用於生物pcr微通道螢光檢測的標準晶片及其製備方法
2023-10-17 01:25:59 1
專利名稱：用於生物pcr微通道螢光檢測的標準晶片及其製備方法
技術領域：
本發明涉及一種生化微全分析系統晶片PCR(聚合酶鏈式反應)螢光微通道光譜檢測系統的計量比對器件，主要用於微通道螢光光譜檢測裝置的校準，屬於生物學及醫學檢測領域。
背景技術：
隨著上世紀90年代初微全分析系統(Miniaturized Total AnalysisSystems，μ-TAS)概念被首次提出，近幾年來，在微全分析系統概念基礎上的各類生物分析和化學分析晶片(包括微流控生物PCR晶片)的研究迅猛發展，微全分析系統技術已成為創新式分析測試儀器及技術的最重要的研究發展方向，深受世界各國的關注。
所謂的微全分析系統(μ-TAS)是在微型化的基礎上實現全部分析過程的功能集成化和結構縮微化的分析實驗室系統。通俗地講，它把整個實驗室的功能，即生物化學分析的許多過程與步驟，包括採樣、稀釋、加試劑、反應、分離、檢測等集成到儘可能小的操作平臺上，目前這種縮微化操作平臺為100平方毫米左右的晶片(結構縮微的尺寸正在向幾十平方毫米發展)。μ-TAS具有檢測速度快、試樣用量少、通量高等顯著的特點，廣泛用於各類生物化學分析晶片的研究。在μ-TAS中，晶片體積非常小，其進樣量僅為微升級，檢測池體積非常小，而且分析檢測多在秒級內完成，故對其檢測體系的靈敏度和響應速度要求很高。檢測方法是決定μ-TAS最終檢出限的關鍵因素，是μ-TAS的核心技術之一。在近幾年發展起來的μ-TAS檢測方法中，螢光光譜檢測方法由於其選擇性好、痕量定性定量分析靈敏度高和非破壞性檢測等特點，已逐漸成為μ-TAS研究領域中使用最廣泛的檢測技術。
生物化學分析晶片的生物PCR螢光光譜檢測方法，實際是對晶片上的微通道中螢光物質進行光譜檢測。與化學分析領域中的螢光光譜檢測技術有一些不同首先，被檢測對象的量微小並且信號發出點小，從而造成的被檢測螢光光譜信號微弱，需使用高檢測靈敏度的微通道螢光光譜檢測裝置；其次，目前還沒有一種像化學分析領域中的標準物質，可用於校準生物PCR螢光微通道光譜檢測裝置。
發明內容
本發明中提供了一種生物PCR螢光微通道比對檢測標準晶片的製備方法及其裝置，本晶片可用於校準生物PCR螢光微通道光譜檢測裝置。
為了達到上述目的，本實用新型採取了取下技術方案。一種用於生物PCR微通道螢光檢測的標準晶片，該晶片主要包括有上片有機玻璃3、下片有機玻璃4，其中，在下片有機玻璃上4設置有N個獨立的模擬微通道2，在上片有機玻璃上3對應模擬微通道兩端分別設置有微孔1並密封該孔，上片有機玻璃3和下片有機玻璃4採用熱壓鍵合的方法永久密封；在N個模擬微通道內依次注有螢光強度遞增的螢光物質，所選的螢光強度能夠反應出該種生物PCR螢光試劑的特異基因的拷貝數擴增曲線的變化趨勢。
所述的N的取值範圍為4～40。
所述的上片有機玻璃3、下片有機玻璃4的厚度均為1mm。
上面所述的一種用於生物PCR微通道螢光檢測的標準晶片的製備方法，該方法是按以下步驟進行的1)選大小相同的上下兩片有機玻璃，在準分子雷射微加工系統上用直寫微加工方法、採用與製備生物PCR分析晶片中的微通道相同的製作工藝，在下片有機玻璃上4加工N個獨立的模擬微通道2，模擬微通道2的寬度、深度、表面粗糙度與生物PCR分析晶片中的微通道相同；2)在上片有機玻璃3上、與下片有機玻璃4上的每一條模擬微通道2兩端相對應的位置都加工有微孔1，微孔1與模擬微通道2的兩端相連通，再採用熱壓鍵合方式將兩片有機玻璃鍵合為一體；
3)在生物PCR螢光試劑的特異基因的拷貝數擴增曲線上的螢光信號低平臺區、螢光信號抬升域值(CT值)、螢光信號上升區、螢光信號高平臺區分別選取代表PCR擴增過程中的不同螢光強度的點，所選的N個點能夠反映出該曲線變化趨勢；4)使用成熟商品化的實時螢光定量PCR檢測儀，在塑料反應管中對一種生物PCR螢光反應物進行PCR擴增的過程中，當PCR擴增溫度循環次數進行到所選定的第一個點對應的循環次數時，將其中一個塑料反應管中的生物PCR螢光反應物從該使用成熟商品化的實時螢光定量PCR檢測儀中取出，通過微孔1注入到下片有機玻璃4的第一個模擬微通道2中，然後封閉該模擬微通道2兩端的微孔1；5)依照上述方法，再依次製備如上所選點對應的PCR螢光反應物，並依次注入到相應的模擬微通道2中，並密封其兩端的微孔1。
本發明的設計原理為微通道流量控制工作方式的生物PCR螢光分析晶片的微通道是分析晶片中被分析物的微載體容器。在本發明中，製作模擬微通道採用與製備生物PCR螢光分析晶片中的微通道相同的製作工藝，並且模擬微通道的各類參數(如微通道的寬度、深度和表面粗糙度等)與生物PCR螢光分析晶片中微通道的參數一樣。因此，在對生物PCR螢光光譜檢測裝置進行校準時，可保持一致性。本發明中的N個模擬微通道中依次注入不同螢光強度的同種反應物，所選的螢光強度是按如下方法確定的。就是在生物PCR反應時，特異基因的貝數與特異基因拷貝數一起擴增時的螢光強度是按一定規律增加的。PCR螢光定量檢測裝置就是通過對與特異基因拷貝數一起擴增的螢光強度的檢測，來對特異基因的貝數進行定量檢測的。生物PCR特異基因的拷貝數擴增曲線的規律如圖3所示，一般縱坐標為與特異基因擴增拷貝數一致的螢光強度，橫坐標為生物PCR技術中生物PCR擴增溫度循環次數。在生物PCR特異基因的拷貝數擴增曲線中，一般分為螢光信號低平臺區，螢光信號抬升域值(CT值)，螢光信號上升區，螢光信號高平臺區，在這四個「區域」中，選取能夠反映該曲線變化趨勢的N個點。將這N個點對應的不同螢光強度的同種反應物依次分別注入到N個模擬微通道中，於是這N個模擬微通道中的PCR螢光反應物能夠反映出該種螢光PCR擴增的生物螢光變化曲線的走向。以此來校準PVR螢光光譜檢測裝置。
使用本發明對PCR微通道螢光光譜檢測裝置的校準方法如下使用PCR微通道螢光光譜檢測裝置對本發明中的校準晶片的某一微通道進行檢測，再將檢測結果與該通道中的螢光強度進行比對，如果這兩組比對螢光強度值出現不相同，我們就以校準晶片中的表示的螢光強度為準，對PCR微通道螢光光譜檢測裝置進行校準。本裝置只能校準其微通道內的螢光反應物與本裝置內的模擬微通道內的反應物相同的PCR微通道螢光光譜檢測裝置。
經實驗驗證，本發明在晶片使用和微型集成化研究中，解決了PCR螢光光譜檢測裝置的工作校準的問題。
圖1具有六個獨立的模擬微通道的本發明的結構2本發明的截面3生物PCR特異基因的拷貝數擴增曲線圖中1、微孔，2、模擬微通道，3、上片有機玻璃，4、下片有機玻璃。
具體實施例方式
下面結合圖1～圖3說明本發明的實施例。該晶片主要包括有上片PMMA有機玻璃3、下片PMMA有機玻璃4，上片有機玻璃3、下片有機玻璃4的厚度均為1mm。其中，在下片有機玻璃上4設置有六個獨立的模擬微通道2，在上片有機玻璃3上對應模擬微通道兩端分別加工有微孔1並密封該微孔1，上片有機玻璃3和下片有機玻璃4採用熱壓鍵合的方法永久密封；在六個模擬微通道2內依次注有螢光強度遞增的螢光物質，所選的螢光強度能夠反應出該種生物PCR螢光試劑的特異基因的拷貝數擴增曲線的變化趨勢。
上面所述晶片的製備方法，其特徵在於，該方法是按以下步驟進行的
1)選大小相同的上下兩片有機玻璃，在準分子雷射微加工系統上用直寫微加工方法、採用與製備生物PCR分析晶片中的微通道相同的製作工藝，在下片有機玻璃上4加工N個獨立的模擬微通道2，模擬微通道2的寬度、深度、表面粗糙度與生物PCR分析晶片中的微通道相同。
2)在上片有機玻璃上、與下片有機玻璃上的每一條模擬微通道2兩端相對應的位置都加工有微孔1，微孔1與模擬微通道2的兩端相連通，再採用熱壓鍵合方式將兩片有機玻璃鍵合為一體。
3)在生物PCR螢光試劑的特異基因的拷貝數擴增曲線上的螢光信號低平臺區選取2個點，選取螢光信號抬升域值(CT值)為一個點，在螢光信號上升區選取2個點，在螢光信號高平臺區選取1個點，所選取的6個點能夠反映出該曲線變化趨勢的。
4)使用成熟商品化的實時螢光定量PCR檢測儀，在塑料反應管中對一種生物PCR螢光反應物進行PCR擴增的過程中，當PCR擴增溫度循環次數進行到所選定的第一個點對應的循環次數時，將其中一個塑料反應管中的生物PCR螢光反應物從該使用成熟商品化的實時螢光定量PCR檢測儀中取出，通過微孔1注入到下片有機玻璃的第一個模擬微通道2中，然後封閉該模擬微通道2兩端的微孔1。
5)依照上述方法，再依次製備如上所選點對應的PCR螢光反應物，並依次注入到相應的模擬微通道中，並密封其兩端的微孔1。
權利要求
1.一種用於生物PCR微通道螢光檢測的標準晶片，其特徵在於該晶片主要包括有上片有機玻璃(3)、下片有機玻璃(4)，其中，在下片有機玻璃上4設置有N個獨立的模擬微通道(2)，在上片有機玻璃(3)上對應模擬微通道兩端分別設置有微孔(1)並密封該孔，上片有機玻璃(3)和下片有機玻璃(4)採用熱壓鍵合的方法永久密封；在N個模擬微通道內依次注有螢光強度遞增的螢光物質，所選的螢光強度能夠反應出該種生物PCR螢光試劑的特異基因的拷貝數擴增曲線的變化趨勢。
2.根據權利要求1所述的用於生物PCR螢光微通道光譜檢測裝置比對標準的微通道晶片，其特徵在於所述的N的取值範圍為4～40。
3.根據權利要求1所述的用於生物PCR螢光微通道光譜檢測裝置比對標準的微通道晶片，其特徵在於所述的上片有機玻璃(3)、下片有機玻璃(4)的厚度均為1mm。
4.權利要求1中所述的一種用於生物PCR微通道螢光檢測的標準晶片的製備方法，其特徵在於，該方法是按以下步驟進行的1)選大小相同的上下兩片有機玻璃，在準分子雷射微加工系統上用直寫微加工方法、採用與製備生物PCR分析晶片中的微通道相同的製作工藝，在下片有機玻璃上(4)加工N個獨立的模擬微通道(2)，模擬微通道(2)的寬度、深度、表面粗糙度與生物PCR分析晶片中的微通道相同；2)在上片有機玻璃(3)上、與下片有機玻璃(4)上的每一條模擬微通道(2)兩端相對應的位置都加工有微孔(1)，微孔(1)與模擬微通道(2)的兩端相連通，再採用熱壓鍵合方式將兩片有機玻璃鍵合為一體；3)在生物PCR螢光試劑的特異基因的拷貝數擴增曲線上的螢光信號低平臺區、螢光信號抬升域值(CT值)、螢光信號上升區、螢光信號高平臺區分別選取代表PCR擴增過程中的不同螢光強度的點，所選的N個點能夠反映出該曲線變化趨勢4)使用成熟商品化的實時螢光定量PCR檢測儀，在塑料反應管中對一種生物PCR螢光反應物進行PCR擴增的過程中，當PCR擴增溫度循環次數進行到所選定的第一個點對應的循環次數時，將其中一個塑料反應管中的生物PCR螢光反應物從該使用成熟商品化的實時螢光定量PCR檢測儀中取出，通過微孔(1)注入到下片有機玻璃(4)的第一個模擬微通道(2)中，然後封閉該模擬微通道(2)兩端的微孔(1)；5)依照上述方法，再依次製備如上所選點對應的PCR螢光反應物，並依次注入到相應的模擬微通道(2)中，並密封其兩端的微孔(1)。
全文摘要
本發明涉及一種用於生物PCR微通道螢光檢測的標準晶片及其製備方法，屬於生物學及醫學檢測領域。本晶片主要包括有上片有機玻璃(3)、下片有機玻璃(4)。在下片有機玻璃上4設置有N個獨立的模擬微通道(2)，在上片有機玻璃3上對應模擬微通道兩端分別設置有微孔(1)並密封該孔，上片有機玻璃(3)和下片有機玻璃(4)採用熱壓鍵合的方法永久密封；在N個模擬微通道內依次注有螢光強度遞增的螢光物質，所選的螢光強度能夠反應出該種生物PCR螢光試劑的特異基因的拷貝數擴增曲線的變化趨勢。本發明在晶片使用和微型集成化研究中，解決了PCR螢光光譜檢測裝置的工作校準的問題。
文檔編號G01N21/64GK1900715SQ200610088818
公開日2007年1月24日 申請日期2006年7月19日 優先權日2006年7月19日
發明者吳堅, 古冬冬 申請人:北京工業大學