一種提純表沒食子兒茶素沒食子酸酯(egcg)的方法
2023-10-16 23:06:34
專利名稱：一種提純表沒食子兒茶素沒食子酸酯(egcg)的方法
技術領域：
本發明涉及天然植物有效組分的分離提純方法，尤其是一種利用三帶模擬移動床色譜提純表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)的方法。
背景技術：
表沒食子兒茶素沒食子酸酯(簡稱EGCG，以下稱EGCG)是一種抗氧化性和清除自由基功能很強的活性物質，已作為一種抗腫瘤、抗突變、降血壓等用途的新藥，其提取與應用受到國內外廣泛關注。EGCG是茶葉提取的多酚類混合物即茶多酚的主要成分，在茶多酚中，還存在與EGCG化學結構和性質十分相近的其它黃烷醇類化合物，如表兒茶素(EC)；表兒茶素沒食子酸酯(ECG)；表沒食子兒茶素(EGC)；沒食子兒茶素沒食子酸酯(GCG) ；DL-兒茶素(DL-C)，而且這些黃烷醇類化合物極易氧化，聚(縮)合，使分離純化EGCG單體困難。目前，獲得高純度EGCG單體(高於95%)的主要技術是製備色譜分離法，如 CN1319597(—種茶多酚中兒茶素類化合物的分離方法)、CN1603319(兒茶素單體的分離純化方法)和CN1465572(表沒食子兒茶素沒食子酸酯單體純化方法)採用葡聚糖凝膠 SephadexLH-20柱的層析法；CN101381359 ( —種從綠茶中提取高純度表沒食子兒茶素沒食子酸酯的方法)採用閃爍矽膠柱的層析法，CN101723927A (—種兒茶素單體EGCG工廠化生產分離純化方法)採用KR100-5C18柱的層析法，這些方法雖然可以用於工業生產高純度 EGCG，但都為批處理工藝即間歇提純工藝，不能連續自動生產，而且吸附劑的利用率低，洗脫劑耗量大，原料的處理量較小，耗時，生產效率低。模擬移動床色譜是提純化合物的一個強大的具有優勢的分離手段。模擬移動床色譜在製備色譜的基礎上，引進了特殊的運行機制，使色譜分離過程從間歇變為連續，能夠進行高效率的自動化和規模化分離。目前尚無採用模擬移動床色譜技術分離提純EGCG的報導。
發明內容
本發明提供了一種模擬移動床(簡稱SMB，以下稱SMB)色譜分離提純表沒食子兒茶素沒食子酸酯(簡稱EGCG，以下稱EGCG)的方法，可以連續、自動、高效地提純EGCG。提純EGCG的方法，其特徵在於以茶葉提取物茶多酚為原料，採用SMB色譜分離提純EGCG，該方法的技術方案如下(I)SMB 設備SMB設備組成為色譜柱、洗脫液輸送泵、進料液輸送泵、自控閥、單片機、自動控制系統、多通、管線、接頭、儲液罐、計算機；色譜柱規格為柱長10 50cm，柱長與直徑比為8 20 ；固定相使用十八烷基矽烷鍵合矽膠0DS，10 60 μ m ；自控閥由電磁閥和止逆閥組成。(2) SMB工作條件
SMB運行模式設置SMB系統色譜柱數目總數N，3彡N彡8，設置SMB的基本區帶為洗脫帶，精製帶和吸附帶，每個帶由1 4根相同的色譜柱串聯而成，a為洗脫帶色譜柱數目，b為精製帶色譜柱數目，c為吸附帶色譜柱數目，a+b+c = N,運行模式表示為a-b-c ；流動相組成精製帶和吸附帶的流動相D為醇與水混合的均相溶液，醇的體積百分含量Cd為10 40% ；洗脫帶的流動相P為醇與水混合的均相溶液，醇的體積百分含量Cp 為 Cd 100% ；流動相流速在洗脫帶中，洗脫液P流速隊為1 20cm/min，萃取液E流速Ue = Up ；在精製帶和吸附帶中，洗脫液D流速Ud為1 15cm/min，進樣液F流速Uf為0. 1 6cm/ min，萃餘液 R 流速 Ue = UD+UF ；Ud ^ Up ^ 3UD ；Uf < 2UD ；模擬移動床操作溫度室溫。(3)分離步驟使用如(1)所述SMB設備在如(2)所述的條件下，進行兩次SMB分離一次是從萃取液E除去難洗脫雜質，切換時間ts 5 30min ；另一次從萃餘液R除去易洗脫雜質，切換時間 ts :3 25min ；茶多酚用醇含量為0 100%的水溶液溶解，配置濃度為10 lOOmg/mL的均相原料液，作為第一次SMB分離的進樣液F ；第一次SMB分離得到的萃餘液R或者經過濃縮後、 或者直接作為第二次SMB分離的進樣液F ；將除去雜質的EGCG溶液經脫除溶劑處理後，得到EGCG產品。(4)檢測方法採用島津LC-10AT色譜泵，SPD-10A紫外檢測器，Agilent Extend色譜柱， 4. 6 X 150mm, ODS填料，粒徑5 μ m，流動相為乙腈和水，體積比為15 85，冰醋酸體積百分含量0. 1 %，流速1. OmL/min,檢測波長278nm。由EGCG標準品來標定產品中EGCG的含量。所述的SMB色譜分離提純EGCG的方法，流動相中的醇為甲醇、乙醇。所述的SMB色譜分離提純EGCG的方法，固定相0DS，20 30 μ m ；精製帶和吸附帶的流動相D採用甲醇水溶液，其中甲醇體積百分含量Cd為25 35%。所述的SMB色譜分離提純EGCG的方法，固定相0DS，20 30 μ m ；精製帶和吸附帶的流動相D採用乙醇水溶液，其中乙醇體積百分含量Cd為10 20%。所述的SMB色譜分離提純EGCG的方法，由SMB分離得到的EGCG溶液脫除溶劑的過程為或者冷凍乾燥、或者重結晶、或者真空乾燥、或者減壓膜蒸餾。本發明提供的用模擬移動床色譜分離提純EGCG的方法與現有製備色譜分離技術相比，其顯著優勢在於能規模化、穩健、連續、自動高效地從茶多酚中提純EGCG，產品回收率超過94%，純度超過96%，固定相和流動相能反覆利用，降低成本，屬於綠色環保分離工程。
圖1是兩次模擬移動床分離過程示意圖；圖2是茶多酚原料液的HPLC譜圖；圖3是第一次SMB分離結果，難洗脫雜質的HPLC譜圖； 圖4是第一次SMB分離結果，脫除難洗脫雜質的EGCG的HPLC譜圖5是第二次SMB分離結果，易洗脫雜質的HPLC譜圖；圖6是第二次SMB分離結果，脫除雜質的EGCG的HPLC譜圖。
具體實施例方式實施例1(I)SMB 設備8根色譜柱、流動相D輸送泵流量O-lOmL/min，壓力O-IOMpa ；原料液F泵流量 0-30mL/h，壓力0-8Mpa ；流動相P輸送泵流量O-lOmL/min，壓力O-lOMpa，48個自控閥、一套單片機自動控制系統、5個儲液罐(流動相D、原料液F、流動相P、萃取液E、萃餘液R各需一個儲液罐)、多通、管線、接頭、計算機；色譜柱為規格IOcmX Icm ；固定相使用十八烷基矽烷鍵合矽膠0DS，20 30μπι。(2) SMB工作條件第一次SMB工作條件如下SMB運行模式設置SMB系統色譜柱數目總數N = 4，設置SMB洗脫帶1根色譜柱， 精製帶1根色譜柱，吸附帶2根色譜柱，運行模式為1-1-2 ；流動相組成精製帶和吸附帶的流動相D為甲醇與水的混合溶液，甲醇的體積百分含量Cd為30% ；洗脫帶的流動相P為甲醇與水的混合溶液，醇的體積百分含量Cp為80% ；流動相流速在洗脫帶中，洗脫液P流速Up為3. 2cm/min，萃取液E流速Ue =仏； 在精製帶和吸附帶中，洗脫液D流速Ud為1.9cm/min，進樣液F流速叫為0. 13cm/min，萃餘液 R 流速 Ue = UD+UFO切換時間為15min。模擬移動床操作溫度15_20°C。第二次SMB工作條件如下SMB運行模式設置SMB系統色譜柱數目總數N = 4，設置SMB洗脫帶1根色譜柱， 精製帶1根色譜柱，吸附帶2根色譜柱，運行模式為1-1-2 ；流動相組成精製帶和吸附帶的流動相D為甲醇與水的混合溶液，甲醇的體積百分含量Cd為30% ；洗脫帶的流動相P為甲醇與水的混合溶液，醇的體積百分含量Cp為60% ；流動相流速在洗脫帶中，洗脫液P流速Up為3. 8cm/min,萃取液E流速Ue =仏； 在精製帶和吸附帶中，洗脫液D流速Ud為1.9cm/min，進樣液F流速叫為0. 13cm/min，萃餘液 R 流速 Ue = UD+UFO切換時間為10min。模擬移動床操作溫度15_20°C。(3)分離步驟使用如⑴所述SMB設備在如⑵所述的條件下，進行兩次SMB分離，如圖1所示。 第一次SMB分離是從萃取液E除去難洗脫雜質，取5克茶多酚原料(EGCG純度55. 5% )， 用甲醇體積百分含量為30%的水溶液溶解，0. 45 μ m濾膜過濾，配置濃度為5g/100mL的溶液，作為第一次SMB分離的進樣液F，EGCG為22. 3mg/mL,其HPLC譜圖如圖2所示，用流動相P將難洗脫雜質於萃取液E中除去，其HPLC譜圖如圖3所示，由流動相D獲得含易洗脫雜質和EGCG的萃餘液R，其HPLC譜圖如圖4所示，EGCG的純度為92. 19%，收率99. 7%，將該萃餘液旋轉蒸發濃縮，EGCG為18mg/mL，用作第二次SMB分離的進樣液F。第二次SMB分離是除去易洗脫雜質，用流動相D將易洗脫雜質於萃餘液R中除去，其HPLC譜圖如圖5所示，由流動相P獲得EGCG的萃取液E，其HPLC譜圖如圖6所示，EGCG的純度為97. 8%，收率99. 8%。EGCG的萃取液經旋轉蒸發後，冷凍乾燥得到EGCG產品。(4)檢測方法採用島津LC-10AT色譜泵，SPD-10A紫外檢測器，Agilent Extend色譜柱， 4. 6 X 150mm, ODS填料，粒徑5 μ m，流動相為乙腈和水，體積比為15 85，冰醋酸體積百分含量0. 1 %，流速1. OmL/min,檢測波長278nm。由EGCG標準品來標定產品中EGCG的含量。實施例2(1) SMB設備同實施例1。(2) SMB工作條件第一次SMB工作條件如下SMB運行模式設置SMB系統色譜柱數目總數N = 5，設置SMB洗脫帶1根色譜柱， 精製帶2根色譜柱，吸附帶2根色譜柱，運行模式為1-2-2 ；流動相組成精製帶和吸附帶的流動相D為乙醇與水的混合溶液，乙醇的體積百分含量Cd為15% ；洗脫帶的流動相P為乙醇；流動相流速在洗脫帶中，洗脫液P流速Up為3. 8cm/min,萃取液E流速Ue =仏； 在精製帶和吸附帶中，洗脫液D流速Ud為2. 9cm/min,進樣液F流速Uf為0. 25cm/min,萃餘液 R 流速 Ue = UD+UFO切換時間為Hmin。模擬移動床操作溫度10-15°C。第二次SMB工作條件如下SMB運行模式設置SMB系統色譜柱數目總數N = 5，設置SMB洗脫帶1根色譜柱， 精製帶2根色譜柱，吸附帶2根色譜柱，運行模式為1-2-2 ；流動相組成精製帶和吸附帶的流動相D為乙醇與水的混合溶液，乙醇的體積百分含量Cd為15% ；洗脫帶的流動相P為乙醇；流動相流速在洗脫帶中，洗脫液P流速Up為3. 8cm/min,萃取液E流速Ue =仏； 在精製帶和吸附帶中，洗脫液D流速Ud為1. 3cm/min，進樣液F流速Uf為1. 9cm/min，萃餘液 R 流速 Ue = UD+UFO切換時間為Mmin。模擬移動床操作溫度10-15°C。(3)分離步驟使用如(1)所述SMB設備在如(2)所述的條件下，進行兩次SMB分離。第一次SMB 分離是從萃取液E除去難洗脫雜質，取5克茶多酚原料(EGCG純度65. 8% )，用乙醇體積百分含量為15%的水溶液溶解，0. 45 μ m濾膜過濾，配置濃度為5g/100mL的溶液，作為第一次 SMB分離進樣液F，EGCG為28. 9mg/mL,用流動相P將難洗脫雜質於萃取液E中除去，由流動相D獲得含易洗脫雜質和EGCG的萃餘液R，EGCG的純度為92. 43 %，收率99. 2 %，將該萃餘液旋轉蒸發濃縮，EGCG為8. :3mg/mL，用作第二次SMB分離的進樣液F。第二次SMB分離是除去易洗脫雜質，用流動相D將易洗脫雜質於萃餘液R中除去，由流動相P獲得EGCG的萃取液E，EGCG的純度為96. 5%，收率99.4%。EGCG的萃取液經旋轉蒸發後，冷凍乾燥得到 EGCG廣品。(4)檢測方法同實施例1實施例3(1) SMB設備同實施例1。(2) SMB工作條件第一次SMB工作條件如下SMB運行模式設置SMB系統色譜柱數目總數N = 6，設置SMB洗脫帶1根色譜柱， 精製帶3根色譜柱，吸附帶2根色譜柱，運行模式為1-3-2 ；流動相組成精製帶和吸附帶的流動相D為乙醇與水的混合溶液，乙醇的體積百分含量Cd為15% ；洗脫帶的流動相P為乙醇；流動相流速在洗脫帶中，洗脫液P流速Up為5. lcm/min,萃取液E流速Ue =仏； 在精製帶和吸附帶中，洗脫液D流速Ud為2. 9cm/min,進樣液F流速Uf為0. 25cm/min,萃餘液 R 流速 Ue = UD+UFO切換時間為6min。模擬移動床操作溫度10-15°C。
第二次SMB工作條件如下SMB運行模式設置SMB系統色譜柱數目總數N = 7，設置SMB洗脫帶1根色譜柱， 精製帶3根色譜柱，吸附帶3根色譜柱，運行模式為1-3-3 ；流動相組成精製帶和吸附帶的流動相D為乙醇與水的混合溶液，乙醇的體積百分含量Cd為15% ；洗脫帶的流動相P為乙醇；流動相流速在洗脫帶中，洗脫液P流速Up為5. lcm/min,萃取液E流速Ue =仏； 在精製帶和吸附帶中，洗脫液D流速Ud為2. Ocm/min，進樣液F流速Uf為1. lcm/min，萃餘液 R 流速 Ue = UD+UFO切換時間為5min。模擬移動床操作溫度10-15°C。(3)分離步驟使用如(1)所述SMB設備在如(2)所述的條件下，進行兩次SMB分離。第一次SMB 分離是從萃取液E除去難洗脫雜質，取5克茶多酚原料(EGCG純度65. 8 % )，用乙醇體積百分含量為15 %的水溶液溶解，0. 45 μ m濾膜過濾，配置濃度為5g/100mL的溶液，作為第一次 SMB分離進樣液F，EGCG*觀.9mg/mL，用流動相P將難洗脫雜質於萃取液E中除去，由流動相D獲得含易洗脫雜質和EGCG的萃餘液R，EGCG的純度為94. 4%，收率97. 5%，將該萃餘液旋轉蒸發濃縮，EGCG為11. :3mg/mL，用作第二次SMB分離的進樣液F。第二次SMB分離是除去易洗脫雜質，用流動相D將易洗脫雜質於萃餘液R中除去，由流動相P獲得EGCG的萃取液E，EGCG的純度為98. 9%，收率97. 4%。EGCG的萃取液經旋轉蒸發後，冷凍乾燥得到 EGCG廣品。(4)檢測方法同實施例1。
權利要求
1.一種提純表沒食子兒茶素沒食子酸酯(簡稱EGCG，以下稱EGCG)的方法，其特徵在於以茶葉提取物茶多酚為原料，採用模擬移動床(簡稱SMB，以下稱SMB)色譜分離提純 EGCG，該方法的技術方案如下(1)SMB設備SMB設備組成為色譜柱、洗脫液輸送泵、進料液輸送泵、自控閥、單片機、自動控制系統、 多通、管線、接頭、儲液罐、計算機；色譜柱規格為柱長10 50cm，柱長與直徑比為8 20 ；固定相使用十八烷基矽烷鍵合矽膠0DS，10 60 μ m ；自控閥由電磁閥和止逆閥組成；(2)SMB工作條件SMB運行模式設置SMB系統色譜柱數目總數N，3 < N < 8，設置SMB的基本區帶為洗脫帶，精製帶和吸附帶，每個帶由1 4根相同的色譜柱串聯而成，a為洗脫帶色譜柱數目， b為精製帶色譜柱數目，c為吸附帶色譜柱數目，a+b+c = N,運行模式表示為a-b-c ；流動相組成精製帶和吸附帶的流動相D為醇與水混合的均相溶液，醇的體積百分含量Q3為10 40% ；洗脫帶的流動相P為醇與水混合的均相溶液，醇的體積百分含量Cp為 Cd 100% ；流動相流速在洗脫帶中，洗脫液P流速仏為1 20cm/min，萃取液E流速Ue = Up ；在精製帶和吸附帶中，洗脫液D流速Ud為1 15cm/min，進樣液F流速叫為0. 1 6cm/min， 萃餘液 R 流速 Ue = UD+UF ；Ud ^ Up ^ 3Ud ；Uf < 2UD ；模擬移動床操作溫度室溫；(3)分離步驟使用如(1)所述SMB設備在如(2)所述的條件下，進行兩次SMB分離一次是從萃取液 E除去難洗脫雜質，切換時間ts 5 30min ；另一次從萃餘液R除去易洗脫雜質，切換時間 ts 3 25min ；茶多酚用醇體積百分含量為0 100%的水溶液溶解，配置濃度為10 lOOmg/mL的均相原料液，作為第一次SMB分離的進樣液F ；第一次SMB分離得到的萃餘液R或者經過濃縮後、或者直接作為第二次SMB分離的進樣液F ；將除去雜質的EGCG溶液經脫除溶劑處理後，得到EGCG產品；(4)檢測方法採用島津LC-10AT色譜泵，SPD-10A紫外檢測器，Agilent Extend色譜柱，4. 6 X 150mm, ODS填料，粒徑5 μ m,流動相為乙腈和水，體積比為15 85，冰醋酸體積百分含量0. 1 %，流速1. OmL/min，檢測波長278nm，由EGCG標準品來標定產品中EGCG的含量。
2.根據權利要求1所述的SMB色譜分離提純EGCG的方法，其特徵在於流動相中的醇為甲醇、乙醇。
3.根據權利要求1和要求2所述的SMB色譜分離提純EGCG的方法，其特徵在於固定相0DS，20 30 μ m ；精製帶和吸附帶的流動相D採用甲醇水溶液，其中甲醇體積百分含量 Cd 為 25 ；35%。
4.根據權利要求1和要求2所述的SMB色譜分離提純EGCG的方法，其特徵在於固定相0DS，20 30 μ m ；精製帶和吸附帶的流動相D採用乙醇水溶液，其中乙醇體積百分含量Cd 為 10 20%。
5.根據權利要求1所述的SMB色譜分離提純EGCG的方法，其特徵在於由SMB分離得到的EGCG溶液脫除溶劑的過程為或者冷凍乾燥、或者重結晶、或者真空乾燥、或者減壓膜蒸餾。
全文摘要
本發明公開了一種模擬移動床(SMB)色譜分離提純表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)的方法，其特徵在於以茶葉提取物茶多酚為原料，採用模擬移動床色譜系統分離提純EGCG，該方法設置SMB的基本區帶為洗脫帶、精製帶和吸附帶，洗脫帶獨立，以十八烷基矽烷鍵合矽膠ODS為固定相，醇與水的混合溶液為流動相，對茶多酚原料液進行兩次SMB分離一次是除去難洗脫雜質；另一次是除去易洗脫雜質。最後經除脫除溶劑處理後，得到EGCG產品。本發明能規模化、穩健、連續、自動高效地從茶多酚中提純EGCG，產品回收率超過94％，純度超過96％，固定相和流動相能反覆利用，降低成本，屬於綠色環保分離工程。
文檔編號C07D311/62GK102276570SQ20111017148
公開日2011年12月14日 申請日期2011年6月23日 優先權日2011年6月23日
發明者叢景香, 吳秀紅, 唐曉丹, 楊磊, 王紹豔, 鄭斯文, 韓冰 申請人:遼寧科技大學