蛋巢菌素類化合物、製備方法及其抗神經炎症的應用與流程

2023-10-16 22:41:34

本發明屬於醫藥領域，涉及蛋巢菌素類化合物、製備方法及其抗神經炎症的應用，特別是10個蛋巢菌素化合物、製備方法及其用於製備抑制環氧合酶-2活性和一氧化氮合酶活性藥物的應用。
背景技術：
：隨著人口老齡化進程的日益加速，阿爾茨海默病(alzheimerdiseasead)已成為常見的神經變性疾病，《全球阿爾茨海默病ad報告》顯示，2015年全球約4680萬人患痴呆症，並以每20年翻一番的速度在增長，預計到2050年，全球痴呆患者將達到1.315億。目前的藥物只能改善ad患者症狀，既不能阻止ad發病進程也不能恢復患者已經失去的認知功能，因此療效有限。迄今為止，仍沒有革命性的藥物出現。ad的病因及發病機制複雜，近年研究發現，以小膠質細胞如(bv2microglial)過度激活及產生大量自由基和炎性因子為特徵的神經免疫炎症與ad密切相關。小膠質細胞是腦內的免疫效應細胞，小膠質細胞大約佔中樞神經系統腦實質膠質細胞數量的10％，被aβ激活的小膠質細胞不僅有形態學上的改變，激活的小膠質細胞也活化了誘導性一氧化氮合酶(inos)，使細胞釋放一氧化氮(nitricoxide,no)。no可以直接抑制參與線粒體電子傳遞及與檸檬酸循環有關的酶。no可能是毒性更大、生物半衰期更長的過氧化亞硝基陰離子的前體物，後者分解成具有強毒性作用的-oh及二氧化氮自由基。中樞神經系統no表達水平的增高和神經炎症性疾病、神經變性性疾病密切相關，在ad中發現了no表達水平的增高。由於神經炎症和神經變性刺激，激活的小膠質細胞和星型膠質細胞大量表達inos，產生大量的no，介導廣泛的毒性作用，這種特點使no/inos成為介導包括神經變性疾病在內的許多疾病病理過程的一個重要因素[1,2]。環氧化酶-2(cox-2)是前列腺素e2合成的關鍵酶，在大腦皮層的錐體細胞和海馬發現了cox-2免疫活性增加，提示cox-2可能參與阿爾茨海默病發病。而cox-2則主要在炎症部位表達，並可引起神經細胞的凋亡[3]。在ad患者腦內cox-2表達增加與aβ水平具有高度一致性，而且cox-2與含nfts的神經元共存，說明cox-2在神經元內的表達增加，可能導致神經元死亡。因此，為了開發新型抗神經炎症藥物用於治療老年痴呆症，迫切需要尋找cox-2和inos酶抑制劑。[1]沈勤,施建華,顧建蘭,等.炎症膠質細胞中誘導型一氧化氮合酶基因轉錄的機制[j].中國臨床康復,2006,10(30):101-104.[2]saharn,pahank.regulationofinduciblenitricoxidesynthasegeneinglialcells.antioxidredoxsignal,2006,8(5-6):929.[3]szekelyca,townt,zandipp.nsaidsforthechemopreventionofalzheimer’sdisease.subcellbiochem.2007,42:229-248.技術實現要素：本發明從一株非洲黑蛋巢菌的發酵液中分離得到10種化合物，統稱為蛋巢菌素類化合物，該10種化合物分別對環氧合酶-2和一氧化氮合酶有較強的抑制活性，表明具有顯著的抗神經炎症活性。本發明的化合物結構式為：分別命名為neocyathine；neocyathinf；neocyathing；neocyathinh；neocyathini；neocyathinj；cyathini；(12r)-11α,14α-epoxy-13α,14β,15-trihy-droxycyath-3-ene；cyathino和allocyafrinb4。本發明的蛋巢菌素1的理化性質為：c20h30o4，白色粉末。[α]d25＝-82.0(c＝0.17,meoh)；uv(meoh):λmax(logε):230(3.06)nm；ir(kbr):νmax＝3451,2958,2866,2082,1640,1050cm-1；hr-esi-ms:m/z357.2032[m+na]+；本發明的蛋巢菌素2理化性質為：c20h28o5，白色粉末。[α]d25＝-77.9(c＝0.19,meoh)；uv(meoh):λmax(logε):214(3.10)nm；ir(kbr):νmax＝3374,2939,2872,1696,1384,1031cm-1；hr-esi-ms:m/z371.1825[m+na]+；本發明的蛋巢菌素3理化性質為：c20h30o5，白色粉末。[α]d25＝-66.5(c＝0.18,meoh)；uv(meoh):λmax(logε):230(2.85)nm；ir(kbr):νmax＝3369,2933,2870,1648,1046,982cm-1；hr-esi-ms:m/z373.1982[m+na]+；本發明的蛋巢菌素4理化性質為：c20h28o5，黃色油狀。[α]d25＝-105.7(c＝0.09,meoh)；uv(meoh):λmax(logε):230(3.36)nm；ir(kbr):νmax＝3417,2962,2874,1689,1593,1383cm-1；hr-esi-ms:m/z371.1825[m+na]+；本發明的蛋巢菌素5理化性質為：c20h30o5，白色固體。[α]d25＝-47.1(c＝0.09,meoh)；uv(meoh):λmax(logε):231(3.30)nm；ir(kbr):νmax＝2961,2384,2310,1738,1366,1218cm-1；hr-esi-ms:m/z373.1985[m+na]+；本發明的蛋巢菌素6理化性質為：c20h30o5，白色粉末。[α]d25＝-68.4(c＝0.07,meoh)；uv(meoh):λmax(logε):230(3.46)nm；ir(kbr):νmax＝2935,1735,1687,1606,1369,1217cm-1；hr-esi-ms:m/z373.1985[m+na]+；本發明的蛋巢菌素7理化性質為：c20h30o4，白色粉末。[α]d25＝-157.6(c＝0.11,meoh)；uv(meoh):λmax(logε):230(3.25)nm；esi-ms(positive)m/z:357.30[m+na]+；本發明的蛋巢菌素8理化性質為：c20h32o4，白色粉末。[α]d25＝-5.88(c＝0.55,meoh)；uv(meoh):λmax(logε):213(2.23)nm；esi-ms(positive)m/z:359.30[m+na]+；本發明的蛋巢菌素9理化性質為：c20h30o5，黃色固體；[α]d25＝-28.6(c＝0.46,meoh)；uv(meoh):λmax(logε):230(2.72)nm；esi-ms(positive)m/z:701.58[2m+h]+；本發明的蛋巢菌素10理化性質為：c20h28o4，黃色油狀。[α]d25＝-157.8(c＝0.09,meoh)；uv(meoh):λmax(logε):230(3.34)nm；esi-ms(negative)m/z:663.53[2m-h]-；所述的蛋巢菌素1、蛋巢菌素2、蛋巢菌素3、蛋巢菌素4、蛋巢菌素5、蛋巢菌素6、蛋巢菌素7、蛋巢菌素8、蛋巢菌素9和蛋巢菌素10於非洲黑蛋巢菌cyathusafricanus的發酵液中分離得到。所述的非洲黑蛋巢菌cyathusafricanus的發酵液是由非洲黑蛋巢菌cyathusafricanus菌餅於酵母蛋白腖液體培養基上培養得到，培養溫度為28℃，轉速為130rpm，培養時間為28天。所述的蛋巢菌素類化合物用於製備抗神經炎症藥物的應用。所述的蛋巢菌素類化合物用於製備抑制環氧合酶-2活性和一氧化氮合酶活性藥物的應用。所述的10個蛋巢菌素化合物有明顯的抗神經炎症活性，其中蛋巢菌素6、蛋巢菌素7、蛋巢菌素8、蛋巢菌素9和蛋巢菌素10在50μm時分別對環氧合酶-2和一氧化氮合酶有較強的抑制活性。本發明的化合物作為抑制劑，在抗神經炎症方面具有開發應用潛力。附圖說明圖1為餾分a-餾分f的流出順序示意圖；圖2為餾分e1-餾分e5的流出順序示意圖；圖3為化合物8和化合物6的流出順序示意圖；圖4為餾分d1-餾分d5的流出順序示意圖；圖5為餾分c1-餾分c5的流出順序示意圖；圖6為餾分c2.1-餾分c2.2的流出順序示意圖；圖7為化合物2和化合物5的流出順序示意圖；圖8為餾分b1-餾分b5的流出順序示意圖；圖9為蛋巢菌素化合物1的紅外譜圖；圖10為蛋巢菌素化合物2的紅外譜圖；圖11為蛋巢菌素化合物3的紅外譜圖；圖12為蛋巢菌素化合物4的紅外譜圖；圖13為蛋巢菌素化合物5的紅外譜圖；圖14為蛋巢菌素化合物6的氫譜圖；圖15為蛋巢菌素化合物6的碳譜圖；圖16為蛋巢菌素化合物6的紅外譜圖；圖17為蛋巢菌素化合物7的質譜圖；圖18為蛋巢菌素化合物8的質譜圖；圖19為蛋巢菌素化合物9的質譜圖；圖20為蛋巢菌素化合物10的質譜圖；具體實施方式本發明的10個化合物蛋巢菌素1-10是從一株非洲黑蛋巢菌cyathusafricanus的發酵液中分離得到的。該非洲黑蛋巢菌購買於中國普通微生物菌種保藏管理中心，編號為：cgmcc5.1163；菌種保藏於西北農林科技大學化學與藥學院天然藥物化學研究中心，編號為：(no.ca20150728)。該非洲黑蛋巢菌的保藏及活化培養條件為：保藏菌種採用pda斜面培養基。活化菌種，將菌種接種於pda平皿中，於28℃活化培養7天，至平皿上長滿菌絲體。pda平板培養基：每升培養基含200g土豆，20g葡萄糖，16g瓊脂粉。一、本發明的化合物的提取方法、鑑定及抗神經炎症測定及應用：1、實驗材料培養基：酵母蛋白腖培養基：葡萄糖20g，酵母提取物2g，蛋白腖5g，mgso4.7h2o0.5g，kh2po41g，水1000ml，ph＝6.5；試劑與儀器：常用有機溶劑：三氯甲烷，甲醇，乙酸乙酯，石油醚、丙酮等均為工業試劑，重蒸後使用。有機溶劑：色譜甲醇，色譜乙腈等視實際使用情況使用分析純或色譜純試劑。以下除特殊說明外，試劑用量均為體積比。常用儀器：旋光儀rudolphautopolⅲ型；高效液相色譜儀：waters1525；紫外光譜儀：thermoevolution-300型；核磁共振：brukeravanceⅲ500(tms內標)；低分辨質譜儀：thermofisherltqfleet型。旋轉蒸發儀：büchirotavaporr-101、r-3hb型；低溫冷卻液循環泵：dlsb-10/20型(鄭州長城科工貿有限公司)；循環水式多用真空泵：shb-ⅲ型(鄭州長城科工貿有限公司)；超淨工作檯：sw-oj-2f型(蘇淨集團蘇州安泰空氣技術有限公司)；立式蒸汽滅菌器(上海博訊實業有限公司醫療設備廠)。柱層析矽膠(100-200目、200-300目及300-400目)及薄層層析矽膠(矽膠h)均為青島海洋化工廠生產；液相色譜柱：hypersilbds5μmc18(250×4.6and250×10；thermo)；羥丙基葡聚糖凝膠sephadexlh-20和rp-c18反向矽膠均為merck公司生產。1.1非洲黑蛋巢菌的發酵培養：發酵培養條件包括：取活化好的非洲黑蛋巢菌菌餅(7mm2)接種於200ml酵母蛋白腖液體培養基上，200ml酵母蛋白腖液體培養基放置在500ml錐形瓶中進行培養；培養條件為28℃，130rpm條件下培養28天；發酵共得到40l發酵液。非洲黑蛋巢菌菌餅的活化方法：將非洲黑蛋巢菌菌種接種於pda平皿(pda平板培養基)中，於28℃活化培養7天，至平皿上長滿菌絲體。pda平板培養基：每升培養基含200g土豆，20g葡萄糖，16g瓊脂粉。1.2化合物提取分離：將1.1中得到的發酵液濃縮後，依次經有機溶劑萃取和柱層析梯度洗脫處理得到餾分a、餾分b、餾分c、餾分d、餾分e和餾分f，具體的有機溶劑可以為乙酸乙酯，層析柱為rp-18，梯度洗脫條件為甲醇:水(10％→100％)；餾分e再經矽膠柱層析後得到餾分e1、餾分e2、餾分e3、餾分e4和餾分e5；餾分e2純化後得到蛋巢菌素化合物1，餾分e3純化得到蛋巢菌素化合物7，純化方法可以為經凝膠柱lh-20和半製備型hplc；餾分e4經凝膠柱lh-20洗脫後，再經過矽膠柱層析洗脫，最後得到蛋巢菌素化合物8和蛋巢菌素化合物6；餾分d依次通過凝膠柱lh-20和矽膠柱層析洗脫後得到餾分d1、d2、d3、d4和d5，餾分d3純化後得到蛋巢菌素化合物10，純化方法為依次通過凝膠柱lh-20和矽膠柱層析洗脫後進一步用半製備型hplc進行處理；餾分c通過矽膠色譜柱，氯仿:甲醇(50:1→10:1)分離，依次得到餾分c1、c2、c3、c4和c5，餾分c2通過凝膠柱lh-20後得到餾分c2.1和餾分c2.2，餾分c2.1純化後得到蛋巢菌素化合物3，純化方法為通過半製備型hplc；餾分c2.2通過矽膠柱層析洗脫得到蛋巢菌素化合物2和蛋巢菌素化合物5；餾分b通過矽膠色譜柱，氯仿:甲醇(50:1→10:1)分離，依次得到餾分b1、b2、b3、b4和b5，餾分b3純化後得到的蛋巢菌素化合物9，純化方法為通過凝膠柱lh-20後用製備薄層色譜處理；餾分b4依次通過凝膠柱lh-20和矽膠柱層析洗脫得到蛋巢菌素化合物4；具體的蛋巢菌素類化合物的提取方法包括:將1.1中得到的40l發酵液濃縮至5l，等體積比加入乙酸乙酯萃取3次，得到粗提物30.2g用rp-18柱劃段，用甲醇:水(10％→100％)梯度洗脫，依次獲得6個餾分a-f(具體見圖1)。餾分e通過矽膠色譜柱，氯仿:甲醇(體積比50:1→10:1)分離，依次得到5個餾分(e1-e5)(具體見圖2)，餾分e2依次通過凝膠柱lh-20(溶劑為甲醇)和半製備型hplc(55％，甲醇-水，2ml/min)進一步純化，得到蛋巢菌素化合物1(tr＝13.0min，200.0mg)。餾分e3依次通過凝膠柱lh-20(溶劑為甲醇)和半製備型hplc(90％，甲醇-水，2ml/min)進一步純化，得到的蛋巢菌素化合物7(tr＝9.0min，8.0mg)。餾分e4依次通過凝膠柱lh-20(溶劑為甲醇)和矽膠柱層析洗脫(氯仿:甲醇，20:1)得到蛋巢菌素化合物8(5.5mg)和蛋巢菌素化合物6(7.2mg)(具體見圖3)。餾分d通過矽膠色譜柱，氯仿:甲醇(50:1→10:1)分離，依次得到5個餾分(d1-d5)(具體見圖4)，餾分d3依次通過凝膠柱lh-20(溶劑為甲醇)後,矽膠柱層析洗脫(氯仿:甲醇，20:1)後進一步用半製備型hplc(39％，甲醇-水，2ml/min)純化，得到蛋巢菌素化合物10(tr＝30.0min，6.0mg)。餾分c通過矽膠色譜柱，氯仿:甲醇(50:1→10:1)分離，依次得到5個餾分(c1-c5)(具體見圖5)，餾分c2通過凝膠柱lh-20(溶劑為甲醇)後分為2部分，c2.1和c2.2(具體見圖6)。餾分c2.1通過半製備型hplc(40％，甲醇-水，2ml/min)純化，得到蛋巢菌素化合物3(tr＝13.5min，4.2mg)。餾分c2.2通過矽膠柱層析洗脫(氯仿:甲醇，40:1)得到蛋巢菌素化合物2(7.3mg)和蛋巢菌素化合物5(6.0mg)(具體見圖7)。餾分b通過矽膠色譜柱，氯仿:甲醇(50:1→10:1)分離，依次得到5個餾分(b1-b5)(具體見圖8)，餾分b3通過凝膠柱lh-20(溶劑為甲醇)後用製備薄層色譜(氯仿:甲醇，20:1)製備進一步純化，得到的蛋巢菌素化合物9(8.3mg)。餾分b4依次通過凝膠柱lh-20(溶劑為甲醇)和矽膠柱層析洗脫(氯仿:甲醇，25:1)得到蛋巢菌素化合物4(5.4mg)。1.3.十個蛋巢菌素化合物的理化性質分別為：表1蛋巢菌素化合物1-101hnmr數據表2蛋巢菌素化合物1-1013cnmr數據本發明的蛋巢菌素化合物1理化性質為：c20h30o4，白色粉末。[α]d25＝-82.0(c＝0.17,meoh)；uv(meoh):λmax(logε):230(3.06)nm；ir(kbr):νmax＝3451,2958,2866,2082,1640,1050cm-1；hr-esi-ms:m/z357.2032[m+na]+；1h-nmr譜和13c-nmr譜數據見表1和表2；紅外譜圖見圖9。本發明的蛋巢菌素化合物2理化性質為：c20h28o5，白色粉末。[α]d25＝-77.9(c＝0.19,meoh)；uv(meoh):λmax(logε):214(3.10)nm；ir(kbr):νmax＝3374,2939,2872,1696,1384,1031cm-1；hr-esi-ms:m/z371.1825[m+na]+；1h-nmr譜和13c-nmr譜數據見表1和表2，紅外譜圖見圖10。本發明的蛋巢菌素化合物3理化性質為：c20h30o5，白色粉末。[α]d25＝-66.5(c＝0.18,meoh)；uv(meoh):λmax(logε):230(2.85)nm；ir(kbr):νmax＝3369,2933,2870,1648,1046,982cm-1；hr-esi-ms:m/z373.1982[m+na]+；1h-nmr譜和13c-nmr譜數據見表1和表2；紅外譜圖見圖11。本發明的蛋巢菌素化合物4理化性質為：c20h28o5，黃色油狀。[α]d25＝-105.7(c＝0.09,meoh)；uv(meoh):λmax(logε):230(3.36)nm；ir(kbr):νmax＝3417,2962,2874,1689,1593,1383cm-1；hr-esi-ms:m/z371.1825[m+na]+；1h-nmr譜和13c-nmr譜數據見表1和表2；紅外譜圖見圖12。本發明的蛋巢菌素化合物5理化性質為：c20h30o5，白色固體。[α]d25＝-47.1(c＝0.09,meoh)；uv(meoh):λmax(logε):231(3.30)nm；ir(kbr):νmax＝2961,2384,2310,1738,1366,1218cm-1；hr-esi-ms:m/z373.1985[m+na]+；1h-nmr譜和13c-nmr譜數據見表1和表2，紅外譜圖見圖13。本發明的蛋巢菌素化合物6理化性質為：c20h30o5，白色粉末。[α]d25＝-68.4(c＝0.07,meoh)；uv(meoh):λmax(logε):230(3.46)nm；ir(kbr):νmax＝2935,1735,1687,1606,1369,1217cm-1；hr-esi-ms:m/z373.1985[m+na]+；1h-nmr譜和13c-nmr譜數據見表1和表2；氫譜圖、碳譜圖和紅外譜圖分別見圖14、15和16。本發明的蛋巢菌素化合物7理化性質為：c20h30o4，白色粉末。[α]d25＝-157.6(c＝0.11,meoh)；uv(meoh):λmax(logε):230(3.25)nm；esi-ms(positive)m/z:357.30[m+na]+；1h-nmr譜和13c-nmr譜數據見表1和表2；紅外譜圖見圖17。本發明的蛋巢菌素化合物8理化性質為：c20h32o4，白色粉末。[α]d25＝-5.88(c＝0.55,meoh)；uv(meoh):λmax(logε):213(2.23)nm；esi-ms(positive)m/z:359.30[m+na]+；1h-nmr譜和13c-nmr譜數據見表1和表2，質譜圖見圖18。本發明的蛋巢菌素化合物9理化性質為：c20h30o5，黃色固體；[α]d25＝-28.6(c＝0.46,meoh)；uv(meoh):λmax(logε):230(2.72)nm；esi-ms(positive)m/z:701.58[2m+h]+；1h-nmr譜和13c-nmr譜數據見表1和表2，質譜圖見圖19。本發明的蛋巢菌素化合物10理化性質為：c20h28o4，黃色油狀。[α]d25＝-157.8(c＝0.09,meoh)；uv(meoh):λmax(logε):230(3.34)nm；esi-ms(negative)m/z:663.53[2m-h]-；1h-nmr譜和13c-nmr譜數據見表1和表2；質譜圖見圖20。1.4蛋白質印跡分析(westernblotanalysis)藥物處理後，參照文獻[4]中所描述的方法提取細胞蛋白，並利用蛋白免疫印跡法分析蛋白表達。簡言之，取蛋白質樣品加上樣緩衝液煮沸變性後，於10％sds-page電泳，並轉移到硝酸纖維膜上。將膜置於含5％bsa的tbst溶液4度封閉過夜後，再置於含有inos,cox-2和gapdh的一抗(cellsignalingtechnology,boston,ma,usa)溶液中4度孵育4h,tbst漂洗3次，隨後置於含辣根過氧化物酶標記的二抗溶液中，4度孵育3h,洗膜後，按照gehealthcare公司ecl試劑盒說明進行測試。表3為測定結果。[4]chengy,yangc,zhaoj,tsehf,rongj.proteomicidentificationofcalcium-bindingchaperonecalreticulinasapotentialmediatorfortheneuroprotectiveandneuritogenicactivitiesoffruit-derivedglycosideamygdalin.jnutrbiochem.2015,26(2):146-54)表3.蛋巢菌素化合物1-10對兩種酶的抑制活性化合物編號環氧合酶-2一氧化氮合酶117.545.92-12.117.53-104.529.6417.541.7527.835.9622.751.0753.960.1815.550.5942.655.410-45.170.3蛋巢菌素化合物7和蛋巢菌素化合物9對環氧合酶-2的抑制率分別為53.9％和42.6％；蛋巢菌素化合物6，7，8，9和10對一氧化氮合酶的抑制率分別為51.0％，60.1％，50.5％，55.4％和70.3％。特別是，蛋巢菌素化合物10高選擇性地抑制一氧化氮合酶活性，抑制率高達70.3％。結果表明這些化合物作為神經炎症抑制劑能夠用於治療神經退行性疾病。當前第1頁12