬至五月初)開始進行人工催產，先 使水溫穩定在2(TC以上，然後先向雌性親魚體內注射絨毛膜促性腺激素與地歐酮的混合催產 劑進行催產，其中絨毛膜促性腺激素的注射用量為800 1000IU/kg,地歐酮的注射用量為3 6mg/kg，向雌性親魚注射後4~5h再向雄性親魚注射該混合催產劑，雄性親魚的注射劑量減半； 上述注射均採用胸鰭基部無鱗處腹腔一次性注射方法，以儘量提高親魚(特別是黃尾密鯝) 的存活率；注射後將親魚按雌雄l : (1.5 2)的比例放入產卵池中，水面吊一紗窗網片，以 檢測親魚的發情產卵情況；在完全靜水條件下，經過6 8h後藥物開始發揮效用；
3) 授精孵化當發現親魚在產卵池中呈"螺旋狀"追逐、紗窗網片上沾有適量卵粒後，拉 網並開始打撈親魚進行檢測(注意要用軟質網，操作要輕，水中檢測)；挑選產卵順利的母本 和產精量大的父本，揩乾體表水分，將精卵擠入乾淨的瓷盆中，用乾淨的羽毛迅速不停地攪 拌2min 3min,然後鋪於浸入水中的2n^左右的網片之上，密度控制在1萬#勤112左右，於孵 化池中22'C 25'C水溫下流水自動孵化；
4) 飼養魚苗全部孵出後，先於網箱中培育3 4天，待其出現腰點、開始平遊、能夠主 動開口攝食後轉入池塘中用適口餌料進行詞養，可先用豆漿餵養1~2個星期，再換餵磨碎的 常規魚飼料，直至魚苗長到能正常攝食。
實驗證明，在紅鯽(？) x黃尾密鯝(d)組合中能夠產生存活的後代，其受精率和孵化 率分別為59.2%和48.7%，相比同類雜交試驗，其受精率和孵化率得到了顯著地提高。而其 反交組合紅鯽(c ) x黃尾密鯝($)不能產生存活的後代。
對上述長成後的魚苗進行檢測分析，發現在紅鯽(？) x黃尾密鯝(cp的雜交後代中出現有三種不同體色的雜交魚， 一種體色為青灰色(圖1所示的雜交後代魚)， 一種體色較深(圖 3所示的雜交後代魚)，還有一種體色呈紅色(圖5所示的雜交後代魚)。在體形上，前兩種 雜交後代魚兼有紅鯽和黃尾密鯝的特徵，例如它們的頭部偏像於黃尾密鯝，身體部位卻類似 於紅鯽，體形優美，肉質鮮嫩。而紅色雜交後代魚則頭小背高、尾巴短小，與圖1、圖3所 示的雜交後代魚存在較明顯的差異。
等魚苗長到適當大小(10g左右)的時候用腎細胞直接製片法對紅鯽(？) x黃尾密鯝(cp 雜交後代魚的體細胞染色體數目進行檢測。檢測後發現雜交後代中的青灰色魚為紅鯽(？) 與黃尾密鯝(3)的雜交四倍體魚(4n=148),染色體圖如圖2所示；體色較深的雜交魚為紅 鯽(？)與黃尾密鯝(3)的雜交三倍體魚(3n=124)，其染色體圖如圖4所示；體色為紅色 的雜交魚為天然雌核發育二倍體紅鯽(2ii=100)，其染色體圖如圖6所示。
腎細胞直接製片法的方法為在18'C 22'C水溫下培育實驗魚l 3d後，對實驗魚注射 PHA1次 3次，每次劑量為2 8ng/克體重，間隔時間為12 24h,在解剖取材前2 6h， 注射秋水仙素，劑量為2 4pg/克體重；取出腎組織，在生理鹽水下剪碎腎組織，0.075 mol/L KCL低滲處理，在2CTC溫度下低滲40 60min;用冰醋酸甲醇為1 : 3的混合液固定腎細 胞1 3次；在冰凍載玻片上滴片；Giemsa染液染色一個小時左右，然後鏡檢。
本實施例的方法利用雌性紅鯽與雄性黃尾密鯝進行亞科間遠緣雜交，為四倍體魚的形成 提供了新的途徑，也為生物的進化研究提供了新的證據。並且，有望進一步選育出可育的四 倍體個體，用其製備具有優良性狀的多倍體魚，以期產生顯著的經濟效益。另外，本實施例
獲得的天然雌核發育紅鯽為天然雌核發育魚的製備提供了新的方法和途徑。
本實施例方法製備的新型四倍體魚和天然雌核發育魚在生物進化和魚類遺傳育種方面具 有重要的生物學意義。
權利要求
1、一種紅鯽與黃尾密鯝亞科間遠緣雜交的方法，包括以下步驟首先選取性腺成熟、體徵良好的紅鯽、黃尾密鯝分別作為雜交的母本親魚和父本親魚，在繁殖季節對所述的父、母本親魚進行人工催產，再選擇催產效果良好的父、母本親魚進行人工幹法授精，授精完成後進行流水自動孵化，待魚苗孵化完成後進行飼養，再對飼養後的魚苗進行檢測、篩分，獲得紅鯽與黃尾密鯝雜交三倍體魚、紅鯽與黃尾密鯝雜交四倍體魚和天然雌核發育紅鯽。
2、 根據權利要求1所述的紅鯽與黃尾密鯝亞科間遠緣雜交的方法，其特徵在於具體包括 以下步驟1) 親魚的挑選和培育在繁殖期前2 3個月挑選性成熟特徵明顯、體徵良好的雌性紅鯽 和雄性黃尾密鯝作為遠緣雜交的親魚進行專池培育，促進親魚性腺發育成熟；2) 人工催產在繁殖季節使水溫穩定在20'C以上，然後先向母本親魚注射絨毛膜促性 腺激素與地歐酮的混合催產劑進行催產，所述絨毛膜促性腺激素的用量為800 1000IU/kg， 所述地歐酮的用量為3 6mg/kg;母本親魚注射後4 5h再向父本親魚注射所述混合催產劑， 父本親魚的注射劑量減半；注射後按l : (1.5 2)的數量比將母、父本親魚放入同一產卵池 中直至其開始順利產卵和產精；3) 授精孵化挑選產卵量大的母本和產精量大的父本進行人工幹法授精，並將受精卵置 於水溫為22'C 25'C的孵化池中進行流水自動孵化；4) 詞養魚苗全部孵出後，先於網箱中培育3 4天，待魚苗出現腰點、開始平遊、能夠 主動開口攝食後轉入池塘飼養，魚苗長成後得到紅鯽與黃尾密鯝雜交三倍體魚、紅鯽與黃尾 密鯝雜交四倍體魚和天然雌核發育紅鯽。
3、 根據權利要求2所述的紅鯽與黃尾密鯝亞科間遠緣雜交的方法，其特徵在於所述人 工催產時對親魚的注射是採用胸鰭基部無鱗處腹腔一次性注射的方法。
全文摘要
本發明公開了一種紅鯽與黃尾密鯝亞科間遠緣雜交的方法，包括以下步驟首先選取性腺成熟、體徵良好的紅鯽、黃尾密鯝分別作為雜交的母本親魚和父本親魚，在繁殖季節對所述的父、母本親魚進行人工催產，再選擇催產效果良好的父、母本親魚進行人工幹法授精，授精完成後進行流水自動孵化，待魚苗孵化完成後進行飼養，再對飼養後的魚苗進行檢測、篩分，獲得紅鯽與黃尾密鯝雜交三倍體魚、紅鯽與黃尾密鯝雜交四倍體魚和天然雌核發育紅鯽。本發明培育出的雜交後代不僅性狀改善，顯著提高了遠緣雜交的受精率和孵化率，而且是一種產生四倍體魚和天然雌核發育魚的新途徑，在生物進化和魚類遺傳育種方面具有重要的生物學意義。
文檔編號A01K61/00GK101669448SQ20091004446
公開日2010年3月17日 申請日期2009年9月30日 優先權日2009年9月30日
發明者何偉國, 筠 劉, 劉少軍, 純 張, 羅凱坤, 敏 陶 申請人:湖南師範大學