富精氨酸多肽-金納米粒子細胞傳輸載體合成方法

2023-10-16 22:04:54 2

專利名稱：富精氨酸多肽-金納米粒子細胞傳輸載體合成方法
技術領域：
本發明涉及一種富精氨酸多肽-金納米粒子細胞傳輸載體合成方法。 技術背景無機納米生物傳輸系統因其超小體積、特異的性質(如螢光、磁性、緻密性) 為活細胞內生化過程的獲得及醫用靶向藥物治療提供了新的媒介和技術手段(自然生物技術，W飢說otec/i"o/. 2001, 79,1013-1017)。其中生物分子和金納米的雜交粒子 又以其生物相容性、獨特的光學性質可以對細胞進行實時、動態的觀測，因此已有 —些研究將DNA，蛋白、抗體、多聚物分子與金粒子相連接來實現跨細胞膜傳輸(科 學，Sci幼ce, 2006, 1027-1030;生物聚合體化學，歷ocoM)"gate CAe加.2004，"， 482~4卯)。近幾年多肽分子也被應用於功能化金納米粒子，該方法可以使金納米粒子 在水溶液中保持髙穩定性(美國化學會志，^4ot. C/jcti. Soc.， 2004， 10076-10084〉，並實現高效率的跨膜傳輸(美國國家科學院院刊，屍roc. W紐/. 4coc/. & S. A 2006， 703， 1215-1220)。其中，多種從病毒跨膜蛋白提取的富精氨酸多肽 不僅能夠自動高效的跨膜，並且可將外源大分子傳遞進入細胞核(生物化學雜誌，說o/. Oie加.，2001 ， 27《5836 - 5840:生物聚合體化學，說ocon乂wgate CZiem. 2004，"， 475 - 481)。然而，現有的利用肽鏈作為傳遞介質的金納米載體的合成方法往往需 要使用高聚物或蛋白來穩定金納米粒子，再結合傳遞肽鏈，合成過程往往非常複雜， 需要較長的反應時間，並且難以結合多種分子，實現多功能化。(美國化學會志,丄4加. C/ie附.Soc.， 2004， "6,10076-10084;生物聚合體化學，歷oco"乂Mgate CAe加.2005, 76, 1176-1180)
發明內容本發明的目的是提供富精氨酸多肽-金納米粒子細胞傳輸載體的合成方法。多肽CALNN與金表面有很強的親和性，能夠形成緻密的保護層，使金納米粒 子溶於水溶液，並可以保持長期的穩定性。CALNN肽鏈N端的半胱氨酸能夠以硫醇 鍵與金表面形成牢固的共價鍵，疏水性的丙氨酸和亮氨酸能夠促進多肽的自組裝， 在C端的兩個天冬醯氨使多肽親水。富精氨酸多肽(CALNNRg)能夠高效穿透細胞 膜，並有針對性的聚集在細胞內特定位置。本發明結合這兩種多肽的優勢，優化合 成條件，建立了富精氨酸多肽-金納米粒子細胞傳輸載體的合成方法。 實現本發明的方法的具體的技術方案如下 提供了一種富精氨酸多肽-金納米粒子細胞傳輸載體合成方法。 首先，按照Frens-Turkevich方法，利用檸檬酸鈉還原氯金酸，製備出粒徑為30 nm 金納米粒子；使胺基酸序列為CALNN和CALNNGGRRRRRRRR(CALNNRg)的多肽混合，使 兩種多肽的摩爾濃度比例分別為卯％: 10%或0%: 100%,得到多肽混合物；將該多 肽混合物加入到粒徑為30 nm金納米溶液中，使多肽的摩爾總濃度為1-1.5 mM，在 室溫下靜置反應1 h，將溶液的pH值調節至3-6，使金納米粒子在溶液中保持單分 散，離心10000 rpm後拋棄上清液，然後加入與上清液等量的pH值為3-6的去離子 水，最後合成出了富精氨酸多肽-金納米粒子細胞傳輸載體。將培養好的細胞離心1000 ipm, 5 min富集，用0.1 M磷酸緩衝溶液(PBS)清 洗，離心1000rpm，5min富集，去除上清液，將1 ml, 0.32 nM多肽-金納米粒子溶液 與lXl(^個細胞混合均勻反應2h，加入與金納米溶液等量pH值相同的培養基，在 5%C02, 37。C環境下培養24小時。通過光學顯微鏡及暗場顯微鏡觀察，共培養12 小時後金納米粒子集中在細胞的特定位置，該位置呈現紅色，24小時後由於大量粒
子的聚集，靶標位置呈現紅黑色，細胞其它部位呈現淡紅色。 本發明的有益效果明顯(1) 、本發明應用多肽表面修飾法使用一種多肽穩定包裹金納米粒子，第二 種多肽實現納米粒子的細胞跨膜傳輸功能。調節反應初始混合物中穩定多肽與傳輸 多肽的比例，能獲得不同傳輸能力的富精氨酸多肽多肽-金納米載體。利用多肽CALNN穩定金納米粒子，CALNN肽鏈N端的半胱氛酸能夠以硫醇鍵 與金表面形成牢固的共價鍵，丙氨酸和亮氨酸能夠促進多肽的自組裝，在C端的兩 個天冬醯氨使多肽親水。在CALNNGGRRRRRRRR(CALNNRg)中R8作為驅動序列， 能夠跨越細胞膜將金粒子傳遞到細胞內部。合成總時間小於兩小時，兩種多肽能夠 在一步反應中與金納米粒子表面結合。反應在室溫下迸行，條件溫和，無需特殊設 備的輔助。該合成方法操作簡單，所需時間短。合成出的金納米粒子載體細胞跨膜 傳輸效率高，檢測方法簡單直觀。(2) 、載體傳輸效率高。富精氨酸多肽利用多肽表面正電荷與帶負電荷的細胞膜 相吸附，啟動細胞內吞作用，幾分鐘內即可完成穿膜過程。傳輸定位準確，多肽-金 納米粒子可傳輸到細胞核或內質網的位置，並在該位置富集，使其呈現紅色。隨著 傳遞時間的增加，靶向位置由於金粒子的聚積顯現黑紅色，其他位置為淡紅色。合 成出的金納米粒子載體細胞跨膜傳輸效率高。(3) 、檢測簡單直觀。相比較細胞載體傳統檢測手段——電子顯微鏡，螢光顯微 鏡等，該載體的傳輸功能可由普通光學顯微鏡觀察。樣品不需其他預處理，載體在 細胞內的傳遞位置可根據顏色判斷細胞核或內質網結構顯現紅色，明顯區別於其 他位置。檢測時間短，每個小時可以檢測上百個樣品。金納米粒子的顯色性穩定， 不會淬滅的性質可使檢測樣品長時間保存。檢測方法簡單直觀。


圖1是本發明中製備的金納米粒子的透射電鏡圖。金納米粒子的平均粒徑是30±3 mm圖2是金納米粒子的紫外可見吸收光譜圖。其中，a線是檸檬酸鈉法合成的30 nm 金納米粒子的紫外可見吸收光譜；b線是富精氨酸多肽-金納米粒子在pH5.5的紫外 可見吸收光譜。圖3是富精氨酸多肽-金納米粒子進入細胞的明場顯微鏡照片。(a)與富精氨 酸多肽-金納米粒子共培養24小時後，大部分細胞核呈現黑紅色，細胞質呈現淡紅色； (b)—部分金納米粒子未能進入細胞核，而集中在細胞質內；(c)對照組一隻 用CALNN多肽包裹的金納米粒子與細胞共培養24小時後，細胞保持透明。圖4 (a)是富精氨酸多肽-金納米粒子進入細胞的明場顯微鏡照片；(b)是 枏對應的暗場顯微鏡照片。圖5 HeLa細胞與不同濃度的富精氨酸多肽-金納米粒子共培養24小時後的活率。
具體實施方式
實施例l提供了一種富精氨酸多肽多肽-金納米粒子細胞傳輸載體合成方法。首先，按照 Fre旭-Tuikevich方法，利用檸檬酸鈉還原氯金酸製備出粒徑為30nm金納米粒子；使 胺基酸序列為CALNN和CALNNGGRRRRRRRR(CALNNR8)的多肽混合，使兩種多 肽的摩爾濃度比例為90%: 10%，得到多肽混合物；將多肽混合物加入到粒徑為30nm 金納米溶液中，使多肽的摩爾總濃度為1 mM，在室溫下靜置反應lh,將溶液的pH 值調節至3，使金納米粒子在溶液中保持單分散，離心10000ipm後拋棄上清液，然 後加入與上清液等量的pH值為3的去離子水，最後合成出了富精氨酸多肽-金納米粒子細胞傳輸載體。將培養好的細胞離心1000 rp叫5 min富集，用0.1 M磷酸緩衝溶液(PBS)清 洗，離心1000ipm,5min富集，去除上清液，將1 ml, 0.32 nM多肽-金納米粒子溶液 與lXl(^個細胞混合均勻反應2h，加入與金納米溶液等量pH值相同的培養基，在 5%C02, 37。C環境下培養24小時。通過光學顯微鏡及暗場顯微鏡觀察，共培養12 小時後金納米粒子集中在細胞的特定位置，該位置呈現紅色，24小時後由於大量粒 子的聚集，靶標位置呈現紅黑色，細胞其它部位呈現淡紅色。 實施例2使多肽CALNN和CALNNGGRRRRRRRR(CALNNRg)摩爾濃度比例為0%: 100%。 其他步驟同實施例l 實施例3使多肽與金納米溶液在室溫下靜置反應1 h,將溶液的pH值調節至6，使金納米 粒子在溶液中保持單分散，離心10000 rpm後拋棄上清液，然後加入與上清液等量 的pH值為6的去離子水。其他步驟同實施例1 實施例4使多肽在金納米溶液中的濃度為1.5 mH在室溫下靜置反應1 h。其他步驟同實 施例l。
權利要求
1，富精氨酸多肽-金納米粒子細胞傳輸載體合成方法，其特徵在於，步驟和條件如下首先，按照Frens-Turkevich方法，利用檸檬酸鈉還原氯金酸，製備出粒徑為30nm金納米粒子；使胺基酸序列為CALNN和CALNNGGRRRRRRRRR(CALNNR8)的多肽混合，使兩種多肽的摩爾濃度比例分別為90％∶10％或0％∶100％，得到多肽混合物；將該多肽混合物加入到粒徑為30nm金納米溶液中，使多肽的摩爾總濃度為1-1.5mM，在室溫下靜置反應1h，將溶液的pH值調節至3-6，使金納米粒子在溶液中保持單分散，離心10000rpm後拋棄上清液，然後加入與上清液等量的pH值為3-6的去離子水，最後合成出了富精氨酸多肽-金納米粒子細胞傳輸載體。
全文摘要
本發明涉及富精氨酸多肽-金納米載體的合成方法。本發明應用多肽表面修飾法使用一種多肽穩定包裹金納米粒子，第二種多肽實現納米粒子的細胞跨膜傳輸功能。調節反應初始混合物中穩定多肽與傳輸多肽的比例，能獲得不同傳輸能力的多肽-金納米載體。該合成方法操作簡單，所需時間短，合成出的金納米粒子載體細胞跨膜傳輸效率高，檢測方法簡單直觀。
文檔編號C12N15/63GK101113457SQ20071005583
公開日2008年1月30日 申請日期2007年7月4日 優先權日2007年7月4日
發明者孫琳琳, 王振新 申請人:中國科學院長春應用化學研究所